Epidémiologie de l’allergie alimentaire

Montage de fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing

Les souris sont maintenues à jeun depuis la veille au soir. Elles sont anesthésiées avec du Pentothal à 50 mg/kg-1. Après laparotomie, le segment jéjunal entier est prélevé délicatement de la cavité abdominale, vidé de son contenu par deux ou trois rinçages au Ringer froid (tableau 12). Après l’avoir délicatement débarrassé des mésentères, le segment jéjunal est ensuite incisé longitudinalement le long du bord anti-mésentérique puis découpé en fragments (10-20 cm) qui sont maintenus dans du Ringer froid et oxygénés par un courant de carbogène. A chaque fois, un fragment est monté entre deux chambres de Lucite. Le volume de Ringer déposé dans chaque compartiment de la chambre est de 5 ml, le système est maintenu à 37°C. Les tissus sont «court-circuités» par un dispositif de tension automatique (modèle VCC MC8, Physiologic Instruments, San Diego, CA) et le courant de court-circuit (Isc, mA/cm2) est surveillé pendant un intervalle de temps, considéré comme un indicateur du transport net d’ions actif. Après montage du tissu environ 10 minutes sont nécessaires pour stabiliser les paramètres électrophysiologiques de base. Au terme de cette période, on dépose 60μg/ml de la -Lg ou dans certains cas d’ovalbumine (OVA) comme contrôle antigénique non spécifique dans le compartiment séreux de la chambre. A la fin des expériences, la viabilité des tissus est évaluée par l’addition de 10 mM de glucose du côté muqueux.

Etudes physico-chimiques de la gelée royale

Avant tout, il est important de rappeler que la gelée royale utilisée dans le cadre de ce travail est fraîche et n’a subi aucun traitement préalable. De nombreux facteurs, notamment la race de l’abeille, la saison, les conditions de stockage, les conditions régionales et le type de la flore pollinifère sont susceptibles d’affecter la composition de la gelée royale (Shibi et al., 1993; Chen et Chen, 1995; Wongchai et Ratanavalachai, 2002; Jianke et al., 2003; Ramadan et Al-Ghamdi, 2012; Lian-Fei, 2016). Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié quelques paramètres physicochimiques de la gelée royale issue de deux régions (Blida et Boumerdès) par mesure de l’acidité libre, du pH, de la cendre et de la teneur en eau ainsi que le taux des lipides, des sucres, des polyphénoles et des protéines. Nos résultats montrent que la gelée royale récoltée dans les deux régions est acide et enregistre un pH voisin de 3.

Cette acidité est due à la présence des acides organiques tels que l’acide pantothénique (vitamine B5) et l’acide 10-hydroxy-2-décénoique (10-2HDA) contenus dans la gelée royale. Ces résultats vont dans le sens des travaux de Metry et Owayss (2009), Sabatini et al. (2009), Mărghitaş et al. (2010), Ramadan et Al-Ghamdi (2012), Nabas et al. (2014), Stratev et al. (2015) et Mureşan et al. (2016). De plus, et selon les travaux de Wongchai (2002), le pH de la gelée royale de Thaïlande reste constant durant une année de conservation. L’eau est l’un des composants majeurs de la gelée royale. La constante relative de l’humidité est due à la rapidité de la synthèse de la gelée royale et de sa distribution aux larves (Ramadan et Al-Ghamdi, 2012). Bien que nos résultats montrent que la gelée royale de Boumerdès est plus riche en eau que celle de Blida, ils demeurent en accord avec ceux cités dans la littérature (Popescu et al., 2008b; Sabatini et al., 2009; Ramadan et Al-Ghamdi, 2012; Balkanska et al., 2014; Nabas et al., 2014; Ait Soura et Mecellem, 2017).

Le taux d’humidité de la gelée royale répond aux exigences fixées par la législation brésilienne (60 et 70%) (Commission brésilienne, 2000). L’humidité de la gelée royale dépend de la saison de récolte. Elle augmente dans la saison pluvieuse et diminue dans la saison chaude (Wongchai, 2002). Bien que Ferioli et al. (2007) suggèrent que la teneur en eau diffère selon l’origine de la gelée royale, aucune différence significative dans teneurs en eau n’a été enregistrée entre les échantillons italiens et ceux des pays non européens. La littérature citée rapporte que les minéraux présents dans la gelée royale représentent environ 0,8 à 3% de celle-ci (Sabatini et al., 2009). Les éléments majoritairement retrouvés sont par ordre décroissant le potassium, le calcium, le sodium, le magnésium, le zinc, le fer, le cuivre, et le manganèse. La détermination des cendres offre la possibilité de connaître la teneur en matière minérale globale de la gelée royale. Garcia-Amoedo et Almeida-Muradian (2007) montrent que l’origine n’a pas d’impact sur la quantité totale de minéraux dans la gelée royale.

Nos résultats montrent que les taux des constituants minéraux de nos échantillons sont en concordance avec ceux de Messia et al. (2003), Popescu et al. (2008a), Sabatini et al. (2009) et Yang et al. (2017). La teneur en glucides totaux de nos échantillons varie de 8,88 à 8,90 %. Ces valeurs sont en accord avec ceux trouvés par la littérature (Sabatini et al., 2009; Wytrychowski et al., 2013). En revanche, la teneur en glucides de nos échantillons est inférieure à celle de la Roumanie rapportée par Mărgăoan et al. (2017). Les lipides de la gelée royale sont présents à des concentrations assez modestes et variables (3 à 8%), et représentent sans doute un des plus importants composants de la gelée royale (Tamura et al., 2009; Sabatini et al., 2009). L’acide 10-hydroxy-trans-2-décénoique (10H2DA) représente l’acide gras le plus important de la gelée royale en raison des propriétés biologiques, notamment antibactériennes, antifongiques et anti-tumorales, qui lui sont attribuées (Barker et al., 1959; Bărnuţiu et al., 2011). Nos résultats montrent une teneur en lipides qui varie entre 3,64 et 3,74% avec une différence significative (p<0,05) entre la gelée royale de Blida et celle de Boumerdès. Ces valeurs sont en accord avec celles citées dans la littérature (Viuda-Martos et al., 2008; Sabatini et al., 2009; Ramadan et Al-Ghamdi, 2012; Balkanska et al., 2014; Kolayli et al., 2016), mais semblent être inférieures à celles de la Roumanie rapportées par Mărghitaş et al. (2010). Les variations saisonnières peuvent également affecter la composition chimique de la gelée royale en lipides. En effet, la teneur en lipides augmente dans la saison chaude et diminue dans la saison pluvieuse (Wongchai, 2002).

Etude des propriétés immunomodulatrices de la gelée royale

Dans notre travail, nous avons choisi la souris femelle de souche Balb/c, comme modèle d’allergie aux protéines du lait de vache, car elle est caractérisée par un complexe majeur d’histocompatibilité relativement proche de celui de l’Homme et par une balance Th1/Th2 plus nette et plus facile à mettre en évidence que chez l’Homme (Magnan et Vervlo et, 1997). Ce modèle animal a été développé et validé par l’équipe d’Adel-Patient et al. (2005). Cette étude a montré que la sensibilisation par voie intrapéritonéale et orale des souris Balb/c induit l’activation de la voie Th2 en produisant des quantités d’IgE et des IgG1 spécifiques ainsi que la production d’interleukines (IL4 et IL5) spécifiques à ce type de réponse immune (Th2). Pour la sensibilisation des souris à la -Lg, nous avons choisi la voie intrapéritonéale en présence d’hydroxyde d’aluminium, car elle est facile d’utilisation et permet d’introduire l’antigène directement au niveau systémique. Elle est efficace, optimise les réponses immunitaires et entraîne une production importante des IgE spécifiques (Dearman, 2003; Chen et al., 2013). degré de sensibilisation des souris à la -Lg a été évalué par une méthode immunoenzymatique (ELISA).

Nos résultats montrent que l’immunisation intrapéritonéale à la β-Lg conduit à une production importante d’IgE totales, IgG et d’IgE anti-β-Lg, l’ensemble de ces résultats plus la présence d’un test cutané positif confirment le pouvoir fortement immunogène de cette protéine. Ces résultats concordent avec ceux obtenus par Frossard et al. (2004a) qui ont observé chez des souris immunisées à la -Lg, une forte augmentation des titres en anticorps sériques IgG1 et IgE anti -Lg ainsi qu’une augmentation dans la production d’IL4, traduisant une réponse immunitaire de prédominance Th2. Nos résultats sont également en accord avec ceux trouvés par Negaoui et al. (2009) et Grar et al. (2015) qui ont montré que l’immunisation des souris Balb/c avec les protéines du lait vache induit une augmentation significative des titres sérique en anticorps IgG et IgE anti -Lg.

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Table des matières

Introduction
Rappels bibliographiques
1.Histoire naturelle de l’allergie alimentaire
2.Epidémiologie de l’allergie alimentaire
3.La tolérance orale
3.1. Prise d’antigène, diffusion et présentation de l’antigéne
3.2. Rôle des cellules dendritiques.
3.3. Rôle des cellules T Régulatrices (Treg)
3.4. Sensibilisation allergique: rupture de la tolérance orale
4.Physiopathologie d’allergie aux protéines du lait de vache (APLV)
4.1. Les formes immunologiques impliquent dans l’allergie aux protéines de lait de vache
4.1.1. Les réactions de Type I (immédiate, à médiation IgE).
4.1.2. Les réactions de Type IV (retardée, à médiation cellulaire)
4.2. Les facteurs pouvant influencer l’expression des manifestations allergiques
4.2.1. Facteurs épigénétiques
4.2.2. Vitamine D
5.Traitement d’allergie alimentaire
5.1. Régime d’éviction
5.2. Les formules hypoallergéniques
5.3. Les traitements médicamenteux
5.4. Immunothérapie spécifique
5.5. Autre thérapie
6.L’apiculture en Algérie
7.La gelée royale
7.1. Origine
7.2. Compositions chimiques
7.2.1. Propriétés organoleptiques
7.2.2. Teneur en eau
7.2.3. Glucides
7.2.4. Protéines et acides aminés
7.2.5. Lipides
7.2.6. Acides totaux
7.2.7. Minéraux
7.2.8. Vitamines
7.2.9. La cendre
7.2.10. Pigments
7.2.11. Enzymes
7.2.12. Autres
8.Utilisation
9.Conservation de la gelée royale
10.La production mondiale de la gelée royale
11.Propriétés générales de la gelée royale
11.1. Activité antioxydante et anti-inflammatoire
11.2. Activité antitumorale
11.3. Effet immunomodulateur et antiallergique de la gelée royale
Matériels et Méthodes
1.Produits chimiques, réactifs et matériel utilisés
2.La gelée royale
3.Etudes physico-chimiques de la gelée royale.
3.1. Détermination du pH
3.2. Teneur en eau
3.3. Détermination de la teneur en matière minérale totale (ou cendres brutes)
3.4. Détermination de l’acidité
3.5. Dosage des protéines
3.5.1. Détermination de la teneur en azote total (Méthode de Kjeldahl)
3.5.2. Dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry et al. 1951
3.6. L’extraction des protéines brutes de la gelée royale
3.6.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
3.7. Le dosage des glucides par la méthode de Bertrand
3.8. Teneur en matière grasse
3.9. Dosage des polyphénols totaux (réactif de Folin Ciocalteu)
4.Etude des propriétés immunomodulatrices de la gelée royale.
4.1. Animaux et condition d’élevage
4.2. Adjuvant
4.3. Répartition des animaux
4.4. Protocole d’immunisation
4.5. Prélèvement sanguin
4.6. Dosage des anticorps IgE totaux
4.6.1. Principe général de la méthode ELISA sandwich
4.6.2. Mode opératoire
4.7. Dosage des anticorps IgG et IgE spécifique anti β-Lg
4.7.1. Principe général de la méthode ELISA indirecte
4.7.2. Mode opératoire
4.8. Détermination des taux d’histamine plasmatiques
4.9. Tests de provocation
4.9.1. Signes cliniques: test de provocation in vivo
4.9.2. La perméabilité vasculaire
4.9.3. Test cutané de réaction d’hypersensibilité de type I
4.9.4. Mesure de la température corporelle
4.9.5. Expérimentation sur l’intestin isolé en Chambre de Ussing: test de provocation ex vivo
4.9.5.1. Principe de la chambre de Ussing
4.9.5.2. Montage de fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing
4.10. Etude histologique
4.10.1. Traitement des échantillons
4.10.1.1. Fixation
4.10.1.2. Déshydratation
4.10.1.3. Clarification
4.10.1.4. Inclusion
4.10.2. Traitement des lames
4.10.2.1. Etalement sur lames
4.10.2.2. Déparaffinage
4.10.2.3. Réhydratation
4.10.2.4. Coloration
4.11. Mesure de la hauteur des villosités
4.11.1. Principe
4.12. Comptage des mastocytes
4.12.1. Mode opératoire
4.12.2. Expression des résultats
4.13. Analyse statistique
Résultats
1.Etudes physico-chimiques de la gelée royale
1.1. Le pH
1.2. L’acidité libre
1.3. Teneur de l’eau
1.4. La cendre
1.5. Teneur totale en protéines dans la gelée royale.
1.5.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
1.6. Teneur en glucides totaux
1.7. Teneur en lipides
1.8. Teneurs en polyphénols totaux de la gelée royale
2.Etude des propriétés immunomodulatrices de la gelée royale
2.1. Mesure des titres d’IgE totale, IgG et IgE spécifique anti β-Lg: Efficacité de la gelée royale
2.1.1. Effet de la gelée royale sur le taux en IgE totale
2.1.2. Effet de la gelée royale sur le taux en IgG sérique anti b-Lg
2.1.3. Effet de la gelée royale sur le taux en IgE sérique anti b-Lg
2.3. Test de provocation in vitro: Evaluation des signes cliniques.
2.4. La perméabilité vasculaire
2.5. Température corporelle
2.6. Test cutané de réaction d’hypersensibilité de type I
2.7. Etude ex vivo en chambre de Ussing: test de provocation locale
2.7.1. Mesure de la réaction anaphylactique locale (l’Isc)
2.7.1.1. Effet de la sensibilisation à la β-Lg: Témoins positifs
2.7.1.2. Effet de l’ovalbumine sur l’Isc: spécificité de la réponse anaphylactique à la β-lg.
2.7.1.3. Effet du furosémide
2.7.1.4. Effet du glucose
2.7.1.5. Effet de la β-lg sur l’Isc des fragments jéjunaux de souris traitées
2.7.2. Mesure de la conductance
2.7.2.1. Effet de la sensibilisation à la β-Lg: Témoin positif
2.7.2.2. Effet de la β-lg sur la conductance des fragments jéjunaux de souris traitées
2.7.3. Effet sur la DDP
2.8. Etude histologique
2.8.1. Histologie de la muqueuse intestinale des souris témoins négatifs
2.8.2. Histologie de la muqueuse intestinale des souris témoins positifs
2.8.3. Effet de la gelée royale sur la structure histologique de l’épithélium intestinal
2.8.4. Mesure la hauteur villositaire.
2.8. Comptage des mastocytes
Discutions
Conclusion
Références bibliographiques