Environnement des bactéries et sensibilité aux biocides

L’hygiène des matériaux demeure une préoccupation constante des industriels de l’agroalimentaire (IAA) ainsi que des responsables du secteur hospitalier ou du personnel médical. En effet, la contamination microbiologique de la surface des équipements des ateliers des IAA peut entraîner une altération de l’aliment en contact générant ainsi d’importants problèmes économiques couplés à d’éventuels problèmes de santé publique (Hood et Zottola, 1995). Dans le domaine hospitalier, c’est la contamination des dispositifs médicaux par des bactéries pathogènes (Man et al., 1998) qui peut être à l’origine d’infections nosocomiales plus ou moins sévères (Darouiche, 2001 ; Donlan et Costerton, 2002).

Actuellement et quel que soit le secteur impliqué, pour assurer un statut hygiénique aux matériaux en contact, des traitements de désinfection sont régulièrement réalisés. Outre l’utilisation de procédés physiques (UV, traitement thermique…), on peut, dans le cas d’appareils thermosensibles par exemple, utiliser des agents chimiques. L’efficacité de ces agents reste toutefois variable d’une application à une autre. En effet, si près de 100% des cellules se trouvant à l’état planctonique peuvent être éliminées, ce rendement est moindre sur des cellules adhérentes ou en biofilms.

Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer cette différence de sensibilité des bactéries vis-à-vis de désinfectants. Tout d’abord, les tests utilisés pour évaluer l’activité antimicrobienne des agents désinfectants restent aujourd’hui basées sur l’utilisation de cellules microbiennes en suspension ou déposées et séchées, conditions en fait très éloignés de celles généralement rencontrées in vivo i.e. cellules adhérentes ayant ou non intégré une matrice microbienne et synthétisé des polymères exocellulaires. Cette variation de réponse aux biocides peut également être liée à des modifications physico-chimiques de la surface des cellules microbiennes (Briandet, 1999), modifications pouvant être dues à un changement dans leur physiologie (production de composés extra-cellulaires, morphologie, expression génétique…) ou encore à leur histoire i.e. conditions de conservation et de mise en culture (Briandet, 1999). Par ailleurs, les souches de collection recommandées dans les normes de désinfection ne présentent généralement pas de tolérance particulière aux désinfectants et ne reflètent donc pas les problèmes de résistance retrouvés sur le terrain.

LA DESINFECTION 

« La désinfection est une opération au résultat momentané, permettant d’éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d’inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes, en fonction des objectifs fixés » (Anonyme, 1998). Les traitements de désinfection visent donc à assurer l’hygiène des matériaux afin de limiter voir empêcher tout risque de contamination microbienne. Cette destruction des germes indésirables portés par des matériaux inertes peut se faire soit par des procédés physiques (chaleur, ultra-sons, irradiation) ou chimiques (désinfectants) soit par une combinaison des deux (Russell, 1991). On peut néanmoins noter que pour des appareils thermosensibles tels que les endoscopes dans le secteur médical ou encore certaines lignes de production en industrie alimentaire, seuls des traitements chimiques peuvent être appliqués, justifiant la place prépondérante des agents antimicrobiens dans nombre d’opérations de stérilisation ou de pré-désinfection de supports inertes.

MODES D’ACTION DES DESINFECTANTS

NOTION DE DESINFECTANT ET D’ANTISEPTIQUE

Sous le terme d’agent antibactérien sont regroupées différentes molécules d’origine biologique, hémisynthétique ou de synthèse. Leur utilisation pour la thérapie des infections bactériennes (antibiotiques) ou encore pour la désinfection des matériels et milieux inertes (antiseptiques et désinfectants) est directement reliée à leur toxicité plus ou moins sélective. Les antibiotiques sont, sensu stricto, des agents antimicrobiens d’origine biologique. Ils ont une activité létale sélectivement dirigée contre les micro-organismes, ce qui en fait des médicaments des infections systémiques (Block, 1977). A l’opposé, les antiseptiques et les désinfectants sont des agents antimicrobiens chimiques dont la toxicité est brutale et peu sélective vis à vis des cellules eucaryotes et procaryotes. Leur emploi est donc limité soit à un usage externe in vivo (antiseptiques) soit à une désinfection des surfaces inertes (désinfectants) (Duval J., 1989). Nous nous intéresserons plus particulièrement au groupe des molécules désinfectantes.

CHOIX DE L’AGENT ANTIMICROBIEN

Pour assurer une bonne désinfection, le principe actif doit répondre aux exigences suivantes :
– large spectre d’activité et action durable,
– efficacité en présence de résidus de souillure,
– utilisation possible dans des conditions très différentes de pH et de dureté de l’eau,
– action non corrosive sur les supports,
– actif à faible concentration,
– facilement rinçable,
– ne présenter aucun danger, aux concentrations d’utilisation, pour le métabolisme humain,
– être peu coûteux.

Aucun produit désinfectant ne réunissant à ce jour l’ensemble de ces propriétés, le choix du principe actif s’effectue sur des critères législatifs puis en fonction du spectre d’activité recherché et des critères spécifiques d’utilisation (compatibilité avec les matériaux…) (Beerens, 1985).

Réglementation

Pour les surfaces en contact avec des aliments, l’utilisation des agents antimicrobiens dans les industries agro-alimentaires implique une inscription préalable sur une liste positive. L’arrêté du 15 juin 1993 (Barbusiaux et al., 1993) modifiant et complétant l’arrêté du 27 octobre 1975 relatif aux produits de nettoyage du matériel pouvant se trouver au contact des denrées alimentaires, précise la liste exacte des molécules pouvant être utilisées pour des opérations de désinfection, ainsi que les molécules entrant dans la catégorie des agents de surface cationiques. Concernant le domaine hospitalier, les produits antimicrobiens utilisés pour la décontamination du matériel médical sont également inscrits sur une liste positive après proposition et accord écrit du fabricant. Les critères d’inclusion dans cette liste sont basés sur les normes françaises et européennes en vigueur i.e. Normes AFNOR « Antiseptiques et Désinfectants » série NF T 72 et NF EN. Depuis 1999, « ne sont pris en compte que les produits dont la concentration d’usage annoncée par le fabricant est supérieure ou égale à la concentration active pour la norme la plus défavorable » (Société Française d’Hygiène Hospitalière, 2003).

Activité bactéricide

D’une manière générale, l’activité d’un désinfectant peut être définie in vitro par deux valeurs : la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), plus faible concentration du produit inhibant totalement en 18 ou 24 heures la multiplication des micro-organismes, et la Concentration Minimale Létale (CML), plus faible concentration du produit capable de détruire un certain nombre de cellules microbiennes dans un temps déterminé (Joly, 1995). La CML est définie pour chaque micro-organisme. Ainsi, selon l’AFNOR, la bactéricidie ou Concentration Minimale Bactéricide (CMB) est la plus faible concentration du composé engendrant 5 réductions décimales d’une population initiale de 10⁸ ufc/mL en 5 minutes à 20°C. La détermination de la CMB répond à des protocoles standardisés décrits par la norme T72-150 (Anonyme, 1987) ou plus récemment par la norme NF-EN 1040 (Anonyme, 1997). Cette mesure permet donc de connaître le spectre d’activité des désinfectants afin de pouvoir les sélectionner en fonction de l’usage souhaité et du micro-organisme à éliminer.

Table des matières

PRESENTATION GENERALE
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
LA DESINFECTION
I. DEFINITION
II. MODES D’ACTION DES DESINFECTANTS
II.1. Notion de désinfectant et d’antiseptique
II.2. Choix de l’agent antimicrobien
II.2.1. Réglementation
II.2.2. Activité bactéricide
II.2.3. Détermination de l’activité antibactérienne des désinfectants
II.2.3.1. Sur cellules planctoniques
II.2.3.2. Sur cellules fixées
II.3. Mécanisme d’action général
III. CLASSIFICATION DES PRINCIPES ACTIFS ANTIMICROBIENS
III.1. Produits à action létale non spécifique
III.1.1. Oxydants
III.1.2. Halogènes et dérivés
III.1.3. Acides et bases
III.1.4. Alcools
III.1.5. Aldéhydes
III.2. Produits à action létale spécifique
III.2.1. Ammoniums quaternaires
III.2.2. Biguanides
III.2.3. Dérivés Phénoliques
IV. SENSIBILITE BACTERIENNE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS : NOTION DE RESISTANCE ET DE TOLERANCE
IV.1. Définition
IV.2. Résistance intrinsèque
IV.2.1. La paroi des bactéries à Gram positif
IV.2.2. La paroi des bactéries à Gram négatif
IV.3. Résistance acquise
IV.3.1. Résistance acquise chromosomique
IV.3.2. Résistance acquise plasmidique (ou extrachromosomique)
V. RESISTANCE LIEE A L’ETAT ADHERANT ET/ OU EN BIOFILM
V.1. Mécanisme général de l’adhésion
V.2. Interactions physico-chimiques non covalentes
V.2.1. Interactions électrostatiques
V.2.2. Interactions non-électrostatiques
V.2.2.1. Interactions de Lifshitz – van der Waals (LW)
V.2.2.2. Interactions Lewis acide-base (AB)
V.2.2.3. Interactions liées au mouvement Brownien(BR)
V.3. Evaluation de l’adhésion des micro-organismes aux surfaces
V.3.1. Dénombrement des cellules viables cultivables
V.3.2. Observation in situ
V.3.2.1. Flore totale
V.3.2.2. Différenciation entre cellules viables et cellules mortes
V.4. Facteurs susceptibles de modifier l’adhésion bactérienne
V.4.1. Caractéristiques des cellules bactériennes
V.4.2. Caractéristiques des supports solides
V.4.3. Caractéristiques des fluides environnants
V.4.4. Présence de matières interférentes
V.5. Adhésion et résistance aux agents antimicrobiens
V.5.1. Présence du glycocalyx
V.5.2. Etat physiologique des cellules adhérentes
V.5.3. Localisation au sein du biofilm
VI. CONCLUSION
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES
I. SOUCHES BACTERIENNES
I.1. Souches testées
I.2. Conditions de conservation
I.3. Conditions de croissance
I.3.1. Croissance sur milieu solide (TSA)
I.3.2. Croissance en milieu liquide (TSB)
I.3.3. Préparation des suspensions bactériennes
I.4. Caractérisation physico-chimique de la surface des cellules bactériennes
I.4.1. La méthode MATS (Microbial Adhesion To Solvents)
I.4.2. Détermination de la charge de surface des bactéries par micro-électrophorèse
II. SUPPORTS SOLIDES
II.1. Supports testés
II.2. Préparation des échantillons solides
II.3. Caractérisation physico-chimique de la surface des supports solides
II.3.1. Energie de surface des supports solides
II.3.2. Caractérisation de la surface des matériaux inertes par microscopie de force atomique (AFM :
Atomic Force Microscopy)
III. CONDITIONNEMENT DES SUPPORTS SOLIDES
III.1. Liquides de suspension
III.2. Solutions conditionnantes
III.2.1. Solutions encrassantes (Adaptées de la norme NF EN 1276, 1997)
III.2.1.1. Solution protéique modèle
III.2.1.2. Souillure complexe
III.2.2. Principes actifs désinfectants
III.3. Protocole de conditionnement
IV. ADHESION DES MICRO-ORGANISMES AUX SUPPORTS SOLIDES
IV.1. Tests d’adhésion
IV.2. Dénombrement des cellules adhérentes
IV.2.1. Flore totale
IV.2.2. Flore viable cultivable
V. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES PLANCTONIQUES
V.1. Agents antimicrobiens
V.2. Tests sur cellules planctoniques – application de la norme NF-EN 1040
V.2.1. Activité bactéricide des principes actifs
V.2.2. Témoin de non – toxicité et de neutralisation
VI. TESTS DE DESINFECTION SUR CELLULES ADHERENTES – MISE AU POINT D’UN PROTOCOLE PERMETTANT
D’EVALUER L’ACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS
VI.1. Activité bactéricide des principes actifs
VI.2. Dénombrement des cellules viables cultivables
VI.3. Témoin de toxicité et de neutralisation
VII. MISE AU POINT D’UNE TECHNIQUE RAPIDE PERMETTANT DE DETERMINER IN SITU L’ACTIVITE BACTERICIDE
DES DESINFECTANTS
VII.1. Mise au point de la coloration sur cellules planctoniques
VII.2. Témoin
VII.3. Test de désinfection sur cellules planctoniques
VII.4. Coloration des cellules adhérentes
VIII. ANALYSE STATISTIQUE
PARTIE III : RESULTATS – DISCUSSION
I. CONDITIONS DE CONSERVATION ET DE CROISSANCE DES SOUCHES BACTERIENNES
I.1. Impact sur les propriétés physico-chimiques de surface des micro-organismes
I.1.1. Mobilité électrophorétique
I.1.2. Test MATS
I.2. Impact sur l’activité bactéricide des désinfectants
I.2.1. Test MATS
I.2.2. Activité antimicrobienne et détermination de la Concentration Minimale Bactéricide
I.2.2.1. Acide peracétique (APA)
I.2.2.2. Chlorure de didécyl-diméthyl-ammonium (CDDMA)
I.2.2.3. Poly(hexaméthylène-biguanide) (PHMB)
I.3. Conclusion
II. EVALUATION DE L’ACTIVITE BACTERICIDE DES DESINFECTANTS SUR CELLULES ADHERENTES
II.1. Protocole d’adhésion microbienne aux surfaces
II.1.1. Caractérisation énergétique de la surface des supports solides
II.1.2. Adhésion bactérienne
II.1.2.1. Flore totale adhérente
II.1.2.2. Dénombrement des cellules viables cultivables
II.2. Désinfection des surfaces contaminées
II.2.1. Pseudomonas aeruginosa
II.2.2. Staphylococcus aureus
II.2.3. Listeria monocytogenes
II.3. Conclusion
III. MISE AU POINT D’UN PROTOCOLE RAPIDE PERMETTANT D’EVALUER IN SITU LA VIABILITE DES CELLULES
ADHERENTES
III.1. Protocole de coloration des cellules bactériennes
III.1.1. Choix des fluorochromes
III.1.2. Mise en place du protocole
III.1.2.1. Coloration des micro-organismes
III.1.2.2. Essais sur cellules planctoniques
III.1.2.3. Coloration sur cellules adhérentes
III.2. Application à la désinfection des surfaces
III.3. Conclusion
IV. FILMS PRIMAIRES ET QUALITE DE L’EAU : IMPACT SUR LA BIOADHESION ET LA VIABILITE CELLULAIRE
IV.1. Détermination des caractérisation physico-chimiques de surface de l’acier conditionné ou non
IV.1.1. Conditionnement par un encrassement organique
IV.1.1.1. Influence de la qualité de l’eau
IV.1.1.2. Solution modèle : la SAB
IV.1.1.3. Solution complexe : le lait
IV.1.2. Adsorption des agents antimicrobiens
IV.2. Impact sur le comportement bioadhésif et la viabilité des micro-organismes adhérents
IV.2.1. Molécules encrassantes
IV.2.2. Principes actifs antimicrobiens
IV.3. Application à la désinfection
IV.4. Conclusion
SYNTHESE GENERALE
CONCLUSION – PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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