Electroporation des cellules de Dictyostelium et clonage

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Diversité du clan arrestine

Un module arrestine conservé

Dans les arrestines conventionnelles, l’essentiel de la protéine est constitué du module arrestine étendu d’une courte queue C-terminale flexible et portant des sites d’interaction avec des partenaires protéiques. C’est sur la base d’une conservation de ce module arrestine, prédit par modélisation à partir de la structure connue des arrestines conventionnelles qu’ont été identifiées les arrestines non conventionnelles.
La résolution de la structure tridimentionnelle des β-arrestines et des arrestines visuelles a mis en évidence pour le module arrestine une organisation en deux domaines (N et C), chacun constitué de deux feuillets β antiparallèles incurvés et reliés entre eux par une charnière flexible (Figure 1) (Granzin et al., 1998, 2012; Han et al., 2001; Hirsch et al., 1999; Milano et al., 2002, 2006; Sutton et al., 2005; Zhan et al., 2011). Le domaine N comprend les brins β1 à 10 et le brin β20 qui est prolongé en N-terminal par une hélice α. Le domaine C inclut les brins 11 à 19 (Granzin et al., 2012; Hirsch et al., 1999; Milano et al., 2002; Sutton et al., 2005; Zhan et al., 2011). Ces deux domaines adoptent une forme globale en ω. Cette structure est maintenue dans une conformation « fermée » par deux types d’interactions moléculaires impliquant : (i) un cœur polaire localisé entre les deux sous-domaines et comprenant des acides aminés chargés provenant des sous-domaines N et C et de la queue C-terminale en aval du domaine C et (ii) une région dite à « 3 éléments » faisant intervenir des liaisons hydrophobes entre des résidus du premier brin β, de l’hélice α N-terminale et de la queue C-terminale (Gurevich and Gurevich, 2003, 2006b; Vishnivetskiy et al., 2000). Dans cette conformation, la queue C-terminale est repliée sur le cœur polaire et inaccessible. Dans la situation classique de reconnaissance d’un RCPG activé, la fixation du récepteur phosphorylé induit une transition vers une conformation « ouverte » rendant accessible la queue C-terminale et stabilisant l’interaction arrestine-récepteur. Ce changement de conformation passe par (i) la liaison du récepteur au niveau des régions concaves des feuillets β (Figure 1) par des acides aminés présents dans les domaines N et C (Hanson and Gurevich, 2006; Hanson et al., 2006a; Pulvermüller et al., 2000; Vishnivetskiy et al., 2004, 2010, 2011) et (ii) la liaison des résidus phosphates au niveau du site à trois éléments via deux lysines du brin β1, qui conduit à une déstabilisation du site et au mouvement de la queue C-terminale (Gimenez et al., 2012; Sensoy et al., 2016; Vishnivetskiy et al., 2000). Ce déplacement a pour effet une déstabilisation du cœur polaire par l’extraction d’un des résidus chargés, la libération de la queue C-terminale et la rotation des domaines N et C l’un par rapport à l’autre, menant à une conformation qui stabilise la liaison avec le récepteur (Burtey et al., 2007; Carter et al., 2005; Hanson et al., 2006a; Kang et al., 2014; Kim et al., 2012, 2013; Nobles et al., 2007; Shilton et al., 2002; Shukla et al., 2013; Xiao et al., 2004; Zhuang et al., 2013).
Parmi les arrestines non conventionnelles, seule la protéine TXNIP a fait l’objet d’études cristallographiques (Figure 2), (Hwang et al., 2014; Polekhina et al., 2013). En accord avec les prédictions de structure (Alvarez, 2008; Aubry et al., 2009), l’organisation en double feuillets β incurvés est retrouvée.
Figure 2 : Structure du complexe hétéromérique TRX/TXNIP (Hwang et al., 2014). Représentation de deux complexes hétéromériques formés par le complexe formé par la thiorédoxine/ (TRX, en jaune) et TXNIP (en bleu). Les domaines N (N-TXNIP) et C (C-TXNIP) ainsi que le numéro des brins β sont annotés dans le premier complexe.
En revanche, contrairement aux arrestines conventionnelles, TXNIP présente un arrangement non symétrique de ses feuillets β qui n’adoptent pas la forme en ω classique, ce qui pourrait indiquer un mode de fonctionnement différent. Toutefois, la protéine ayant été cristallisée en interaction avec son partenaire, la thioredoxine, cette particularité pourrait être spécifique de l’interaction. Dans le cas de TXNIP, l’hélice α N-terminale n’est pas conservée non plus. L’absence de cette hélice α dans les modèles structuraux obtenus sur les arrestines non conventionnelles avait été proposée par Alvarez (2008) comme facteur discriminant entre les β-arrestines et les α-arrestines, bien que certaines des arrestines non conventionnelles (ART4 et ART5 chez Saccharomyces cerevisiae par exemple) ne semblent pas suivre ce schéma.
Enfin le cœur polaire, au centre du système de régulation des arrestines conventionnelles, pourrait ne pas être conservé chez les arrestines non conventionnelles, au vu de la structure de TXNIP (Hwang et al., 2014) et des modèles réalisées sur les autres membres (Aubry and Klein, 2013), suggérant des mécanismes d’activation distincts. Des données cristallographiques supplémentaires devront être obtenues pour préciser les propriétés structurales de ces nouveaux membres.

Des extensions diversifiées

Dans les arrestines canoniques, le cœur arrestine est prolongé en C-terminal par une petite queue flexible qui participe directement à sa structure. Au-delà de ce rôle structural, la queue C-terminale des β-arrestines possède également plusieurs motifs d’interaction avec des partenaires protéiques de la machinerie d’endocytose, la clathrine et l’adaptine AP-2 (voir paragraphe I.2.1). L’exposition de ces sites de liaison suite à la libération de la queue C-terminale permet le recrutement de ces acteurs du trafic endocytaire (Burtey et al., 2007; Kim and Benovic, 2002; Nobles et al., 2007; Xiao et al., 2004) et l’internalisation des récepteurs reconnus par les arrestines dans la voie endocytaire. A la différence des arrestines canoniques, le cœur arrestine des arrestines non conventionnelles peut être associé à des extensions très diverses, plus ou moins longues (Alvarez, 2008; Becuwe et al., 2012a). Cette diversité est bien illustrée chez S. cerevisiae (Figure 3) ou encore D. discoideum comme nous le verrons dans la partie III de ce chapitre. Dans la plupart des cas, ces extensions sont dépourvues de sites canoniques de liaison à la clathrine ou à AP-2. En revanche, elles contiennent de façon assez systématique un ou plusieurs motifs de type [P/L]PxY qui ne sont pas retrouvés dans les arrestines conventionnelles (Figure 1) (Alvarez, 2008; Aubry et al., 2009; Becuwe et al., 2012a). De tels motifs sont connus pour interagir avec les domaines protéiques WW présents notamment dans les ubiquitine-ligases de la famille HECT (Salah et al., 2012) et nous verrons ultérieurement que ces motifs permettent effectivement un couplage direct des arrestines non conventionnelles avec la machinerie d’ubiquitination.

Fonctions des arrestines

Du fait de leur découverte comme régulateurs de la rhodopsine et du récepteur 2-adrénergique, on a initialement pensé que le rôle des arrestines (alors restreintes aux arrestines canoniques) se limitait à la seule désensibilisation des récepteurs RCPGs et donc à la régulation de la signalisation récepteur RCPG / protéine G -dépendante. Nous reviendrons sur cet aspect dans le paragraphe I.3.2. En fait, les fonctions de cette famille de protéines adaptatrices se sont révélées bien plus étendues avec un rôle plus large dans la signalisation cellulaire mais surtout un rôle dans le trafic de cargos membranaires divers, dont des RCPGs, qui apparaît aujourd’hui comme une fonction ancestrale du clan arrestine.

Rôle du clan arrestine dans le trafic de cargos membranaires

Un large panel de cibles membranaires

Avec l’accumulation des études sur les -arrestines et sur les nouveaux membres du clan arrestine, les années 2000 ont vu l’extension rapide du répertoire des cibles membranaires régulées par cette famille de protéines. Ces cibles ont été inventoriées dans le tableau II.
Chez les Mammifères, au-delà de RCPGs conventionnels, ce répertoire comprend des récepteurs à 7 passages transmembranaires non conventionnels dont Frizzled et Smoothened, des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dont les récepteurs au TGF -III et à l’IGF-1, des transporteurs comme le transporteur de glucose GLUT1, des canaux ioniques ou encore des protéines d’adhésion de type – intégrine et VE-cadhérine. Ces cargos membranaires peuvent être reconnus par plusieurs arrestines. C’est le cas par exemple du récepteur 2-adrénergique qui est la cible des -arrestines 1 et 2 mais aussi de la protéine ARRDC3. Les ARTs des Levures régulent également des RCPGs, comme les récepteurs aux phéromones Ste2 et Ste3, mais surtout de nombreux transporteurs membranaires, qui sont eux aussi la cible d’arrestines différentes en fonction du type ou de l’intensité des stimuli auxquels est confronté l’organisme (Figure 5) (Alvaro et al., 2014; Becuwe et al., 2012a, 2012b; Hatakeyama et al., 2010; Herrador et al., 2010; Herranz et al., 2005; Lin et al., 2008; Nikko and Pelham, 2009; Nikko et al., 2008; Prosser et al., 2015). Bien qu’il ait été montré, dans le cas du couple -arrestine/RCPGs, que la liaison du récepteur par l’arrestine passe généralement par sa phosphorylation préalable, l’existence d’une telle modification sur d’autres cargos et sa nécessité pour la prise en charge par les autres membres du clan arrestine n’ont pas été investiguées dans le détail. D’ailleurs, l’absence de cœur polaire dans les arrestines non conventionnelles pourrait indiquer un autre mode de fonctionnement.

Contrôle du trafic endocytaire des cibles membranaires des arrestines

En fonction des informations véhiculées par le milieu extracellulaire (hormones, nutriments, chimioattractants…) ou les cellules avoisinantes, la composition de la membrane plasmique peut faire l’objet d’un remodelage qui permet l’ajustement de la réponse cellulaire aux signaux du milieu environnant. Ce remodelage s’appuie sur la prise en charge des protéines de surface dans la voie endocytaire, permettant leur élimination temporaire ou définitive de la membrane plasmique. Les arrestines interviennent à plusieurs étapes du trafic endocytaire de ces cargos membranaires. Une fois internalisées, les protéines peuvent être soit recyclées vers la membrane plasmique, soit acheminées jusqu’aux lysosomes (ou la vacuole chez la Levure) pour y être dégradées (down-régulation) après leur séquestration dans la lumière de compartiments endocytaires intermédiaires, les corps multivésiculaires (MVB, Multi vesicular body) (Figure 6). Dans le cas des RCPGs, il a été montré que la stabilité de l’interaction récepteur-arrestine conditionne le devenir du récepteur. Les récepteurs en interaction faible avec les β-arrestines sont généralement déphosphorylés et ramenés en surface. Les RCPGs présentant ce type de comportement ont été dits de classe A (récepteurs β2-adrénergiques, récepteurs à la dopamine D1A…) et se séparent rapidement des arrestines. Ceux formant un complexe stable avec les β-arrestines sont plutôt acheminés jusqu’aux lysosomes et dégradés. C’est le cas des récepteurs RCPGs de classe B (récepteurs à la vasopressine V2R et à l’angiotensine AT1AR).

Modifications post-traductionnelles

Ubiquitination

La régulation par ubiquitination semble un mécanisme assez général au sein du clan arrestine. On sait que les β-arrestines sont poly-ubiquitinées suite à l’activation de RCPGs cibles (Shenoy et al., 2001) par une ubiquitine ligase à domaine RING, la protéine Mdm2 (Shenoy et al., 2009). Le profil d’ubiquitination est variable et semble en partie dicté par la nature du RCPG reconnu par l’arrestine et par les phosphorylations induites par la liaison du ligand (Kommaddi and Shenoy, 2013; Shenoy and Lefkowitz, 2005). Cette modification joue un rôle clé dans la stabilisation du complexe arrestine/récepteur, le recrutement des acteurs de la machinerie endocytaire et dans l’activation des cascades de signalisation MAPK-dépendantes après internalisation du complexe récepteur/arrestine (Kommaddi and Shenoy, 2013; Shenoy et al., 2007). L’ubiquitination des -arrestines est transitoire et contrôlée par la déubiquitinase USP33 (Berthouze et al., 2009; Shenoy et al., 2009) dont l’activité est d’ailleurs directement corrélée à l’efficacité d’adressage du récepteur dans la voie de recyclage. Les – arrestines ARRDCs et TXNIP peuvent aussi être ubiquitinées par les ubiquitine-ligases Itch, WWP1 et WWP2 (Nabhan et al., 2012; Rauch and Martin-Serrano, 2011; Zhang et al., 2010). Dans le cas de TXNIP, cette ubiquitination qui est empêchée par l’interaction de TXNIP avec la thioredoxine semble induire sa dégradation (Chutkow and Lee, 2011; Zhang et al., 2010).
Chez la Levure S. cerevisiae, de nombreux travaux ont mis en évidence l’ubiquitination des ARTs par l’ubiquitine ligase Rsp5 suite à des signaux déclenchant la down-régulation des cargos membranaires qu’elles régulent (Becuwe et al., 2012b; Hatakeyama et al., 2010; Herrador et al., 2010; Herranz et al., 2005; Lin et al., 2008). C’est le cas de l’ -arrestine ART4 qui, suite à l’exposition des cellules au glucose et l’activation des voies métaboliques associées, est séparée de son partenaire 14-3-3 et ubiquitinée par Rsp5. ART3 est ubiquitinée dans le cadre de l’internalisation du transporteur Dip5. Dans un schéma similaire, ART1 et ART2 sont ubiquitinées alors qu’elles permettent le recrutement de Rsp5 sur les transporteurs Can1 et Lyp1. ART9 et son équivalent chez A. nidulans, la protéine PalF, sont également ubiquitinées, par Rsp5 ou HulA chez A. nidulans, dans des conditions d’alcalinisation du pH du milieu extracellulaire induisant l’activation des RCPGs Rim21 et PalH (Herrador et al., 2010; Herranz et al., 2005; Hervás-Aguilar et al., 2010). Cette ubiquitination module les fonctions associées aux arrestines comme l’internalisation de leurs cibles membranaires ou l’activation des voies de signalisation en aval. Ainsi, la mutation des sites d’ubiquitination d’ART4 conduit à un défaut d’internalisation du transporteur de lactate Jen1, en réponse au glucose qui normalement provoque l’endocytose du transporteur (Becuwe et al., 2012b) et la présence constitutive d’une étiquette ubiquitine sur la protéine chimère PalF/Ub déclenche l’activation de la voie PalH dans des conditions de pH acide, dans lesquelles elle est normalement inhibée (Hervás-Aguilar et al., 2010).

Sumoylation

Une régulation par SUMOylation, une modification proche de l’ubiquitination qui consiste en la liaison covalente de la petite protéine SUMO (small ubiquitin-like modifier) sur des résidus lysines par des SUMO-ligases, a aussi été décrite pour les β-arrestines. Ainsi, la SUMOylation de la lysine K400 de la β-arrestine-2 bovine suite à l’activation du récepteur β2-adrénergique semble promouvoir l’internalisation de ce dernier en favorisant l’interaction de l’arrestine avec la sous-unité β2 de la protéine AP-2 (Wyatt et al., 2011). Plus récemment, Xiao et collègues (2015) ont montré que la – arrestine-2 humaine est sumoylée en réponse à l’interleukine IL-1β, sur la lysine K295, une lysine très conservée dans les arrestines conventionnelles (Aubry and Klein, 2013; Xiao et al., 2015). Cette sumoylation inhibe son interaction avec l’ubiquitine ligase TRAF6, favorisant ainsi l’activation des facteurs de transcription NF-κB et AP-1.

Phosphorylation

Dans le cytosol, les -arrestines sont présentes sous une forme constitutivement phosphorylée, et leur recrutement sur les récepteurs cibles activés s’accompagne de leur déphosphorylation. La β-arrestine 1 est phosphorylée par des MAP-kinases sur le résidu S412, situé au niveau de la queue C-terminale (Barthet et al., 2009; Lin et al., 1997) et cette phosphorylation inhibe son interaction avec ses partenaires de la machinerie endocytaire et avec la kinase Src. La β-arrestine 2, quant à elle, est modifiée sur la thréonine T383 et sur un site secondaire, la sérine S361 (Kim et al., 2002b; Lin et al., 2002) par la caséine kinase II. A la différence de la β-arrestine 1, ces phosphorylations ne semblent pas affecter le recrutement des acteurs endocytaires (Kim et al., 2002b; Lin et al., 1997, 1999a; Luttrell et al., 1999).
Parallèlement à la déphosphorylation de la sérine S412de la β-arrestine 1, les travaux de Marion et al. (2007) ont montré que l’activation du récepteur 2-adrénergique conduit à la phosphorylation de la tyrosine Y54 (Marion et al., 2007). Ce résidu Y54 est inclus dans le site de liaison YVTL de la sous-unité µ2 de la protéine adaptatrice AP-2 et sa phosphorylation augmente l’interaction de l’arrestine avec la protéine AP-2 (Marion et al., 2007). Dans la β-arrestine-2, cette tyrosine est remplacée par une phénylalanine, et n’est donc pas impliquée dans la modulation de la liaison arrestine/AP-2. Cette liaison, en revanche, semble être modulée par la S-nitrosylation du résidu C410, absent dans la β-arrestine 1 (Ozawa et al., 2008).
Plusieurs arrestines non conventionnelles sont également phosphorylées, et maintenues ainsi sous une forme « inactive ». C’est le cas notamment de la plupart des ARTs de Levure, dont la phosphorylation/déphosphorylation repose sur un répertoire de kinases et phosphatases, très divers selon les conditions de culture et stress (nutriments, pH…) appliqués à l’organisme. L’arrestine ART4, qui est impliquée dans la down-régulation de Jen1 lors de la transition lactate-glucose, est phosphorylée par Snf1, l’orthologue de l’AMPK (AMP-activated protein kinase), et maintenue sous cette forme inactive en complexe avec la protéine adaptatrice 14.3.3 en présence de lactate dans le milieu extérieur. L’addition de glucose conduit à sa déphosphorylation par la phosphatase PP1. Cette déphosphorylation qui permet le départ de 14.3.3 est indispensable à son ubiquitination par la protéine Rsp5 et celle de sa cible Jen1p (Becuwe et al., 2012b). Dans un cadre différent, ART4, tout comme ART6, peuvent être déphosphorylées de façon calcineurine-dépendante suite à l’activation du RCPG Ste2 ou du transporteur Dip5, respectivement (Alvaro et al., 2014; O’Donnell et al., 2013). ART1 et Bul1/2 sont phosphorylées par Nrp1, une kinase inhibée par le senseur nutritionnel TORC1. Leur déphosphorylation par la phosphatase PP2A-like Sit4, en réponse à l’activation de TORC1 permet l’internalisation des transporteurs Can1 et Gap1 respectivement (MacGurn et al., 2011; Merhi and André, 2012). La protéine ART9 est multi-phosphorylée en conditions de pH acide par la caséine kinase 1 localisée à la membrane plasmique. Cet état phosphorylé permet l’inhibition de la voie de signalisation RIM, activée par l’alcalinisation du milieu extracellulaire, du fait d’une interaction lâche avec le récepteur Rim21. En revanche, la déphosphorylation d’ART9 n’est pas nécessaire à la levée d’inhibition de la voie RIM. Elle est maintenue à pH alcalin et l’ubiquitination nécessaire à l’activation de la voie RIM, se fait sur la protéine phosphorylée (Herrador et al., 2015). A la différence d’ART9, la phosphorylation de la protéine PalF de A. nidulans est déclenchée par l’alcalinisation du milieu, suggérant des modes de fonctionnement différents pour ces deux orthologues (Herranz et al., 2005). Chez les Mammifères, la protéine TXNIP est modifiée par l’AMPK en conditions de stress énergétique par déplétion en glucose. Cette phosphorylation empêche l’internalisation TXNIP-dépendante du transporteur de glucose GLUT1 afin de le garder disponible en cas d’arrivée de glucose, et conduit à la dégradation de l’arrestine en favorisant son ubiquitination (Wu et al., 2013). Plusieurs sites de phosphorylation ont également été identifiés sur les autres membres du clan arrestine, ARRDC3 et ARRDC4 (Shea et al., 2012). Toutefois, on ne sait pas actuellement si ces phosphorylations ont un effet inhibiteur ou activateur sur les protéines. C’est également le cas de la protéine AdcA de l’amibe Dictyostelium discoideum qui est phosphorylée en réponse à divers types de stress, dont le stress hyperosmotique (Habourdin et al., 2013).

Oligomérisation

Un deuxième niveau de contrôle du fonctionnement des arrestines est apporté par leur capacité à oligomériser. Ainsi, il a été montré que les arrestines sont capables de former des homodimères ou encore des homotétramères, et de participer à des complexes hétéro-oligomériques avec d’autres
membres du clan arrestine, ceci de façon réversible (Hanson et al., 2007a, 2007b, 2008a; Imamoto et al., 2003; Milano et al., 2006; Storez et al., 2005).
Les propriétés d’auto-assemblage ont surtout été décrites pour les arrestines conventionnelles et semblent modulées par un inositol polyphosphorylé très abondant dans le cytosol des cellules, l’inositol hexaphosphate (IP6). L’IP6 exerce un effet inhibiteur sur l’oligomérisation de l’arrestine visuelle Arr-1 mais active celle des -arrestines ou de l’autre isoforme visuelle, Arr-4, in vitro (Hanson et al., 2008a; Milano et al., 2006). Alors que le monomère semble être la forme préférentielle de liaison avec les récepteurs, l’oligomère pourrait plutôt constituer une forme de stockage cytosolique mobilisable en réponse à l’activation de récepteurs cibles. Deux sites de liaison à l’IP6 ont été identifiés sur les β-arrestines, l’un de forte affinité (Kd aux alentours de 4.10-8 M) sur le domaine C et l’autre, de plus faible affinité localisé sur le domaine N (Kd d’environ 3.10-6 M) (Milano et al., 2006). Ces sites se superposent avec le site de liaison des phosphoinositides et en partie avec le site de translocation nucléaire (Hoeppner et al., 2012). Des mutations empêchant la liaison de l’IP6 interfèrent avec l’oligomérisation des – arrestines, leur localisation subcellulaire et le recrutement de partenaires (Milano et al., 2006). Ainsi, alors que la β-arrestine 1 a une répartition cytoplasmique et nucléaire dans les cellules au repos, une forme mutée de la protéine, constitutivement monomérique, est essentiellement nucléaire. Ce n’est pas le cas de la -arrestine 2 qui, du fait de son site d’export nucléaire, reste cytosolique. En revanche, la forme mutée est incapable d’interagir avec Mdm2 et d’empêcher la dégradation de p53 en séquestrant l’ubiquitine-ligase hors du noyau (Boularan et al., 2007). Des mutations sur des résidus positifs (K285, R286 et K295) identifiés comme indispensables à l’oligomérisation de la β-arrestine 2 affectent spécifiquement l’interaction de l’arrestine avec le récepteur β2-adrénergique et avec les MAPKs ERK1/2, interférant avec la phosphorylation RCPG dépendante de ces dernières (Xu et al., 2008). Ces travaux suggèrent ainsi que la forme oligomérique de la β-arrestine 2 pourrait permettre le recrutement d’effecteurs spécifiques et distincts de ceux recrutés par les formes monomériques. L’oligomérisation pourrait aussi potentiellement moduler l’association des arrestines avec les microtubules ou la calmoduline dont les sites de liaison se situent sur la même face de l’arrestine que ceux de l’IP6 (Hanson et al., 2006b, 2007a; Wu et al., 2006). Par contre, pour ces formes constitutivement monomériques des -arrestines, les propriétés de liaison aux récepteurs activés et aux acteurs de la machinerie endocytaire et l’internalisation des récepteurs ne sont, dans la grande majorité des cas, pas affectées (Boularan et al., 2007; Hanson et al., 2008a et b; Milano et al., 2006).
L’existence d’hétéro-oligomères -arrestine 1/ -arrestine 2 a également été mise en évidence, par des approches d’imagerie, d’immunoprécipitation et de protéomique (Storez et al., 2005; Xiao et al., 2007). Cette hétéro-oligomérisation pourrait permettre, dans certaines conditions, la rétention dans le cytosol de la -arrestine 1.
Pour le moment, l’état oligomérique des arrestines non conventionnelles n’a pas été étudié dans le détail. Les ARRDCs de Mammifères semblent toutefois capables d’interagir avec les -arrestines et de former des hétéro-oligomères. Ceci a été établi pour ARRDC3 et ARRDC4 qui, en conditions de surexpression, forment des complexes avec les β-arrestines endogènes de façon constitutive et co- localisent sur des vésicules endoplasmiques en réponse à la stimulation du récepteur β2-adrénergique ou du récepteur à la vasopressine (Shea et al., 2012). Suite à l’activation de Notch, ARRDC1 s’associe également à la β-arrestine 1 au niveau de compartiments endocytaires, permettant le recrutement de l’ubiquitine ligase Itch sur le récepteur et sa dégradation (Puca et al., 2013). Il a été proposé que l’hétéro-oligomérisation des β-arrestines aux ARRDCs permette de recruter dans l’environnement des récepteurs activés reconnus par les β-arrestines, des ubiquitine-ligases de type HECT contrôlant leur devenir, à travers les domaines [L/P]PxY des ARRDCs. Ce modèle qui propose un rôle conjoint des β-arrestines et des ARRDCs éventuellement à différentes étapes du trafic est néanmoins en contradiction avec les résultats de Han et collègues (2013) qui suggèrent plutôt un rôle successif des deux sous-familles d’arrestines avec les β-arrestines à la membrane plasmique et les ARRDCs plus tardivement après internalisation.

Retour du calcium à son niveau basal et maintien de l’homéostasie calcique

Parallèlement aux mécanismes conduisant à l’entrée de calcium dans le cytosol, la cellule fait intervenir une large gamme d’acteurs qui assurent l’immobilisation/neutralisation temporaire du calcium par séquestration via des protéines tampon ou par son transport hors du cytosol (voies OFF) (Figure 14). L’action conjointe et régulée de ces mécanismes permet une modulation fine du signal calcique et in fine le rétablissement dans le cytosol d’une concentration basale de calcium, aux alentours de 50-100 nM pour la plupart des cellules.

Rôle des protéines tampon

La séquestration des cations Ca2+ libres dans le cytosol est assurée par des calciprotéines dont l’affinité pour le calcium avoisine les 0,2-2 µM. A l’état de repos, elles sont majoritairement sous une forme non liée au calcium. Ces protéines tampon, parmi lesquelles les isoformes α et β des parvalbumines, les calbindines D9K et D28K et la calrétinine, se chargent en calcium lors de son entrée dans la cellule et au-delà d’un certain seuil, et le libèrent, suite à la chute de sa concentration cytosolique résultant de son expulsion dans le milieu extracellulaire ou de sa capture par les compartiments de stockage intracellulaire. En raison de leur mobilité et de leur affinité variable pour le cation, elles participent à la régulation spatio-temporelle du signal calcique. D’autres calciprotéines plutôt impliquées dans la transduction du signal calcique, comme la calmoduline ou les protéines de la famille S100, peuvent aussi agir comme tampon calcique lorsqu’elles sont présentes en concentration suffisamment élevée (Schwaller, 2010). La capacité tampon du cytosol varie énormément d’un type cellulaire à un autre, les protéines tampon présentant des propriétés et un profil d’expression spécifiques. La calbindine D28K et la calrétinine sont des tampons dits rapides alors que la parvalbumine présente une cinétique de liaison au calcium beaucoup plus lente (John et al., 2001). De faibles propriétés tampon semblent liées à la capacité d’une cellule à produire rapidement des signaux calciques, mais, en contrepartie, à une sensibilité plus grande au stress excitotoxique (Palecek et al., 1999).
En plus de ces tampons mobiles, des constituants cellulaires semblent agir comme des tampons calciques immobiles, à savoir des protéines transmembranaires ou associées aux membranes, ou encore les têtes polaires des phospholipides de la couche interne de la membrane plasmique (McLaughlin et al., 1981).

Mécanismes d’efflux du calcium à la membrane plasmique

Etant donné le gradient calcique existant entre le milieu extracellulaire/compartiments de stockage et le cytosol, en faveur de l’entrée de calcium dans le cytoplasme, des ATPases à calcium fonctionnent en permanence pour l’expulser hors du cytosol, en particulier vers le milieu extracellulaire. Elles partagent cette fonction avec des échangeurs Na+/Ca2+.
Les ATPases à calcium de la membrane plasmique : PMCAs
Les PMCAs (Plasma Membrane Ca2+-ATPases) sont des ATPases de type-P qui effectuent le transport actif des ions Ca2+ hors de la cellule à raison d’un cation par molécule d’ATP hydrolysé (Figure 14). Les PMCAs sont les modulateurs principaux du calcium à la membrane plasmique dans la plupart des types cellulaires, à l’exception des cellules excitables dans lesquelles l’activité des échangeurs Na+/Ca2+ NCX prédomine. Quatre isoformes sont exprimées, avec de multiples variants d’épissage alternatif ayant des affinités diverses pour le calcium et leur régulateur, la calmoduline. De façon générale, ces ATPases présentent une haute affinité (Kd ~ 100-200 nM) pour le calcium qui leur permet de répondre à de faibles augmentations de la concentration calcique cytosolique et de maintenir un bas niveau de calcium dans le cytosol. En revanche, leur capacité de transport du calcium est faible, comparée à celle des NCXs (Berridge et al., 2000; Carafoli et al., 2001). La calmoduline augmente à la fois l’affinité des PMCAs pour le calcium (x 20-30) et leur efficacité de transport du cation (x 10). Ces pompes calciques peuvent aussi être régulées par des phosphoinositides, comme le PI(4,5)P2, qui augmentent également leur affinité pour le calcium et par leur phosphorylation par les kinases PKA et PKC (Rosado and Sage, 2000).
Figure 14 : Résumé des mécanismes ON et OFF d’entrée et sortie du calcium cytosolique (Berridge et al., 2003). Les éléments responsables de l’entrée de calcium depuis le milieu extérieur et le réticulum endoplasmique sont représentés à gauche de la figure. Les pompes calciques PMCAs de la membrane plasmique, SERCA du réticulum endoplasmique et l’échangeur NCX sont représentés à droite. L’action conjointe de ces acteurs permet de sculpter un signal calcique de durée variable associée à des fonctions diverses.
Les PMCAs agissent également de façon indirecte dans le maintien de la concentration calcique intracellulaire par le contrôle de la production d’IP3, et donc de la libération du calcium depuis le réticulum endoplasmique (Padányi et al., 2016).
Les échangeurs Na+/Ca2+ de la membrane plasmique
Les échangeurs Na+/Ca2+ NCX (et Na+/Ca2+-K+ NCKX) de la membrane plasmique, dont il existe différentes isoformes, sont également des acteurs majeurs de la régulation de la concentration en calcium libre. Ils présentent une affinité plus faible pour le calcium que les PMCAs mais une capacité de transport plus élevée, ce qui leur confère un rôle dans la régulation rapide du taux de calcium cytosolique suite à une élévation importante, comme lors de la propagation du potentiel d’action dans les neurones. L’extrusion des ions Ca2+ se fait contre son gradient électrochimique, en utilisant l’énergie d’entrée des ions Na+ (Figure 14). Dans certaines conditions physiologiques menant notamment à l’augmentation intracellulaire de Na+, le mode de transport peut être inversé de façon transitoire conduisant à l’export du calcium dans le cytosol. Le transport est influencé par le potentiel transmembranaire de la cellule. Parmi les facteurs de régulation des NCXs, démontrés ou proposés, on notera la présence de la calmoduline, de l’environnement lipidique à travers le PI(4,5)P2, l’ATP cytosolique et le calcium lui-même (Abiko et al., 2016; DiPolo et al., 2004; He et al., 2000; Iwamoto et al., 1998).

Capture du calcium par les compartiments de stockage

Réticulum endoplasmique
Au niveau du RE, la capture du calcium s’effectue à l’aide de pompes à calcium, les ATPases SERCA (Toyoshima and Inesi, 2004), et des protéines tampon localisées dans la lumière de l’organelle comme les calséquestrines, calréticulines et calnexines (Rizzuto and Pozzan, 2006). Le fonctionnement des SERCAs est proche de celui des PMCAs de la membrane plasmique (Toyoshima and Inesi, 2004). Il en existe différentes isoformes et plusieurs variants d’épissage alternatif, préférentiellement exprimés dans le réticulum sarcoplasmique des cellules musculaires. Tous peuvent être inhibés par la thapsigargine, un agent pharmacologique classiquement utilisé pour augmenter le calcium cytosolique.
En conditions physiologiques, et en particulier dans le réticulum sarcoplasmique des cellules musculaires cardiaques, ces pompes sont régulées par la protéine Phospholamban (PLB/PLN), (Akin et al., 2013) et par la sarcolipine qui se lient directement à la Ca2+-ATPase SERCA2a et en diminuent la vitesse de transport (Bhupathy et al., 2007). Un mécanisme de régulation impliquant la sphingosine a également été mis en évidence, qui fonctionnerait de façon similaire à la thapsigargine (Benaim et al., 2016).
Mitochondries
Les mitochondries jouent également un rôle important, par la séquestration rapide du calcium cytosolique limitant ainsi l’amplitude du signal calcique. Elles apparaissent aujourd’hui comme un puissant outil de contrôle local des variations de calcium cytosolique.
L’import du calcium dans la matrice mitochondriale nécessite le passage des deux membranes externe et interne des mitochondries. A la membrane externe, le transport du calcium est assuré par des canaux anioniques voltage-dépendants de type VDAC, dont la sélectivité anion-cation et la conductance sont modifiées en fonction du potentiel de membrane (Colombini, 2012). A la membrane interne, la prise en charge du calcium met en jeu le complexe MICU1-MCU (Baughman et al., 2011; Perocchi et al., 2010). La protéine MICU1 qui possède deux sites de liaison au calcium de type EF-hand (voir paragraphe II.3.1.1), interagit directement avec l’uniporteur à calcium MCU qui assure l’activité de transport grâce au potentiel électronégatif établi par la chaine respiratoire. Du fait de la relativement faible affinité de MCU pour le calcium (de l’ordre du µM), la capture du calcium par les mitochondries pourrait se faire dans l’environnement immédiat des canaux de la membrane plasmique et du RE qui assurent l’entrée de calcium dans le cytosol, où les concentrations locales en calcium sont plus élevées (Santo-Domingo and Demaurex, 2010). Des données récentes indiquent également la possibilité de capture de calcium par les mitochondries en présence de concentrations calciques de l’ordre du nM, potentiellement imputable à un échangeur Ca2+/H+ de plus haute affinité possédant également des motifs EF-hand, la protéine LETM1 (Jiang et al., 2009) (Figure 15). Par ailleurs, dans les cardiomyocytes, des récepteurs de type RyRs pourraient également contribuer à l’entrée de calcium dans les mitochondries (Altschafl et al., 2007; Beutner et al., 2001).
Appareil de Golgi
L’import du calcium dans la lumière du Golgi utilise deux types d’ATPases à calcium : des pompes SERCAs plutôt localisées au niveau du cis-Golgi et des SPCAs (Secretory Pathway calcium ATPase), proches des PMCAs, insensibles à la thapsigargine, et restreintes au trans-Golgi. Dans la lumière du Golgi, le calcium est séquestré par des protéines tampon en partie retrouvées dans le RE, et notamment la nucléobindine, ou CALNUC, Cab45 ou encore P54/NEFA (Kawano et al., 2000; pour revue : Li et al., 2013; Lin et al., 1998, 1999b; Morel-Huaux et al., 2002).
Voie endocytaire
Les mécanismes responsables de la séquestration du calcium dans les compartiments endocytaires sont actuellement inconnus, même si la voie endocytaire a très tôt été décrite comme un compartiment de stockage du calcium (Haller et al., 1996; Hilden and Madias, 1989). Il est clair, néanmoins, que ces mécanismes utilisent le gradient de protons généré par l’ATPase vacuolaire responsable de l’acidification des endosomes pour permettre l’import de calcium dans la lumière du compartiment par une activité de type échangeur Ca2+/H+ (Morgan et al., 2011).

Table des matières

INTRODUCTION
I. Le clan arrestine
I.1 Des arrestines visuelles au clan arrestine
I.2 Diversité du clan arrestine
I.3 Fonctions des arrestines
I.4 Mécanismes moléculaires de régulation des arrestines
II. La signalisation calcique
II.1 Le signal calcique : génération et extinction
II.2 Modelage du signal calcique
II.3 Transduction du signal calcique
III. Le modèle d’étude Dictyostelium discoideum
III.1 Généralités
III.2 Les arrestines de Dictyostelium discoideum
III.3 Signalisation calcium dépendante chez Dictyostelium discoideum
IV. Objectifs
MATERIELS ET METHODES
I. Matériels
I.1 Instruments
I.2 Réactifs
I.3 Plasmides
I.4 Souches
I.5 Anticorps
II. Techniques de biologie moléculaire
II.1 Sous-clonage
II.2 Extraction d’acides nucléiques chez Dictyostelium
II.3 Invalidation de gènes par le système Cre-LoxP
II.4 Southern blot
III. Technique de biologie cellulaire
III.1 Culture cellulaire
III.2 Electroporation des cellules de Dictyostelium et clonage
III.3 Mesure de l’activité macropinocytaire de l’amibe Dictyostelium
III.4 Développement multicellulaire de Dictyostelium
III.5 Mesure de l’adhésion cellulaire sur boîtes plastiques
III.6 Mesure de la motilité exploratoire de Dictyostelium
III.7 Test de chimiotactisme au folate
III.8 Imagerie cellulaire
III.9 Suivi des fluctuations de calcium intracellulaire
III.10 Co-immunoprécipitation et pull-down
III.11 Test d’interactions en système double-hybride
IV. Techniques de biochimie
IV.1 Analyse de protéines sur gel de polyacrylamide
IV.2 Expression et purification de protéines recombinantes
IV.3 Production et purification d’anticorps
IV.4 Test de co-sédimentation avec des liposomes
IV.5 Microscopie électronique
RESULTATS
I. Analyse in silico des protéines AdcB et AdcC
I.1 Du gène à la protéine
I.2 Le domaine C2
I.3 Les domaines SAMs
I.4 Recherche d’homologues
II. Etude fonctionnelle des protéines AdcB et AdcC
II.1 Production d’anticorps anti-AdcB et anti-AdcC
II.2 Expression temporelle d’AdcB et AdcC
II.3 Localisation subcellulaire d’AdcB et AdcC
II.4 Oligomérisation des protéines AdcB et AdcC
III. Caractérisation phénotypique des mutants nuls d’AdcB et AdcC
III.1 Obtention de souches invalidées pour AdcB et/ou AdcC
III.2 Analyse phénotypique des mutants
IV. Recherche de partenaires d’AdcB et d’AdcC
IV.1 Identification de partenaires putatifs par crible double-hybride
IV.2 Recherche de partenaires putatifs par pull-down
IV.3 Recherche de partenaires par Bio-ID
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
I. La protéine AdcC, un senseur de calcium recruté à la membrane plasmique
II AdcC et son homologue AdcB sont présents sous forme de larges complexes in cellulo
II.1 Des complexes oligomériques SAM-dépendants
II.2 Des complexes dynamiques ?
III. Quel(s) rôle(s) pour les arrestines AdcB et AdcC ?
III.1 Quelles cibles pour AdcC ?
III.2 Quel rôle pour le calcium dans la signalisation AdcC-dépendante ?
III.3 Quel rôle pour AdcB ?
IV. Conclusion
BIBLIOGRAPHIE

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