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Stades folliculaires: aspects morphologiques
Le follicule primordial, qui mesure environ 30 µm de diamètre, est le plus petit des follicules. Il est constitué d’un ovocyte de petite taille, dont le noyau est bloqué en fin de prophase de la première division de la méiose, entouré d’une seule couche de cellules somatiques, précurseur des CG, aplaties. Cette structure est séparée du stroma par une membrane basale : la membrane de Slavjanski (Fig. 7a).
Le follicule primaire a un diamètre compris entre 45 µm et 50 µm. Il est caractérisé par la transformation des cellules periovocytaires qui deviennent cubiques et le début de la formation de la ZP. La transformation de la monocouche de cellules aplaties en cellules cubiques est le premier signe d’activation de la croissance du follicule et en conséquence de leur sortie du pool de réserve (Fig. 7b).
Les cellules peri-ovocytaires commencent à se multiplier et lorsque le follicule est entouré par au moins deux couches de cellules il est classé en follicule secondaire (Fig. 7c). Le diamètre augmente progressivement jusqu’à 200 µm dû à la prolifération, par mitoses successives, des cellules peri-ovocytaires qui prennent alors le nom de cellules de la granulosa (CG). Simultanément les cellules du stroma qui lui sont adjointes se différencient formant la thèque. Ces cellules fibroblastiques se stratifient avec la croissance du follicule et se différencient en thèque interne et thèque externe qui sont séparés par des vaisseaux sanguins formant ainsi le follicule préantral ou secondaire tardif.
Les CG continuent de proliférer et on voit apparaitre des espaces intercellulaires, qui confluent formant une plus grande cavité appelée antrum et le follicule est qualifié de follicule antral (Fig. 7d).
Pendant la croissance du follicule antral les CG continuent de proliférer, l’antrum s’élargit et on observe la différenciation des CG en deux types cellulaires morphologiquement et fonctionnellement très distincts. Les CG plus proches de la thèque constituent la granulosa murale et les CG qui entourent directement l’ovocyte forment le cumulus oophorus.
En fin de croissance, le follicule atteint une taille d’environ 20 mm et il est dénommé follicule pré – ovulatoire, follicule mûr ou follicule de De Graaf (Fig. 7e). Il est caractérisé par une cavité antrale très volumineuse bordée par la granulosa. L’ovocyte, toujours bloqué en fin de prophase I, fait saillie dans l’antrum et est rattaché à la granulosa par le cumulus oophorus. La granulosa, à son tour, avec la croissance de l’antrum devient de plus en plus fine. La couche de CG qui est directement en contact avec l’ovocyte s’appelle corona radiata.
Après la décharge ovulante de LH, les CG se dissocient et une expansion des cellules du cumulus est observée. Le liquide folliculaire, jusque-là enfermé dans le follicule s’écoule et entraine avec lui l’ovocyte entouré des cellules du cumulus qui composent le complexe cumulus-ovocytaire (CCO). Figure 7 : Coupes histologiques des différentes types morphologiques folliculaires : a) follicule primaire; b) follicule primaire; c) follicule secondaire; d) follicule antral (début antrum) et e) follicule pré ovulatoire ou follicule de De Graaf (adapté de http://www.studyblue.com).
Stades folliculaires : aspects moléculaires
Formation des follicules primordiaux
La formation des follicules s’initie avec la rupture des nids de cellules germinales. Au moment du blocage de la méiose, les ovocytes, jusque-là en nids, commencent à être entourés par des cellules somatiques aplaties (pré-granulosa) formant ainsi le follicule primordial. Les mécanismes qui permettent la maintenance et/ou rupture des nids de cellules germinales sont méconnus. Cependant quelques études, chez les rongeurs, montrent un possible rôle des estrogènes et des protéines GDF9, BMP15, FOXL2 et NOBOX, puisque l’absence ou réduction de l’expression de ces gènes induisent des changements dans le temps de rupture des nids et augmentent la présence de follicules multi ovocytaires (Bristol-Gould et al. 2005, McMullen et al. 2001, Rajkovic et al. 2004, Tingen et al. 2009, Uda et al. 2004). Un facteur de transcription a été décrit comme essentiel à la formation des follicules primordiaux – le FIGLA (Factor in the germline, alpha). Ce facteur de transcription a été d’abord décrit comme régulateur des gènes Zp1, Zp2 et Zp3 (Liang et al. 1997). Cependant des études avec des souris KO pour le gène Figα montrent que aucun follicule primordial n’est formé en son absence et que les cellules germinales dégénèrent en quelques jours (Soyal et al. 2000) montrant ainsi que ce facteur de transcription est un des facteurs avec un rôle prépondérant non seulement dans les cellules de la lignée germinale mais aussi dans la formation de follicules primordiaux (Joshi et al. 2007).
Activation des follicules primordiaux
La sortie du pool de réserve avec l’activation des follicules primordiaux est indépendante du cycle ovarien, donc des gonadotrophines, mais se fait par le biais d’un dialogue moléculaire entre l’ovocyte et les cellules folliculeuses qui l’entourent.
Ce dialogue se fait principalement, grâce à une action coordonnée entre deux voies de signalisation : TSC/mTORC1 et PTEN/PI3K ayant la AKT (protéine Kinase B) comme point de liaison (Adhikari et al. 2010, Liu et al. 2006, Reddy et al. 2009).
Dans le follicule primordial l’interaction entre Kit Ligand (KL) – produit par les cellules folliculaires, et son récepteur cKiT (récepteur tyrosine kinase) – localisé sur la surface de l’ovocyte, régule la voie de signalisation PI3K dans l’ovocyte activant l’AKT. Cette dernière inhibe à son tour la transcription de FOXO3a (forkheadprotein box O3) et de CDKN1B (Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B), impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose. En conséquence, on observe une augmentation de la survie cellulaire, la croissance et l’activation folliculaire (Blume-Jensen et al. 2000, Reddy et al. 2005). L’AKT a aussi comme cible le complexe TSC2/TSC1 (tuberin/tuberous sclerosis) qui inhibe la transcription de mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex) qui est décrit comme régulateur de la croissance et prolifération cellulaire (Kim 2012, Zheng et al. 2012) (Fig. 8).
De ce fait la régulation de la voie de signalisation PI3K par celle de mTORC1 permet d’éviter l’épuisement prématuré de la réserve ovarienne (IOF).
D’autres facteurs sécrétés par l’ovocyte ou les cellules folliculeuses ont été décrits comme ayant un rôle dans l’activation, le maintien et la transition des follicules primordiaux et primaires :
FOXL2 (forkheadprotein box L2) présent dans les cellules folliculeuses aplaties est décrit comme un inhibiteur de l’activation des follicules de la réserve puisque son absence conduit à une insuffisance ovarienne prématurée (Schmidt et al. 2004, Uda et al. 2004).
L’hormone anti-müllérienne (AMH), sécrétée par les CG en croissance jouerait aussi un rôle déterminant dans le maintien de la quiescence folliculaire, mais les voies de signalisation et cellules cibles de cette hormone restent inconnues (Durlinger et al. 1999, Nilsson et al. 2007).
PDGF (platelet-derived growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor) et LIF (leukemia inhibiting factor) semblent avoir un rôle indirect dans la régulation de l’activation et l’entrée en croissance des follicules primordiaux en stimulant la sécrétion de KL (Nilsson et al. 2001, Nilsson et al. 2006, Skinner 2005)
D’autres facteurs de transcription tels que SOHLH1 (spermatogenesis and Oogenesis Specific Basic Helix-Loop-Helix) et NOBOX (newborn ovary homeobox) ont aussi été décrits comme ayant un rôle dans l’activation et la maintenance des follicules primordiaux mais leur rôle spécifique reste à élucider (Pangas et al. 2006, Rajkovic et al. 2004).
Follicule primaire
Dès que le follicule commence sa croissance les CG présentent des prolongements cytoplasmiques qui pénètrent la ZP et forment des Gap junctions, composées de connexines (CX), avec la membrane de l’ovocyte permettant la communication et les échanges métaboliques entre l’ovocyte et les CG (Eppig 1991, Matzuk et al. 2002). Le stade de follicule primaire est aussi caractérisé par le début de la traduction d’ARN et plus précisément par la synthèse des glycoprotéines ZP1, ZP2 et ZP3 qui constituent la zone pellucide (ZP) (Gougeon 1986).
Des facteurs de croissance tels que GDF-9 (Growth differenciation factor-9) et BMP15 (bone morphogenetic protein-15) commencent à être exprimés dans l’ovocyte et stimulent la prolifération des CG et leur survie (Carabatsos et al. 1998, Dong et al. 1996, Matzuk et al. 2002).
Même si dès le stade de follicule primaire des récepteurs à l’Hormone folliculo stimulante (FSH) et à l’Hormone lutéinisante (LH) sont déjà détectables (Kol et al. 1995, O’Shaughnessy et al. 1996, Oktay et al. 1997a) les gonadotrophines ne sont pas nécessaires à la croissance folliculaire, à ce stade, puisque les follicules atteignent les stades suivants en leur absence (Dierich et al. 1998).
Follicule secondaire et préantral
À ce stade les CG subissent une grande activité mitotique et prolifèrent sous l’influence de facteurs internes. Parallèlement les cellules de la thèque aussi se multiplient, se stratifient et se différencient en thèque externe et interne (Dong et al. 1996, Ito et al. 2001). Les cellules de la thèque externe sont similaires aux cellules du stroma qui l’entourent, tandis que les cellules de la thèque interne se différencient et deviennent morphologiquement semblables à des cellules sécrétoires (Gougeon 2010). Les deux thèques sont séparées par des vaisseaux sanguins et à partir de ce moment le follicule est exposé à la circulation sanguine (Gougeon 2010, Reynolds et al. 1992).
Plusieurs facteurs ont été proposés soit comme régulateurs de la prolifération et/ou de la survie des CG et de la thèque soit comme inhibiteurs d’activité des récepteurs FSH tels que les facteurs de croissance GDF9, BMP15 (Hreinsson et al. 2002, Otsuka et al. 2000), l’activine A (Li et al. 1995, Yokota et al. 1997, Zhao et al. 2001), l’inhibine B (Smitz et al. 1998), l’EGF (epidermal growth factor) (Roy 1993), l’HGF (hepatocyt growth factor) et le FGF2 (fibroblast growth factor 2) (Parrott et al. 1994).
Follicule antral
Ce follicule est caractérisé par la présence d’une cavité – l’antrum, rempli d’un liquide folliculaire qui est composé par des sécrétions des CG et par un transsudat sérique qui devient source d’oxygène et stocke plusieurs molécules comme des carbohydrates, acides aminés, facteurs de croissance et hormones entre autres.
Quand le follicule atteint une taille de 2 mm les récepteurs FSH et LH deviennent sensibles à l’action des gonadotrophines passant à un développement complètement dépendant des hormones FSH et LH et de leurs fluctuations pendant le cycle menstruel (Gougeon 1986).
Sous l’influence des gonadotrophines, les follicules produisent maintenant des androgènes et des œstrogènes qui contribuent au développement folliculaire ainsi qu’à la différenciation des CG en deux types cellulaires morphologiques et fonctionnellement différents (Sanchez et al. 2012).
Les CG plus proches de la thèque – granulosa murale, ont un rôle plutôt endocrine et les cellules qui entourent directement l’ovocyte correspondant au cumulus oophorus, ont un rôle prépondérant dans la maturation ovocytaire et son métabolisme (Matzuk et al. 2002).
Peu avant l’ovulation, le pic de LH provoque indirectement l’expansion du CCO qui est accompagnée d’une production d’acide hyaluronique qui aide
à l’expansion des cellules du CCO. Cette expansion du CCO est essentielle à la maturation de l’ovocyte car sans elle le taux d’ovocyte mature est moindre (Eppig 1982, Gougeon 2010, Park et al. 2004).
Le contrôle hormonal du cycle menstruel
Tout le cycle menstruel et les modifications associées sont sous contrôle des oestrogènes et de la progestérone qui sont produits par l’ovaire, et des gonadotrophines FSH et LH qui sont produites par l’hypophyse et régulés par l’hypothalamus. L’hypothalamus secrète de manière pulsatile la GnRH (gonadotropin releasing hormone). Cette dernière stimule la sécrétion, également de façon cyclique et pulsatile, des gonadotrophines FSH et LH par l’hypophyse. L’amplitude et la fréquence des pulses de GnRH déterminent les variations de sécrétion des gonadotrophines au long du cycle menstruel. La FSH et la LH agissent sur le follicule ovarien en croissance et le corps jaune. Ainsi au cours de la première partie du cycle (phase folliculaire), la croissance et la maturation du follicule sous influence de la FSH doivent attendre un certain seuil de développement en dessous duquel la croissance folliculaire s’arrête. Les follicules en croissance secrètent, à leur tour, des oestrogènes qui eux vont induire la prolifération de l’endomètre, qui est la muqueuse qui recouvre la cavité utérine. Quand le follicule atteint la maturité, le taux croissant d’œstrogènes dans le sang est à son maximum signalant à l’hypophyse que le follicule est prêt à expulser son ovocyte. Ce signal provoque une réduction des taux de FSH en dessous du seuil de développement et une forte augmentation de la libération de LH par rétrocontrôle positif. Cette poussée de LH est appelé le pic ovulatoire et déclenche l’ovulation qui survient environ 36 heures après. Pendant la phase lutéale les taux de FSH et LH diminuent rapidement et le follicule ovulatoire, qui s’est rompu, se transforme en corps jaune (corpus luteum). Le corps jaune secrète de la progestérone qui prépare l’endomètre à la nidation. En absence d’implantation le corps jaune régresse et devient un corpus albicans. Cette dégénérescence comporte une chute dans les taux de progestérone ce qui enduit la desquamation de l’endomètre et les saignements caractéristiques des cycles menstruels. Si la fécondation a lieu le corps jaune persiste pendant trois mois environ et prend le nom de corps jaune gestatif. Celui-ci assure le maintien des taux de progestérone nécessaires à la nidation et à la croissance de l’embryon implanté.
Dynamique de la croissance folliculaire
Comme indiqué auparavant la croissance folliculaire au sein de l’ovaire se fait en plusieurs étapes. Dans un premier temps plusieurs follicules primordiaux sortent continuellement de la réserve ovarienne et débutent une longue croissance appelée croissance basale. Cette croissance débute par groupes de plusieurs dizaines de follicules tous les jours. Chez l’humain il est estimé qu’un follicule qui débute sa croissance met 2 à 3 mois pour atteindre le stade de follicule préantral et puis environ 70 jours pour l’apparition de l’antrum et atteindre la taille minimale de 2 mm. Les follicules continuent de croître et en fin de phase lutéale du cycle précédant, il y a le recrutement, du à l’élévation transitoire du taux de FSH, d’une cohorte de follicules cavitaires devenus sensibles aux gonadotrophines. Ces follicules initient leur croissance terminale complètement dépendante des gonadotrophines et qui se déroule entièrement pendant un cycle menstruel.
La croissance des follicules recrutés se poursuit de façon inégale due à leurs différentes tailles et sensibilité aux gonadotrophines. En conséquence, parmi ceux-là un se développe plus rapidement que les autres, et devient plus sensible à la FSH qui diminue. Celle-ci atteint un seuil auquel un seule follicule continue capable de répondre et de continuer sa croissance. C’est la
sélection du follicule ovulatoire. Ce follicule exerce alors une dominance sur les autres et il est le seule qui continue de croitre. La croissance terminale s’achève avec l’expulsion de l’ovocyte mature – l’ovulation.
A noter que pendant toute la folliculogenèse il existe une forte atrésie des follicules puisque d’un large groupe de plusieurs follicules primordiaux ayant débuté leur croissance un seul expulsera son ovocyte.
Croissance Folliculaire IN VITRO
La culture de follicules ovariens est une technique qui permettrait la croissance et le développement de follicules ovariens depuis le stade primordial jusqu’au stade de follicule ovulatoire aboutissant à l’obtention d’un ovocyte mature compétent.
Le développement des techniques de croissance folliculaire et maturation ovocytaire in vitro est d’un grand intérêt pour la recherche et la médecine de la reproduction autant chez l’humain que dans d’autres espèces. La croissance in vitro de follicules ovariens est un important instrument de recherche car il permet l’étude biologique de la folliculogenèse permettant d’approfondir les connaissances sur ce processus complexe. En assistance médicale à la procréation ceci est d’autant plus important car cela pourrait permettre l’utilisation de fragments ovariens cryoconservés dans le but de préserver la fertilité de patientes nécessitant un traitement hautement stérilisant et qui ne se situent pas dans la possibilité d’une autogreffe de tissu ovarien du fait du risque de réintroduction de la maladie (Meirow et al. 2008, Picton et al. 2000).
Malgré quelques travaux plus anciens, la recherche concernant la croissance folliculaire in vitro s’est intensifié au milieu des années 1990. Ainsi, plusieurs techniques de culture folliculaire ont été depuis développées à partir soit du tissu ovarien, soit de follicules isolés. La croissance d’une structure si complexe, le follicule, ex vivo présente d’innombrables défis liés d’une part à la perte de la vascularisation, et d’autre part à la perte de paramètres cellulaires et structuraux une fois retirés de leur environnement, quand les follicules sont isolés. Ainsi, le choix des techniques, milieux et supports de culture folliculaire doivent non seulement tenir compte de l’origine des follicules (congelé ou frais, dans des fragments d’ovaire ou isolés) et du stade de développement initial, mais aussi répondre simultanément à plusieurs paramètres physiologiques et moléculaires de façon à offrir à l’ovocyte, aux cellules de la granulosa, de la thèque et aux cellules du stroma, les conditions nécessaires à leur développement en culture (Fig. 12).
Culture en phase liquide ou 2D
Dans ce type de culture les follicules isolés sont généralement placés dans un milieu sur un support plastique et recouverts d’huile minérale (Cortvrindt et al. 1998, Eppig et al. 1989, Eppig et al. 1996). Ceci entraine un attachement des follicules au support de culture qui allié à l’intense prolifération des cellules de la granulosa provoque la rupture de la membrane de Slavjanski et l’étalement du follicule sur une surface bidimensionnelle. Même s’il a été décrit que la perte de la structure tridimensionnelle et l’étalement des cellules de la granulosa compromettent la communication étroite avec l’ovocyte (Fig. 13A) (West et al. 2007a), ce système de culture est depuis des années utilisé pour des études comparatives sur la croissance folliculaire in vitro chez la souris.
De nombreux paramètres comme le diamètre folliculaire et ovocytaire lors de la croissance, la capacité de l’ovocyte à reprendre la méiose, la configuration de la chromatine, l’activité transcriptionnelle, la survenue d’oscillations calciques intracytoplasmiques, entre autres, ont été analysées pendant la croissance en système 2D et les résultats obtenus ont été considérés comme comparables à ceux obtenus in vivo (Cortvrindt et al. 2002, Pesty et al. 2007, Sun et al. 2004). De plus, la croissance folliculaire et les différences morphologiques associées sont facilement observables au microscope, avec la culture 2D (Fig. 13B). La production d’hormones stéroïdiennes et de protéines est également mesurable par dosage dans le milieu de culture (Dorphin et al. 2012, Smitz et al. 1998). De surcroit, ce type de culture a été un des premiers à avoir été validé par l’obtention de souriceaux viables après croissance folliculaire in vitro (Cortvrindt et al. 1996, dela Pena et al. 2002, Eppig et al. 1989, Eppig et al. 1996, Liu et al. 2001, O’Brien et al. 2003).
Culture organotypique ou 3D
Dans ce type de culture le follicule garde sa structure tridimensionnelle tout au long de la croissance in vitro par l’absence d’adhésion des follicules au support de culture. Le follicule présente alors une croissance radiaire à partir de l’ovocyte et les interactions ovocyte-cellules folliculaires sont maintenues (Fig 14A).
Les systèmes de culture en 3D peuvent être réalisés par :
Utilisation de membranes hydrophobes (Nayudu et al. 1992).
Utilisation de matériels de support coniques qui empêchent l’adhésion, associés à un changement journalier du milieu des puits de culture (Fehrenbach et al. 1998, Vitt et al. 1998).
Inclusion dans des capsules de matrice d’hydrogel (Carroll et al. 1991b, Gomes et al. 1999, Torrance et al. 1989, West et al. 2007b, Xu et al. 2006b).
Le système le plus souvent utilisé pour la culture 3D est l’inclusion dans des capsules de matrice, composées le plus fréquemment par des hydrogels naturels tels que le collagène ou l’alginate. Les hydrogels miment la matrice extracellulaire ovarienne et sont perméables, permettant aussi la diffusion de nutriments, les échanges gazeux et l’efflux des déchets cellulaires produits par le follicule, en maintenant les interactions entre ovocyte-cellules folliculaires (Fig. 14A). Les premières inclusions de follicules préantraux isolés dans des matrices datent de la fin des années 1980 utilisant du collagène (Torrance et al. 1989) et ont permis l’amélioration des conditions de culture chez la souris et d’autres espèces (Carroll et al. 1991a, Gomes et al. 1999, Vanhoutte et al. 2009). À ce jour l’hydrogel le plus fréquemment utilisé est l’alginate. Les différentes études ont montré que les follicules préantraux, inclus dans des capsules d’alginate, atteignaient un diamètre similaire à celui observé in vivo (Pangas et al. 2003) et permettait la différenciation des cellules folliculaires, la formation de l’antrum, la maturation ovocytaire et la production d’hormones, ceci en ajustant la rigidité de la capsule en faisant varier la concentration en alginate (West et al. 2007b, Xu et al. 2006b). Cette technique (Fig. 14B) a également permis la naissance de souriceaux (Xu et al. 2006a).
Cependant une étude récente montre que les ovocytes maturés avec cette technique présentent des anomalies dans la formation du fuseau méiotique et l’alignement des chromosomes, dans la formation des granules corticaux ainsi que dans l’expulsion du premier globule polaire (Mainigi et al. 2011).
Une nouvelle approche utilisant un mélange d’alginate et de fibrine a également été décrite. L’ajout de la fibrine permet la diminution de la rigidité et de la concentration des capsules en alginate, qui peut nuire à la croissance du follicule. De plus la fibrine est dégradable. Ainsi elle peut être dissoute au long de la culture par le follicule lui-même en produisant des protéases, tout en gardant sa structure 3D, maintenue par l’alginate. Cette nouvelle approche semble aussi mimer le comportement du follicule au sein de l’ovaire puisque pendant son développement le follicule passe d’un cortex rigide à la médullaire plus lâche (Shikanov et al. 2009, 2011).
Chromatographie liquide
La chromatographie liquide a comme principe la séparation des composés entrainés par un liquide (phase mobile) à travers un solide (phase stationnaire) qui lui, est normalement fixé à une colonne appelé colonne chromatographique. La séparation se réalise selon les interactions chimiques ou physiques des molécules avec la phase mobile ainsi qu’avec la phase stationnaire. Cette séparation peut se faire avec une colonne chromatographique c’est à dire 1D ou ayant recours à deux colonnes chromatographiques séquentielles – 2D.
Identification des protéines par spectrométrie de masse
Il existe deux approches différentes pour identifier une protéine digérée par spectrométrie de masse. La première ne peut être utilisée que pour une protéine purifiée (par exemple un spot de gel 2D). Il s’agit de la méthode d’identification par empreinte peptidique de masse, la masse des peptides obtenus après digestion d’une protéine est comparée aux masses théoriques des peptides des protéines répertoriées dans les banques de données. Quand les échantillons sont complexes, la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est utilisée. Dans ce cas, une première analyse MS permet de mesurer la masse du peptide qui est ensuite isolé et fragmenté. Une deuxième analyse MS des fragments obtenus permet de déterminer la séquence peptidique : en effet, chaque acide aminé de la séquence peut être déterminé en calculant la distance entre deux pics adjacents.
Pour l’étape d’identification, les protéines sont digérées dans un premier temps en peptides à l’aide d’enzymes spécifiques. L’enzyme utilisée le plus classiquement est la trypsine qui clive après chaque acide aminé de type lysine ou arginine.
Les peptides issus de la digestion sont ensuite analysés par spectrométrie de masse qui se base sur la mesure du rapport masse sur charge (m/z) des peptides ionisés à l’état gazeux. Le spectromètre de masse est normalement composé de trois éléments : une source d’ions, un analyseur de masse et un système de détection des ions (Fig. 21).
La protéomique appliquée à la biologie de la reproduction
Dans le domaine de la santé, la protéomique s’est rapidement imposée comme un outil puissant principalement dans la mise en évidence de marqueurs diagnostiques ou pronostiques de maladies comme le cancer du sein, de la prostate et la maladie d’Alzheimer. Le domaine de la biologie de la reproduction ne fait pas exception et l’utilisation de cette approche a permis d’élargir la connaissance des évènements moléculaires des fonctions reproductrices chez l’homme et chez la femme avec l’analyse d’expression, de régulation et de modifications des protéines dans plusieurs types cellulaires, tissus et organes. Ainsi, au cours des dernières années, les principaux travaux de protéomique ont été réalisés, chez le male, sur les testicules, la maturation epididymaire des spermatozoides, les fluides séminaux et le développement du spermatozoïde, et chez la femelle, sur l’endomètre, l’endométriose, le syndrome des ovaires polykystiques, la maturation ovocytaire et le liquide folliculaire, mais aussi sur la fécondation, l’interaction gamétique et le développement embryonnaire initial (Upadhyay et al. 2013).
L’étude protéomique dans la reproduction féminine
En biologie de la reproduction, pour le côté féminin, les études de protéomiques ont comme but essentiel :
l’évaluation de la qualité ovocytaire et en conséquence sa capacité à reprendre la méiose ainsi que l’identification des protéines impliquées dans le développement initial de l’embryon l’étude de pathologies qui affectent la fertilité telles que l’endométriose et le syndrome des ovaires polykystiques l’étude de l’endomètre pour essayer de mettre en évidence des marqueurs sur la qualité de l’endomètre pour l’implantation.
Pendant les cinq dernières années, les études sur l’endomètre, chez la femme, ont permis de mettre en évidence des protéines différemment exprimées selon la phase du cycle menstruel, l’identification de protéines surexprimées pendant la fenêtre implantatoire et de protéines non connues auparavant pour leur régulation par les stéroïdes (Chen et al. 2009, DeSouza et al. 2005, Dominguez et al. 2009, Parmar et al. 2009, Rai et al. 2010). Ces résultats pourront ainsi permettre l’identification et l’analyse des protéines ayant un rôle potentiel dans la capacité de l’endomètre à accueillir les embryons, ce qui peut aider à optimiser la préparation de l’endomètre en vue des transferts d’embryons et peut être même aider en cas d’échec d’implantation lors des cycles de FIV.
Plusieurs études ont effectué des analyses protéomiques pour comparer les endomètres ectopiques de femmes atteintes d’endométriose à des endomètres normaux révélant des protéines qui présentaient des expressions différentes selon la présence ou l’absence de la pathologie (Chehna-Patel et al. 2011, Fowler et al. 2007, Scotchie et al. 2009, Ten Have et al. 2007, Zhang et al. 2006).
En ce qui concerne l’ovaire, le plus souvent les études visent à mieux connaitre le syndrome des ovaires polykystiques. Cependant, dans un premier temps, c’est l’ovaire sain qui a été étudié, et récemment une grande étude sur le protéome de l’ovaire du Macaque Rhésus a permis l’identification de plus de 5 000 protéines constituant ainsi le plus grand protéome décrit pour l’ovaire (He et al. 2014). Dans cette étude le cycle cellulaire, la régulation de la mort cellulaire et de l’apoptose ainsi que l’organisation du cytosquelette étaient les processus biologiques les plus représentés en terme de nombre de protéines. Parmi les protéines identifiées, 48 avaient été antérieurement décrites comme ayant une expression variable entre les ovaires polykystiques et les ovaires normaux chez l’humain (Ma et al. 2007) établissant ainsi une liste de protéines qui devront faire l’objet d’études plus approfondies pour comprendre leur rôle exact dans la pathologie et ainsi parvenir à faire évoluer le diagnostic et le traitement du syndrome des ovaires polykystiques.
Le liquide folliculaire, par son origine et sa proximité avec l’ovocyte en croissance est aussi un important sujet d’études protéomiques pour en déduire la qualité folliculo-ovocytaire. Chez l’humain, la publication la plus récente, décrit l’identification de 480 protéines dont 320 jamais décrites dans le liquide folliculaire, et ce après avoir exclu les 14 protéines les plus abondantes déjà décrites antérieurement (Ambekar et al. 2013). Cela a permis d’élargir le nombre de protéines connues et présentes dans le liquide folliculaire. Ceci pourrait aider à mieux connaître sa fonction, aider au développement de marqueurs de qualité ovocytaire et ainsi augmenter les taux de grossesse et aider à la recherche des causes d’infertilité dans le futur (Ambekar et al. 2013).
L’étude de l’ovocyte – approche protéomique
L’ovocyte du fait de son importance, de sa rareté et de la difficulté à en obtenir est une cellule difficilement analysable chez l’humain. En protéomique cela est d’autant plus important car les quantités d’échantillon nécessaires aux analyses impliquent un très grand nombre d’ovocytes. En conséquence les études protéomiques sur l’ovocyte sont souvent réalisées dans des modèles animaux et particulièrement chez la souris.
C’est au début de la dernière décennie que les premières études protéomiques ont été rapportées avec l’identification de protéines de l’ovocyte mature de souris, dans le but d’identifier les protéines de surface impliquées dans l’interaction entre le spermatozoïde et l’ovocyte lors de la fécondation. Après une électrophorèse 2D, environ 500 spots protéiques ont été mis en évidence. Entre ceux-ci, 80 protéines potentielles de surface ont été repérées après l’analyse avec un gel d’affinité et 30 ont été identifiées après analyse au spectromètre de masse (Coonrod et al. 2002). La même équipe a publié plus tard l’identification de 8 protéines chaperonnes très abondantes dans l’ovocyte mature avec la confirmation par immunofluorescence de leur localisation à la surface de l’ovocyte pour 4 d’entre elles, à savoir GRP78, GRP94, HSP90 et Calreticulin (Calvert et al. 2003).
Depuis ce sont surtout des études concernant la maturation ovocytaire et la recherche de protéines associées au développement initial de l’embryon qui ont été décrites avec l’établissement du protéome de l’ovocyte au stade VG et MII.
En 2007, une étude de l’équipe de Coonrod a comparé les cartes protéiques d’ovocytes en fin de croissance avant et après la reprise de la méiose, après séparation en gel 2D. Cette première étude sur la maturation ovocytaire a permis d’identifier 12 protéines qui varient entre les stades de VG et de MII (Vitale et al. 2007). La même année un profil protéique du complexe cumulus-ovocytaire a été décrit toujours après séparation des protéines par gel 2D. Dans cette étude les auteurs décrivent l’identification de 156 protéines et leur classification dans les différentes fonctions biologiques : 31 % des protéines sont impliquées dans l’expression des gènes/protéines, 24 % dans le métabolisme cellulaire, 12 % dans la défense cellulaire, encore 12 % dans la communication et signalisation cellulaire, 10 % dans la structure et mobilité cellulaire et finalement 7 % dans la division cellulaire et 4 % dans des processus non connus. Cette étude a également mis en évidence plusieurs familles de protéines pouvant jouer un rôle important dans le développement folliculaire. Ainsi l’identification de 9 hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonucleo proteins) impliquées dans la synthèse et le transport des ARNm a été rapportée, tout comme 9 enzymes impliquées dans la glycolyse, 4 peroxyredoxines, 10 protéines chaperonnes et 7 protéines de la famille TCP-1 (T-complex protein 1) (Meng et al. 2007). Cette étude est, à notre connaissance, la seule chez la souris à ne pas avoir été effectuée avec des ovocytes isolés, mais avec des CCO, s’intéressant ainsi aux cellules qui entourent l’ovocyte lors de la maturation.
En 2008, une équipe a étudié le protéome et le phosphoprotéome de l’ovocyte en MII sans la ZP, dans le but d’analyser les modifications post-traductionnelles et en particulier les phosphorylations. Ayant toujours recours à l’électrophorèse 2D et la spectrométrie de masse, cette équipe a identifié 380 protéines parmi lesquelles 53 présentaient des modifications post-traductionnelles (PTM) révélées par la coloration Pro-Q Diamond (qui détecte spécifiquement les protéines phosphorylées) démontrant pour la première fois la présence de protéines PTM dans l’ovocyte mature. Les fonctions biologiques avec le plus de protéines identifiées étaient associées au métabolisme et à la régulation des protéines : métabolisme des protéines (101) protéines de liaisons (100) et repliement des protéines (34), tandis que l’activité des enzymes tels que les protéasomes et les actetyltransferases n’avaient que 9 et 3 protéines attribuées respectivement. Avec cette étude le protéome de l’ovocyte mature a été élargi et la présence de protéines phosphorylées dans l’ovocyte mature a été prouvée (Ma et al. 2008). Une année plus tard, en 2009, la même équipe publiait l’identification des protéines de l’ovocyte en MII sans ZP, mais cette fois en ayant recours à une séparation des protéines avec un gel 1D SDS-PAGE et une analyse par spectrométrie de masse après fractionnement en chromatographie inversé (RP-LC-MS/MS). Avec cette approche 625 protéines ont été identifiées élargissant ainsi le panel des protéines décrites dans l’ovocyte mature. De plus, ils ont mis en évidence 76 protéines impliquées dans le développement embryonnaire. Leur analyse a démontré une surreprésentation significative des protéines impliquées dans des fonctions moléculaires telles que « unfolded protein binding », l’activité oxydoréductase, l’action sur les groupes CH-OH et l’activité des GTPases et aucune sous représentation. Pour les fonctions biologiques, le scénario s’est inversé avec une sous représentation significative dans l’ovocyte mature, par rapport à d’autres tissus, de protéines impliquées dans la régulation du métabolisme cellulaire, la transcription et le métabolisme de l’ARN, tandis qu’aucune fonction biologique n’était significativement surreprésentée. De plus dans cette étude, une analyse semi-quantitative par rapport au nombre de peptides uniques identifiés pour une protéine a été réalisée montrant 23 protéines avec plus de 10 peptides uniques identifiés (Zhang et al. 2009).
En 2010, une grande étude a établie et comparé le protéome d’ovocytes de souris aux stades VG et MII, avec 7 000 ovocytes à chaque stade ainsi que 7 000 zygotes en utilisant une analyse MS semi-quantitative. Au stade MII 2 973 protéines ont été identifiées, 2 781 au stade VG et 2 082 au stade zygotes. Les auteurs ont comparé le protéome des ovocytes VG et avec celui des ovocytes MII et le protéome des zygotes avec celui des cellules souches embryonnaires (ES). La distribution des protéines dans les différents groupes par fonctions biologiques était similaire, alors qu’une comparaison quantitative par rapport au nombre de peptides identifiés pour chaque protéine a été réalisée montrant que les ovocytes VG et MII avait plus de protéines en communs que les zygotes et les cellules ES. Les protéines de la famille TUDOR ont été identifiées seulement dans les ovocytes et les protéines de la famille F-box étaient aussi surexprimées dans les ovocytes. Au stade VG, les protéines associées au transport membranaire, les transporteurs primaires, les protéines de la famille des canaux cationiques et les jonctions de type gap étaient surexprimées, tandis qu’au stade de MII, les protéines surexprimées étaient les protéines associées aux facteurs de transcription, aux modifications épigénétiques, et au métabolisme de l’ADN (Wang et al. 2010). Le plus récent et le plus grand protéome établi pour l’ovocyte mature a identifié plus de 3 699 groupes de protéines combinant les 29 fractions d’un gel 1D SDS-PAGE et l’analyse MS. De ces groupes de protéines, 2 842 ont pu être corrélées au transcriptome de souris analysé par microarray. Pour les groupes restant aucun ARN correspondant n’a été trouvé et 125 protéines n’avait même pas d’identifiant. Les fonctions biologiques les plus présentes étaient les processus métaboliques, les processus cellulaires, le transport et la communication cellulaire. Cette étude a aussi permis l’identification de 28 protéines probablement impliquées dans la reprogrammation lors du développement embryonnaire (Pfeiffer et al. 2011).
Même si dans cette introduction je résume seulement les principaux travaux menés chez la souris pour la constitution du protéome de l’ovocyte en fin de croissance aux stades VG et MII, des étude similaires ont été menées chez d’autres espèces en particulier celles ayant un intérêt industriel/économique comme par exemple le bovin (Berendt et al. 2009, Bhojwani et al. 2006, Memili et al. 2007, Peddinti et al. 2010).
Cependant toutes ces études sont faites sur l’ovocyte en fin de croissance, isolé, soit mature bloqué en métaphase II (MII) ou toujours bloqué en fin de prophase I (VG), et décrivent les protéines impliquées au moment de la maturation et reprise de la méiose. Peu d’articles se sont intéressés aux cellules du CCO, mais encore une fois ceux-ci visaient l’étude moléculaire de la maturation ovocytaire. A notre connaissance, aucun article n’a décrit le protéome de l’ovocyte au cours de sa croissance, au sein du follicule ovarien, tout en sachant que la croissance ovocytaire et folliculaire sont inséparables. Ainsi cette structure fonctionnelle si particulière, par la dépendance des différents types cellulaires qui la composent, semble extrêmement importante à étudier.
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Table des matières
I. Introduction
A. Ovogenèse et Folliculogenèse
1. L’ovaire : rappel anatomique et histologique
2. Réserve ovarienne
3. Ovogenèse
3. 1. Phase de multiplication
3. 2. Croissance ovocytaire
3. 2. 1. Aspects morphologiques
3. 2. 2. Aspects moléculaires
3. 3. Maturation ovocytaire
3. 3. 1. La reprise de la méiose
3. 3. 2. Maturation cytoplasmique
4. Folliculogenèse
4. 1. Stades folliculaires: aspects morphologiques
4. 2. Stades folliculaires : aspects moléculaires
4. 2. 1. Formation des follicules primordiaux
4. 2. 2. Activation des follicules primordiaux
4. 2. 3. Follicule primaire
4. 2. 4. Follicule secondaire et préantral
4. 2. 5. Follicule antral
4. 3. Cycle menstruel
4. 3. 1. Le contrôle hormonal du cycle menstruel
4. 4. Dynamique de la croissance folliculaire
B. Croissance Folliculaire in vitro
1. Types de cultures
1. 1. Culture in situ
1. 2. Culture de follicules isolés
1. 2. 1. Isolement des follicules
2. La souris comme modèle
2. 1. Culture de follicules isolés
2. 1. 1. Culture en phase liquide ou 2D
2. 1. 2. Culture organotypique ou 3D
3. Chez l’humain
3. 1. Différentes approches de culture
C. La protéomique
1. Les grandes étapes d’une analyse protéomique
1. 1. Extraction
1. 2. Préfractionnement
1. 2. 1. Electrophorèse 1D
1. 2. 2. Électrofocalisation
1. 3. Séparation
1. 3. 1. Electrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D)
1. 3. 2. Chromatographie liquide
1. 4. Identification des protéines par spectrométrie de masse
1. 5. Analyse bioinformatique
2. La protéomique appliquée à la biologie de la reproduction
2. 1. L’étude protéomique dans la reproduction féminine
2. 2. L’étude de l’ovocyte – approche protéomique
II. Objectifs de la Thèse
III. Matériels et méthodes
A. Culture de follicules ovariens de souris
1. Animaux
2. Prélèvement des ovaires et isolement des follicules
3. Culture folliculaire
4. Maturation ovocytaire
5. Stades folliculaires étudiés
5. 1. Stade initial (IS)
5. 2. Rupture complète de la membrane de Slavjanski (RMS)
5. 3. Follicules avec une cavité antrum like (FA)
6. Choix d’étudier le follicule entier
6. 1. Séparation des différents types cellulaires
7. Comparaison des milieux de culture
7. 1. Courbes de croissance
7. 2. Critères morphologiques et taux de maturation
8. Sélection des follicules pour l’analyse protéomique
B. Analyse protéomique
1. Extraction des protéines
2. Préfractionnement des extraits protéiques
2. 1. Fractionnement IEF OffGel
2. 2. Fractionnement IEF in gel
3. Digestion trypsique
4. Identification des protéines par spectrométrie de masse
4. 1. Dessalage des mélanges de peptides issus de la digestion
4. 2. Analyse LC-MS/MS
4. 2. 1. Séparation des peptides par 1DLC
4. 2. 2 Séparation des peptides par 2DLC
4. 2. 3. Analyse des peptides en MS/MS avec une trappe ionique
5. Identification des protéines
6. Analyse des profils protéiques
6. 1. AnalyseGene Ontology (GO) via PANTHER
6. 2. Quantification label-free
6. 3. Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
6. 3. Pathway Studio
IV. Résultats
A. Acquisition des profils protéiques
1. Composition des groupes étudiés
2. Préfractionnement IEF in gel
3. Identification des protéines présentes dans les différents stades de développement
B. Analyses des profils protéiques
1. Analyse Gene Ontology avec Panther
1. 1. Classes de protéines
1. 2. Processus biologiques
2. Réseaux d’interactions
3. Analyse quantitative des protéines dans les trois stades de développement
V. Discussion, Conclusion et Perspectives
Discussion
Construction des profils protéiques
Analyse des profils protéiques
Implications des protéines du cycle cellulaire
L’apoptose, ROS et réparation de l’ADN
Protéines différemment abondantes entre les stades
Surexpression de protéines associées au calcium
Protéines associées à la glycolyse et au métabolisme des glucides
Régulation de la PKA
Conclusions et perspectives
VI. Bibliographie
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