Électrophorèse bidimensionnelle

Électrophorèse bidimensionnelle 

Introduction 

La technologie DIGE est une évolution de la technique bien connue de l’électrophorèse bidimensionnelle. Cette évolution, qui permet le multiplexage de plusieurs populations protéiques au sein d’un même gel, est simplement basée sur l’utilisation d’un marquage en fluorescence. À l’exception de ce nouveau type de marquage, une expérience DIGE repose sur les mêmes principes qu’une expérience d’électrophorèse bidimensionnelle classique. Afin de mieux cerner les caractéristiques et les problématiques dont la DIGE a hérité, il est donc nécessaire, dans un premier temps, de s’intéresser aux principes de l’électrophorèse bidimensionnelle classique.

Électrophorèse bidimensionnelle et protéomique

L’électrophorèse bidimensionnelle est l’un des outils fondamentaux de la protéomique, un domaine scientifique récent qui complète et enrichit la génomique. En effet, les récents développements dans le domaine de la génomique ont fourni une grande quantité d’informations faisant le lien entre les activités des gènes et certaines pathologies et en permettant d’obtenir les séquences théoriques des protéines, accessibles dans des bases de données publiques depuis le séquençage complet du génome humain. Cependant, comme le soulignent M.R. Wilkins et al, pionniers de la protéomique [59], l’information sur la séquence des gènes ne permet pas de connaître précisément l’abondance d’une protéine ni sa structure finale ou son activité. En effet, pour un génome de mammifères, un seul gène peut coder en moyenne jusqu’à 6 familles de protéines ce qui rend le protéome beaucoup plus complexe que le génome. Par ailleurs, les progrès de la technique de spectrométrie de masse permettent aujourd’hui l’analyse de grosses molécules comme les protéines. Les protéines sont directement impliquées dans les processus biochimiques normaux et pathologiques. C’est pourquoi, l’étude des protéines présentes dans les tissus ou les cellules pathologiques, permet une meilleure compréhension de la maladie. Il s’agit là du principe de base de l’analyse protéomique dont les résultats, tant pour la biologie que la clinique, sont potentiellement immenses [60]. La première étape d’une étude protéomique est la collecte des échantillons d’origine clinique, végétale ou de culture. Après l’extraction des protéines à partir de ces échantillons, les protéines sont prétraitées : la solubilisation, la dénaturation et la réduction permettent de supprimer toute interaction potentielle entre les protéines et d’éliminer tout le contenu non protéique. L’étape suivante consiste à séparer le maximum de protéines présentes afin de les identifier et de les quantifier.

L’électrophorèse bidimensionnelle sur les gels de polyacrylamide (voir Figure 1) est, à l’heure actuelle, la seule méthode permettant la séparation et la quantification simultanée de plusieurs milliers de protéines (jusqu’à 10000 protéines [29]). Elle reste, depuis plus de 20 ans, la méthode la plus résolutive pour la séparation des protéines, malgré l’émergence de nombreuses techniques concurrentes [45]. Bien que de récentes avancées en matière de spectrométrie de masse, en particulier celles basées sur l’utilisation de marqueurs isotopiques stables (ICAT : Isotope Coded Affinity Tags), soient prometteuses, l’électrophorèse bidimensionnelle reste une méthode de choix, beaucoup moins onéreuse, pour l’étude de l’expression différentielle des protéines entre différents échantillons.

Principes de l’électrophorèse bidimensionnelle 

L’exploration du protéome nécessite de pouvoir extraire le maximum de polypeptides d’un échantillon donné.  l’électrophorèse bidimensionnelle répond à cette nécessité grâce à une double séparation correspondant à deux caractéristiques physico chimiques intrinsèques de chaque protéine : son point isoélectrique et sa masse moléculaire. Ces caractéristiques sont exploitées grâce à la migration des protéines, induite par un champ électrique, sur un gel de polyacrylamide.

Première dimension : l’électrofocalisation (IEF) 

La première dimension de l’électrophorèse bidimensionnelle permet de séparer les protéines suivant leur point isoélectrique (pI). C’est l’étape d’électrofocalisation, réalisée au laboratoire de protéomique de bioMérieux, grâce au « Protean IEF Cell », un instrument dédié, développé par le constructeur Bio-Rad . Les protéines sont des molécules amphotères, elles peuvent être chargées positivement, négativement ou ne pas avoir de charge selon le pH de la solution dans laquelle elles se trouvent. La charge nette d’une protéine est la somme des charges négatives et positives de ses extrémités et des chaînes latérales des acides aminés qui la composent. Le point isoélectrique correspond au pH où la charge nette de la protéine est égale à 0. Les protéines sont chargées positivement à pH inférieur à leur pI et négativement à pH supérieur.

En solution, les protéines sont chargées et lorsqu’on les soumet à un gradient de pH, sous l’influence d’un champ électrique :
− les protéines chargées positivement migrent, à travers le gradient de pH, vers la cathode en perdant, au fur et à mesure, leurs charges positives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu’elles atteignent leur pI.
− les protéines chargées négativement migrent, à travers le gradient de pH, vers l’anode en perdant, au fur et à mesure, leurs charges négatives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu’elles atteignent leur pI. Si elles diffusaient au-delà de ce point isoélectrique, elles seraient à nouveau chargées et elles reviendraient à cette valeur.

Deuxième dimension : le « SDS-PAGE » 

Dans la seconde dimension, orthogonale à la première, les protéines sont séparées selon leur masse relative ( M r ). Le matériel utilisé au laboratoire de protéomique de bioMérieux est le « Protean Plus Dodeca » développé par le constructeur BioRad .

Lors d’une électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE), en présence de sodium dodecylsulfate (SDS), la migration n’est pas déterminée par les charges électriques des protéines mais par leur poids moléculaire. Le SDS est un agent anionique qui se fixe sur les protéines, masquant la charge propre des protéines, en formant un complexe anionique ayant une charge nette négative.  le gel de polyacrylamide sert de tamis moléculaire.

Ainsi, la séparation des protéines se fera exclusivement en fonction de leur poids moléculaire. La distance de migration du polypeptide-SDS est proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire et varie en fonction de la concentration en polyacrylamide du gel. Le gel est réalisé de manière à présenté un gradient de cette concentration suivant l’axe des ordonnées qui sera l’axe des valeurs de masse moléculaire et une concentration constante suivant l’axe des abscisses. Le gradient de concentration constitue un véritable tamis, retenant les molécules de forte masse moléculaire sur le haut du gel, en début de migration et les protéines de masse inférieure, dans la partie basse du gel, en fin de migration. C’est donc ce gradient qui, associé au champ électrique appliqué, va définir le chemin de migration des protéines. C’est pourquoi le gradient de concentration en polyacrylamide doit être le plus régulier et le plus répétable possible et le champ électrique le plus homogène malgré les fuites de courant déjà évoquées. Dans la réalité des manipulations en laboratoire la perfection n’est jamais atteinte et les chemins de migration subissent une déformation qui peut être amplifiée par la déformation physique du gel lors de l’acquisition des images. Le gel n’est en effet pas une matière rigide et l’assèchement inhomogène de sa surface peut entraîner des contractions locales.

Table des matières

I. LEXIQUE
II. INTRODUCTION ET CONTEXTE
III. PROBLÉMATIQUE
IV. ÉTAT DES LIEUX DE LA TECHNOLOGIE DIGE
IV.1 Électrophorèse bidimensionnelle
IV.1.1 Introduction
IV.1.2 Électrophorèse bidimensionnelle et protéomique
IV.1.3 Principes de l’électrophorèse bidimensionnelle
IV.1.3.1 Première dimension : l’électrofocalisation (IEF)
IV.1.3.2 Deuxième dimension : le « SDS-PAGE »
IV.1.3.3 Marquage des protéines
IV.1.4 Applications de l’électrophorèse bidimensionnelle
IV.1.5 Considérations générales sur les images de gels d’électrophorèse bidimensionnelle
IV.2 La DIGE : électrophorèse bidimensionnelle différentielle
IV.2.1 Principe de la technologie DIGE
IV.2.2 Acquisition des images issues de la technique DIGE à l’aide d’un système d’imagerie à fluorescence
IV.2.3 Avantages, applications et limitations de la DIGE
IV.3 Méthodes de la littérature pour l’exploitation de la technologie DIGE
IV.3.1 Introduction
IV.3.2 Prétraitement des images
IV.3.2.1 Suppression du bruit
3.2.1.1 Suppression du bruit de haute fréquence spatiale
a) Filtrage linéaire
b) Filtrage non linéaire
3.2.1.2 Suppression du bruit de basse fréquence spatiale
IV.3.2.2 Amélioration du contraste et manipulation de l’histogramme
IV.3.2.3 Correction de la distorsion de l’image
IV.3.3 Analyse des images
IV.3.3.1 Observation et caractérisation des taches protéiques
3.3.1.1 Considérations générales sur la forme des taches protéiques
3.3.1.2 Situations particulières
3.3.1.3 Modélisation des taches protéiques
IV.3.3.2 Détections des taches protéiques
IV.3.3.3 Mise en correspondance inter-images des taches protéiques
3.3.3.1 Définition de la mise en correspondance des taches protéiques (matching)
a) Entre deux gels
b) Au sein d’un groupe de gels
3.3.3.2 La transformation affine
3.3.3.3 La transformation polynomiale
3.3.3.4 Splines de type plaque mince (Thin-Plate Splines)
3.3.3.5 Modélisation physicochimique
3.3.3.6 Approche basée sur les graphes de voisinage
3.3.3.7 Approche statistique
IV.3.4 Analyse des données pour l’évaluation de l’expression différentielle
IV.3.4.1 Normalisation
3.4.1.1 Normalisation par auto-cohérence (« self-consistency »)
a) Méthode globale
b) Régression linéaire
c) Correction LOWESS
3.4.1.2 Deuxième famille : normalisation à partir d’éléments de contrôle inclus dans l’expérience
a) Référence interne
b) Dye-Swap
IV.3.4.2 Analyse différentielle
IV.3.5 Méthode de validation biologique
IV.4 L’outil informatique
IV.4.1 Introduction
IV.4.2 Évaluation du logiciel MELANIE IV
IV.4.2.1 Évaluation de la détection des spots
IV.4.2.2 Évaluation de la mise en correspondance des gels
IV.4.2.3 Évaluation de la quantification des taches protéiques
IV.4.3 Autres solutions logiciels
IV.4.4 Conclusion
IV.5 Bilan de l’état des lieux
V. ÉLABORATION D’UN PROCÉDÉ D’EXPLOITATION OPTIMAL DE LA TECHNOLOGIE DIGE
V.1 Introduction
V.2 Définition du cahier des charges
V.2.1 Introduction
V.2.2 Les attentes des biologistes
V.2.3 Les grandes étapes du traitement
V.2.4 Les moyens à disposition pour l’analyse et les contraintes afférentes
V.3 Mise en place du processus de traitement « ProDIGE »
V.3.1 Les problématiques à résoudre
V.3.2 Aspects stratégiques de l’analyse
V.3.3 Justification et description des méthodes à chaque étape du traitement
V.3.3.1 Prétraitement des images
3.3.1.1 Filtrage des images
3.3.1.2 Alignement des images
V.3.3.2 Fusion des images
3.3.2.1 Égalisation des images avant fusion
3.3.2.2 Algorithme de fusion des images
V.3.3.3 Analyse des images : comparaison de différentes approches
3.3.3.1 Présentation des approches concurrentes
a) Approche Classique
b) Approche par patron de détection commun intra-gel
c) L’approche par patron de détection commun inter-gels
d) Approche par logiciel dédié (Progenesis)
3.3.3.2 Principe de la comparaison
3.3.3.3 Jeu de données utilisé pour la comparaison
3.3.3.4 Résultats et discussion
V.3.3.4 Normalisation des données
V.3.3.5 Fouille des données
3.3.5.1 Méthode de régulation de la variance
3.3.5.2 Méthode alternative : estimation d’une « courbe enveloppe »
VI. CONCLUSION

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