ÉLECTROPERMEABILISATION D’UN MODELE TISSULAIRE CUTANE RICHE EN MATRICE EXTRACELLULAIRE

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Electrotransfert de gène : questions en suspend

La thérapie génique est définie comme l’introduction de matériel génétique dans les cellules cibles. Différents objectifs peuvent être envisagés en thérapie génique:
• Corriger la fonction défectueuse en fournissant un gène fonctionnel aux cellules. Il peut s’agir de corriger le défaut de fonction en apportant la protéine manquante comme par exemple dans les maladies monogéniques telles que la mucoviscidose (dérèglement de la protéine CFTR, Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator, due à une mutation).
• Transférer un gène codant pour une protéine thérapeutique, afin de traiter, prévenir ou ralentir la progression de certaines maladies. Les cellules cibles peuvent par exemple être utilisées pour l’expression des protéines thérapeutiques pour des facteurs de croissance (maladies cardiovasculaires : VEGF) ou comme source d’antigène pour la vaccination génétique (vaccin ADN).
• Introduire un gène conduisant à la mort cellulaire. Les cellules cibles pouvant par exemple directement exprimer un gène apoptotique introduit.
• Introduire un ARN anti-sens inhibant la formation d’une protéine ou la réplication d’un virus. Par exemple pour réduire la charge virale de patients infectés par le VIH en traitant les lymphocytes T avec un ARN antisens bloquant l’ARNm de l’enveloppe virale du VIH.
Le transfert de gène, par définition, est un processus par lequel des copies d’un gène sont insérer dans des cellules vivantes afin qu’il soit exprimé. Pour cela le gène d’intérêt doit parvenir à sa zone cible : le cytosol pour les ARNm et le noyau pour les ADN. Le développement clinique de la thérapie génique nécessite l’utilisation de méthodes sûres et efficaces pour administrer des gènes thérapeutiques aux cellules cibles. Les gènes sont le plus souvent transfectés sous forme d’ADN plasmidique qui contient les séquences nécessaires à l’expression en plus du gène d’intérêt lui-même. Le gène d’intérêt thérapeutique est inséré dans un plasmide bactérien et il est soit directement injecté dans les tissus ou dans les organes soit injecté par voie intraveineuse (Wolff, Dowty et al. 1992). Contrairement aux vecteurs viraux, les vecteurs plasmidiques sont non-immunogènes car ils sont entièrement composés d’ADN double brin sans protéines associées susceptibles d’activer le système immunitaire. Cependant certaines séquences des vecteurs plasmidiques dites CPG peuvent être détectées par les cellules dendritiques ou natural killer. Quatre obstacles majeurs, qui sont représentés dans la figure 10, doivent être franchis localement par le plasmide avant qu’il puisse être exprimé par la cellule cible: (1) la diffusion dans le milieu extracellulaire et la matrice extracellulaire, (2) la membrane plasmique qui empêche le franchissement des grosses molécules chargées négativement, (3) la dégradation dans le cytoplasme, (4) le passage de la membrane nucléaire pour pénétrer dans le noyau (Escoffre, Teissie et al. 2010).

Structure, organisation et fonction de la matrice extracellulaire

Les tissus conjonctifs forment les structures de support du corps. Ils sont parfois classifiés dans un éventail allant de tissus lâches (l’adventice des vaisseaux sanguins, le tissu adipeux) à denses (les tendons, le cartilage, les os). En bref, ce sont tous les tissus du corps sauf les épithéliums, les muscles et le tissu nerveux. Dans ces tissus, l’espace extracellulaire est occupé par la matrice extracellulaire. Elle est constituée d’un réseau complexe très organisé de macromolécules en contact étroit avec les cellules. Les constituants de la matrice extracellulaire sont essentiellement synthétisés et secrétés localement par différentes cellules résidentes dont en premier lieu les fibroblastes (Tracy, Minasian et al. 2016). Le contact direct de la matrice extracellulaire avec les cellules en fait un régulateur important des comportements cellulaires, elle joue en effet un rôle essentiel dans l’architecture tissulaire, mais aussi dans des processus variés tels que :
• La régulation des fonctions cellulaires (différenciation, prolifération, mobilité cellulaire, ect…)
• La cohésion et association des cellules pour former un tissu cohérent
• La résistance mécanique dans certains tissus comme les os, les parois des artères, les tendons et les ligaments
• Le stockage de molécules biologiquement actives
La matrice extracellulaire est présente à tous les niveaux de l’organisme, mais son abondance et sa composition varient selon les tissus. Chaque tissu possède ses propres caractéristiques biologiques, fonctionnelles et morphologiques. Cette diversité est essentiellement due à la nature des cellules, à la composition moléculaire de la matrice extracellulaire, à la proportion relative entre cellules et matrice extracellulaire dans les tissus (Schlie-Wolter, Ngezahayo et al. 2013).
Ces réseaux complexes se construisent et se spécialisent au cours du développement, et leur composition évolue en fonction de différentes situations physiologiques (croissance) ou pathologiques (fibroses, cicatrisation). Ce renouvellement permanent est le résultat de l’équilibre entre la synthèse de ses constituants et leur dégradation par des enzymes spécialisées. La rupture de cet équilibre conduit à des pathologies soit par accumulation de matrice, c’est le cas des fibroses, soit par destruction comme l’arthrose ou l’emphysème pulmonaire (Cox and Erler 2011). Quel que soit le type de matrice, il est possible d’y répertorier quatre classes de molécules distinctes biochimiquement. Tout d’abord, les protéines fibreuses qui s’organisent en fibres responsables de la structure (collagènes) et de l’élasticité des tissus (élastine). Ensuite, les protéoglycanes qui forment des gels hydratés comblant les interstices entres les fibres et les cellules, assurent une résistance aux forces de compression et servent de réservoir aux molécules biologiquement actives. Puis, les glycoprotéines intervenant dans l’adhérence et la cohésion des tissus, et enfin les autres protéines associées que sont les facteurs de croissance et les enzymes (Labat-Robert, Bihari-Varga et al. 1990) (Figure 11).

Les protéines fibreuses : organisation structurale et élasticité de la matrice

Cette catégorie regroupe l’ensemble des protéines matricielles qui peuvent former des structures fibrillaires. Il existe deux types de protéines fibreuses : celles qui forment des fibres structurelles qui interviennent dans l’organisation structurale ont un rôle de soutien mécanique et confèrent la résistance au tissu, et celles qui forment des fibres élastiques qui confèrent l’élasticité au tissu.

Les collagènes

Les collagènes sont les protéines les plus abondantes du corps et correspondent à environ 6% du poids du corps et 30% en masse des protéines totales des mammifères (Ricard-Blum 2011). Ils sont localisés dans les tissus conjonctifs qu’ils contribuent à structurer et sont un constituant majeur de la matrice extracellulaire. A ce jour, il est recensé plus d’une vingtaine de membres dans la famille des collagènes, classés dans 8/9 familles (Tableau 2).

Fibres élastiques

Un réseau de fibres élastiques présent dans la matrice extracellulaire est responsable de l’élasticité des tissus. Elles sont retrouvées très abondamment dans les tissus tels que les ligaments, les muscles ou la paroi des vaisseaux sanguins. Les constituants principaux des fibres élastiques sont une composante microfibrillaire et l’élastine. C’est l’élastine qui confère aux fibres élastiques leur élasticité et permet par exemple à la peau de reprendre sa position d’origine après étirement. La partie microfibrillaire de la fibre élastique est principalement composée de fibrilline (Weihermann, Lorencini et al. 2016).
L’élastine est traditionnellement décrite comme un polymère hydrophobe qui est totalement insoluble dans l’eau. L’élastine s’assemble via la réticulation dans l’espace extracellulaire des molécules de tropo-élastine, précurseur soluble de l’élastine, synthétisées et sécrétées sous forme de monomères hydroxylés par les fibroblastes. La molécule de tropoélastine est sécretée dans le proche voisinage d’une fibre élastique en cours de construction afin de permettre le contact étroit avec la composante microfibrillaire de la fibre. Une famille d’enzyme des lysyl oxydases (LOXs) vont modifier des résidus lysine de la tropoélastine et le monomère activé va interagir avec les microfibrilles pour être intégré dans la fibre élastique en formation. Ces fibres peuvent être étirées jusqu’à 100‐120% de leur longueur initiale et peuvent retourner à leur état d’origine après relaxation (Figure 16).

Les polysaccharides matriciels : résistance de la matrice et réservoir de molécules bioactives

Les polysaccharides matriciels composent ce qui est communément appelée la substance fondamentale dans les tissus conjonctifs. C’est un matériau sans forme définie qui comble les espaces entre les cellules et qui retient les fibres. Elle est composée entre autre de liquide interstitiel, de protéines d’adhérence (glycoprotéines) et de protéoglycanes.
Les protéoglycanes (PGs) sont composés de deux molécules basiques: la protéine cœur (core) et les glycosaminoglycanes (GAGs) (Figure 17). Les protéines cœur sont riches en acides aminés comme la sérine et la thréonine, ces résidus agissent comme un point d’attachement auquel se lient les différents GAGs pour donner naissance à une structure semblable à une brosse. Les GAGs constituent environ 95% du poids des protéoglycanes qui ressemblent davantage à des polysaccharides qu’à des protéines.
Les GAGs sont constitués de l’enchaînement d’unités disaccharidiques. Il en existe quatre types: la chondroïtine sulfate (CS), l’héparane sulfate (HS), la dermatane sulfate (DS) et la kératane sulfate (KS). Les GAGs de type HS, CS, DS et KS sont toujours sulfatés et liés à une protéine centrale et donc toujours retrouvés sous forme de protéoglycanes. L’acide hyaluronique est la seule famille de GAG non-sulfaté qui est retrouvée sous une forme non liée covalemment à une protéine (Gandhi and Mancera 2008). Les protéoglycanes, très abondant dans la peau, forment un gel très hydraté qui confère au derme une grande résistance aux forces de compression.
Des GAGs de différente nature peuvent se lier à une même protéine cœur et former des complexes macromoléculaires de taille variable. Ces protéoglycanes peuvent ainsi être classés par rapport à la longueur et la composition de la protéine cœur et aussi en fonction du nombre de ramification et la composition des GAGs qu’ils possèdent. Les protéoglycanes les plus répandus sont la décorine (chondroïtine-sulfate/dermatane-sulfate) présente dans tous les tissus conjonctifs et en particulier dans la peau, le perlecan (héparane-sulfate) retrouvé dans les membranes basales, et l’agrécane abondant dans le cartilage.
La diversité de composition de la chaîne protéique et des GAGs confère aux protéoglycanes des fonctions biologiques et structurales variées. Les protéoglycanes assurent la régulation des échanges moléculaires en se liant par exemple au collagène par leur axe protéique et aux glycoprotéines de structure par les chaînes polysaccharidiques, organisant et orientant la matrice extracellulaire et la migration des cellules conjonctives. La très forte densité de groupements chargés négativement (sulfate et carboxyle) confère aux GAGs la propriété de retenir de grandes quantités d’eau et aussi la capacité de piéger de nombreuses cytokines et d’en moduler la biodisponibilité. Si la majorité de ces polysaccharides est retrouvée sous forme libre dans la matrice extracellulaire, il existe également des catégories de polysaccharides qui sont membranaires tels que les syndécanes (protéoglycanes à héparanes sulfates) (Gandhi and Mancera 2008).

Les glycoprotéines: cohésion de la matrice

Parmi les molécules constituantes de la matrice extracellulaire, il existe une sous‐catégorie complexe qui permet l’interaction entre les différents composants de la matrice et assurent la cohésion des tissus : les glycoprotéines. Les glycoprotéines de structure comme la fibronectine ou la laminine sont particulièrement impliquées dans les phénomènes d’adhésion entre les cellules et des composants de la matrice extracellulaire tels que les collagènes, les protéoglycanes et l’élastine.
Les glycoprotéines sont constituées elles aussi de complexes protéines-polysaccharides. Les glycoprotéines se distinguent des protéoglycanes par la quantité et la disposition de leurs chaînes latérales de sucre. En effet, les glycoprotéines contiennent entre 1 et 60% de glucides sous forme de chaînes courtes d’oligosaccharides ramifiés, tandis que les protéoglycanes peuvent contenir jusqu’à 95% de glucides, sous forme de longues chaînes de GAGs non ramifiées. Ces protéines sont dites complexes de par leur haut poids moléculaire (plusieurs milliers de Da) et de par leur structure organisée en module individuel. Au sein de ces modules se trouvent des séquences en acides aminés qui permettent à la molécule de se lier à d’autres protéines et/ou de s’auto‐assembler pour former un réseau complexe. La fibronectine, une des principales glycoprotéines, possède par exemple des domaines de liaison reconnus par les intégrines membranaires (Figure 18). Elle joue un rôle fondamental dans les interactions cellule/matrice extracellulaire et dans la migration cellulaire ainsi que la prolifération et la différenciation. La vitronectine est une glycoprotéine présente dans le plasma qui est déposée sous forme fibrillaire dans les tissus. Elle se lie généralement aux protéoglycanes de la matrice extracellulaire et peut s’associer aux fibres élastiques. Enfin les laminines sont les composants non collagéniques majoritaires des lames basales. Elles présentent des sites de liaisons au collagène, à l’héparine et aux cellules (Mouw, Ou et al. 2014).
En plus de former des réseaux, ces glycoprotéines ont la possibilité de lier des facteurs de croissance et participent donc au rôle de réservoir de facteurs de croissance de la matrice extracellulaire.

Les enzymes associées à la matrice

Les enzymes agissent sur la réorganisation de la matrice extracellulaire en la modifiant (dégradation et pontage). Les matrices extracellulaires sont en renouvellement constant et subissent de profonds remaniements au cours de phénomènes biologiques ou pathologiques comme le développement embryonnaire, la cicatrisation, le cancer ou l’athérosclérose.
Les enzymes associées à la matrice sont de deux sortes : les enzymes liantes ou ligases (lyases) et les enzymes dégradantes dont les protéases.
Les enzymes liantes ont pour fonction première de lier covalemment les molécules entre elles afin de renforcer les réseaux formés dans la matrice. Parmi ces enzymes se trouvent la transglutaminase et la lysyl-oxydase qui peuvent ponter les fibres de collagène et de fibrilline (Ricard-Blum 2011).
Les molécules extracellulaires peuvent être dégradées par de nombreuses enzymes catalytiques qui ont des modes d’actions variés dépendants de l’activité de leur site actif (Wolf and Friedl 2011). Les enzymes catalytiques ont plusieurs rôles dont celui de permettre le renouvellement de la matrice tout en frayant un chemin pour la migration des cellules au sein de cette matrice. Ces enzymes ont également un rôle important dans les processus de modifications post‐ traductionnelles des molécules indispensables à l’organisation des molécules dans les réseaux de la matrice extracellulaire. Elles permettent ainsi aux précurseurs d’acquérir leur forme « active » avec notamment le clivage des pro‐MMPs en MMPs et des pro‐collagènes en collagènes. Enfin, le clivage des protéines de la matrice extracellulaire peut également engendrer des peptides biologiquement actifs appelés matrikines (Ricard-Blum and Salza 2014). Le clivage de la laminine-5 par la MMP-2 en est un exemple. Il engendre un fragment de la chaîne γ2 qui stimule la migration cellulaire. Par leurs actions protéolytiques sur les molécules matricielles, les MMPs peuvent avoir une activité protéolytique très spécifique qui provoque la libération des facteurs de croissance stockés dans la matrice extracellulaire et agissent ainsi sur le phénotype cellulaire. Par exemple, la dégradation du perlécane par la MMP-1 ou la MMP-3 entraîne la libération de FGF (fibroblast growth factor) tandis que le clivage de la décorine par les MMP-2, 3 ou 7 conduit à la libération de TGF-β (transforming growth factor β) (Feige and Baird 1992). D’autres groupes de MMPs ont pour fonction de cliver d’autres protéines de la matrice extracellulaire (stromélysine, metallo-élastase du macrophage, MMP de type membranaire et d’autres non classées) (Page-McCaw, Ewald et al. 2007).
L’activité des MMPs est régulée par des inhibiteurs tissulaires endogènes spécifiques, les TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases). Les TIMPs forment des complexes de haute affinité avec les formes actives des MMPs via une multiplicité de sites d’interactions. Ils inhibent ainsi l’action catalytique exercée par différents groupes de MMPs. Les TIMPs sont synthétisés par les mêmes cellules qui produisent les MMPs : par exemple TIMP-1 et -2 sont synthétisés par les cellules mésenchymateuses, par les cellules tumorales, par les cellules endothéliales et les fibroblastes. L’activité des MMPs est basée sur l’équilibre entre l’activation des pro-MMP et l’inhibition par les TIMPs (Brew and Nagase 2010).
En conclusion, la matrice extracellulaire n’est pas un échafaudage dans lequel s’insèreraient les cellules, mais plutôt une structure dynamique qui joue un rôle fondamental dans la structure et la fonction des organes humains. Les tissus conjonctifs sont variés (tendons, derme, os, cartilage, …), mais dans tous ces tissus la masse est principalement constituée par la matrice extracellulaire, les cellules produisant cette matrice étant dispersées sporadiquement au sein du tissu. Les différents types de tissus conjonctifs doivent leurs caractères spécifiques à la composition à la fois quantitative et qualitative en collagènes. En fonction du type de collagène, de sa quantité, et des autres molécules (protéoglycanes entre autres) qui s’entrecroisent, le tissu aura des propriétés différentes.
Dans le cadre du transfert d’acides nucléiques, il est important de retenir que dans les tissus conjonctifs les cellules ne sont pas aussi accessibles que dans les autres tissus, notamment épithélial ou musculaire. En fonction de la densité du maillage de cette matrice et de sa composition la progression des acides nucléiques vers les cellules sera plus ou moins aisée. A la barrière physique constituée par cet enchevêtrement de molécules il faut ajouter la présence de nombreuses charges négatives au niveau du maillage, dûes aux GAG, qui peut également perturber le déplacement des molécules au sein du tissu. En effet les acides nucléiques sont chargés négativement et auront tendance à être repoussés.

La peau : un organe riche en matrice extracellulaire Physiologie et structure de la peau

La peau est un organe complexe recouvrant en moyenne une surface de 1,5 à 2 m² du corps. Son poids totalise environ 15 % du poids total du corps adulte, ce qui lui vaut le titre du plus grand organe du corps humain. La peau possède de nombreuses fonctions impliquées principalement dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et notamment dans la thermorégulation, la défense contre les agressions extérieures (physiques, chimiques et biologiques). Elle joue également un rôle dans les fonctions sensorielles et métaboliques telles que la synthèse de vitamine D.
La peau est composée de trois couches distinctes qui interagissent ensemble afin d’assurer les différentes fonctions de la peau: l’épiderme, le derme et l’hypoderme (Figure 19).

Ingénierie tissulaire

Du 2D au 3D

La culture in vitro de cellules permet aux chercheurs d’étudier l’activité cellulaire, de modéliser et d’évaluer l’effet de nouvelles molécules et ainsi de faire avancer le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les conditions environnementales, qui jouent un rôle crucial sur la structure, la physiologie et le comportement cellulaire, sont largement différentes in vitro et in vivo. L’interaction et la communication des cellules entre elles et d’une cellule avec son environnement extérieur détermine si elle va se diviser, se déplacer, se différencier ou mourir. Dans les systèmes biologiques, ces interactions se produisent principalement via les interactions cellule-cellule, cellule-matrice et récepteur-ligand. Dans de nombreux cas, ces interactions déclenchent des voies de signalisation spécifiques qui ont un effet sur le devenir cellulaire environnant. La compréhension des interactions des cellules avec leur environnement extracellulaire permet d’élaborer des modèles qui imitent efficacement les tissus in vivo.
L’ingénierie tissulaire est une discipline à l’interface entre les sciences de l’ingénieur et les sciences biologiques qui présente un double objectif : d’une part, celui de maintenir, réparer ou reconstruire des tissus ou organes et, d’autre part, celui d’obtenir des cultures cellulaires en 3D, qui sont des modèles in vitro mimant mieux le phénotype in vivo que leurs équivalents en 2D (monocouches) (Langer and Vacanti 1993). Ces nouvelles techniques d’ingénierie tissulaire permettent d’étudier des phénomènes dans un tissu plus complexe et de sélectionner des conditions d’études expérimentales ce qui permet de réduire la quantité d’animaux utilisés dans un processus de recherche. Ces méthodes sont donc en accord avec la règle éthique des 3R (réduire, raffiner et remplacer). Le plus grand défi de l’ingénierie tissulaire est donc de produire in vitro des modèles qui sont représentatifs de la situation existant in vivo.

Modèles de l’ingénierie tissulaire Le modèle sphéroïde

La culture de cellules cancéreuses dans des conditions non adhérentes permet de produire des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels in vitro (Achilli, Meyer et al. 2012). La génération de sphéroïdes est basée sur une approche d’organogénèse qui utilise la capacité intrinsèque des cellules à adhérer entre elles et permet de produire une structure en 3D sans ajouter de matériaux exogènes (Whitesides and Grzybowski 2002). Il a été démontré que les sphéroïdes tumoraux 3D reflètent plus précisément les réponses des tumeurs humaines que les cultures simples de cellules 2D, en particulier en ce qui concerne la sensibilité aux médicaments. En effet, généralement les cellules tumorales cultivées en 3D présentent une augmentation significative de la résistance aux médicaments par rapport à celles cultivées dans des cultures monocouches 2D. Par exemple, dans les modèles sphéroïdes de cancer colorectal (Roberts, Williams et al. 2009) et de cancer du pancréas (Dufau, Frongia et al. 2012) une réduction de la réactivité aux agents anti-tumoraux a été observée par rapport aux mêmes cultures en monocouche.
La croissance des sphéroïdes s’accompagne de la mise en place d’un gradient d’oxygène décroissant de la périphérie vers le centre qui fait apparaître une région hypoxique au centre du sphéroïde. Parallèlement au gradient d’oxygène, un gradient de glucose et de facteurs de croissance se met en place, tandis qu’un gradient de métabolites se fait dans le sens inverse (Sutherland 1988; Hirschhaeuser, Menne et al. 2010) (Figure 22). La mise en place des gradients d’oxygène et de nutriments a pour conséquence l’établissement d’un gradient de cellules prolifératives. En effet, les cellules en prolifération sont localisées à la périphérie où l’oxygène et le glucose ne sont pas limitant (Sutherland 1988). Plus on s’éloigne de la surface, plus les cellules entrent en quiescence. Lorsque les cellules sont privées d’oxygène et de nutriments, elles entrent dans un processus de mort cellulaire, conduisant à l’apparition d’un cœur nécrotique. L’ensemble de ces données montre que le modèle de sphéroïde permet de reproduire in vitro différents gradients présents au sein d’une tumeur, et mime ainsi efficacement la zone avasculaire des tumeurs in vivo (Sutherland 1988; Friedrich, Ebner et al. 2007; Mazzoleni, Di Lorenzo et al. 2009; Hirschhaeuser, Menne et al. 2010).
Figure 22: Sphéroïde tumoral (cancer colorectal humain) observé au microscope à champ large; Vue schématique d’un sphéroïde multicellulaire.
Enfin, l’utilisation de sphéroïdes limite considérablement le coût, le temps et les problèmes éthiques associés à l’utilisation de modèles précliniques animaux. Du point de vue de l’industrie pharmaceutique, il a été largement admis que l’intégration de sphéroïdes tumoraux dans le processus de développement de médicaments peut aider à sélectionner les candidats les plus prometteurs avant les essais cliniques.
Le modèle sphéroïde a été validé comme modèle d’étude pertinent pour les études sur l’électroporation (Wasungu, Escoffre et al. 2009; Chopinet, Wasungu et al. 2012; Marrero and Heller 2012; Gibot and Rols 2013). Ces études montrent que les effets des champs électriques sont plus proches de ceux observés in vivo que de ceux observés sur des monocouches en 2D. Même si les cellules au sein du sphéroïde peuvent être efficacement électroperméabilisées l’expression génique après électrotransfert est en revanche limitée aux couches cellulaires externes du sphéroïde (Wasungu, Escoffre et al. 2009; Chopinet, Wasungu et al. 2012).
Cependant, même si le modèle sphéroïde permet de reproduire in vitro les interactions cellule-cellule en 3D comme in vivo (Dolznig, Walzl et al. 2011; Amann, Zwierzina et al. 2014), la matrice extracellulaire n’est présente que sous forme de trace. Ce modèle n’est donc pas optimal pour étudier la réponse à l’électrotransfert de gène d’un tissu riche en matrice extracellulaire comme la peau.
Un substitut dermique humain reconstruit par ingénierie tissulaire
Le tissu le plus largement exploré par l’ingénierie tissulaire est la peau et plus particulièrement l’épiderme. En effet, des substituts cutanés de plus en plus sophistiqués ont été produits depuis plusieurs décennies afin de les greffer sur des patients grands brûlés dans le but d’améliorer leur taux de survie et leur qualité de vie. Une grande expertise a donc été développée dans la reconstruction de peau humaine d’une part pour le traitement des grands brulés et des plaies chroniques et d’autre part pour la recherche fondamentale dans le secteur du médicament et cosmétique (Shevchenko, James et al. 2009; Groeber, Holeiter et al. 2011). La principale différence entre les différents substituts disponibles est la composition du derme, basée sur l’utilisation d’une membrane artificielle, d’un gel de collagène, d’une éponge biodégradable ou d’un filet de nylon (Shevchenko, James et al. 2009).
Une approche alternative à la production d’un substitut cutané humain est la méthode d’auto-assemblage (Athanasiou, Eswaramoorthy et al. 2013). La méthode d’auto-assemblage repose sur la capacité des cellules à produire leur propre matrice extracellulaire lorsqu’elles sont stimulées, notamment par l’acide ascorbique aussi appelé vitamine C. Cette technique permet de produire in vitro une peau reconstruite humaine possédant un derme et un épiderme stratifié (Michel, L’Heureux et al. 1999; Auger, Pouliot et al. 2000; Athanasiou, Eswaramoorthy et al. 2013) (Figure 23).
La brique de base du substitut cutané reconstruit par la méthode d’auto-assemblage est le feuillet dermique. Lorsque des fibroblastes dermiques sont cultivés en monocouche pendant 4 semaines en présence d’acide ascorbique, ils produisent et organisent suffisamment de matrice extracellulaire pour produire un feuillet manipulable. Les feuillets sont ensuite empilés pour former un tissu plus épais puisqu’ils fusionnent rapidement après empilement. Pour produire le compartiment épidermique, il suffit d’ensemencer des kératinocytes humains sur un de ces feuillets dermiques. La culture à l’interface Air/Liquide assure la différenciation terminale des kératinocytes et produit donc un épiderme stratifié présentant l’architecture d’un épiderme natif (Pouliot, Larouche et al. 2002; Auger, Berthod et al. 2004) (Figure 24).
Cette méthode de production d’un substitut cutané complètement autologue et ne nécessitant l’usage d’aucun biomatériau exogène, qu’il soit synthétique ou naturel, a permis d’obtenir d’excellents résultats dans le cadre d’une étude in vivo sur un modèle animal (Pouliot, Larouche et al. 2002). Ces résultats montrent que l’utilisation de cette peau reconstruite permet de restaurer les fonctions dermiques et épidermiques de façon permanente et pourrait permettre d’éviter l’utilisation de peau cadavérique et de matériaux exogènes tout en favorisant une cicatrisation adéquate. Ce modèle de substitut cutané est aussi un modèle idéal pour la recherche fondamentale et les tests précliniques concernant des thématiques de recherche sur la peau.

Production des modèles tissulaires

Les sphéroïdes

Les sphéroïdes sont produits dans des plaques 96 puits « ULA, Ultra Low Attachment » à fond rond (Costar, Corning # 7007) afin d’empêcher l’adhésion des cellules au substrat (Figure 26). Une suspension de 5000 fibroblastes ou HCT-116 est déposée dans chaque puits. Les plaques sont centrifugées 10 minutes à 300g à 4°C, puis placées en atmosphère humide à 5% CO2 et à 37°C. Cette technique permet l’obtention d’un sphéroïde unique par puits, présentant une faible variation de taille avec un diamètre moyen, au bout de 5 jours, de 250 ± 50 µm pour les sphéroïdes de fibroblaste.

Le gel de collagène

Le gel de collagène est préparé sur la glace, en diluant une solution mère de collagène de type I (4,1 mg/mL, Corning # 354236) avec une solution de DMEM 10X (Sigma-Aldrich # RNBC9340). Le DMEM 10X contient du rouge phénol qui sert d’indicateur de pH. Une solution de sodium bicarbonate 7,5% (Gibco® # 25080-060) est ajoutée à la préparation pour ajuster le pH à 7,4. La solution est complétée avec de l’eau deionisée pour atteindre une concentration finale de gel de collagène à 2 mg/mL (Tableau 4). La solution est ensuite déposée dans les puits de labteck deux puits (Sarstedt # 94.6190.202) puis la polymérisation du gel de collagène s’effectue à 37°C pendant 45 minutes. Le gel est réhydraté avec du milieu de culture classique après polymérisation. Pour chaque test, le gel de collagène est fabriqué le jour de l’expérience. Le protocole appliqué ici a été fourni par Victor Laurent de l’équipe de Catherine Muller (microenvironnement, cancer et adipocytes) au sein de l’IPBS/CNRS.

Substitut dermique humain reconstruit par ingénierie tissulaire

Les substituts dermiques sont générés suivant l’approche d’auto-assemblage (F. A. Auger et al. 2000; Athanasiou et al. 2013). Un ancrage en papier filtre (Whatman™) préalablement découpé aux dimensions adéquates est disposé au fond de chaque puits d’une plaque 24 puits (Falcon # 353047). Les ancrages sont lavés plusieurs fois au PBS (Eurobio # CS51PBS01-01) pour éliminer les fibres issues du papier. L’ancrage papier permet d’éviter la contraction du tissu due aux propriétés contractiles des fibroblastes. Les fibroblastes dermiques humains primaires sont ensemencés à une densité de 15 000 cellules/cm2 dans les plaques 24 puits contenant les ancrages. Les cellules vont ainsi être cultivées pendant 4 semaines dans le milieu de culture cellulaire utilisé précédemment supplémenté de 50 µg/mL d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich # A4034-100G). Le milieu est changé trois fois par semaine, toujours avec un ajout d’acide ascorbique frais car ce dernier se dégrade rapidement et devient toxique. Après 4 semaines, les cellules ont sécrété suffisamment de matrice extracellulaire pour former un feuillet cellulaire manipulable (Figure 27).

Décellularisation des substituts dermiques

Deux méthodes différentes ont été sélectionnées pour décellulariser les feuillets dermiques. Le principe est de lyser les cellules tout en conservant l’intégrité de la matrice extracellulaire.
• Choc osmotique : Les feuillets frais sont plongés de 5 mL d’eau déionisée (MilliQ) puis stockés à 4 °C. La solution d’eau déionisée est changée 3 fois afin d’éliminer la majorité des débris cellulaires (Gilbert, Sellaro, and Badylak 2006). Dans le cadre de notre étude les feuillets dermiques sont conservés à 4°C pour 24h au maximum afin de conserver le même temps de culture entre les vivants et les décellularisés.
• Congélation/décongélation : Les feuillets frais sont plongés dans du PBS et subissent trois cycles successifs de congélation (-20°C pendant 20 minutes)/décongélation (37°C pendant 20 minutes) (Gilbert, Sellaro, and Badylak 2006). Les feuillets dermiques décellularisés par congélation/décongélation peuvent être conservés quelques mois à – 20°C mais pour les mêmes raisons que précédemment ils sont utilisés ici dans les 24h.

Caractérisation morphologique

Coloration histologique au trichrome de Masson sur cryosections

Le trichrome de Masson colore les cellules en rouge et les collagènes en bleu (Constantine and Mowry 1968). Les substituts dermiques sont fixés dans du formol (10%, Sigma-Aldrich # HT5011-15ML) à température ambiante pendant 1h, puis enrobés dans l’OCT (Cryomatrix, thermo scientific) et stockés à -80°C. Des cryosections de 6 µm d’épaisseur sont obtenues au cryostat (Leica CM1950). Les coupes sont séchées à température ambiante, puis rincées 5 minutes à l’eau déionisée pour éliminer l’OCT résiduel avant coloration au trichrome de Masson. Les coupes sont colorées selon le protocole du fournisseur (HT15-1KT, Sigma-Aldrich):
• Incubation 3 minutes dans la solution de Fucshine Biebrich Scarlet-Acid
• Lavage à l’eau courante
• Incubation 3 minutes dans la solution de Phosphotungstic / Phosphomolybdic Acid Solution
• Incubation 2 minutes dans la solution de Bleu Aniline.
• Bref lavage dans l’acide acétique 1% (VWR # 20104.298)
• Lavage à l’eau deionisée
• Déshydratation dans des bains successifs d’éthanol (70°,80°, 90°, 100°)
• Montage entre lame et lamelle avec une solution d’Eukitt (Fluka).
Les images sont acquises avec un microscope photonique Nikon Eclipse 80i avec un grossissement de x40.

Microscopie électronique à transmission (MET) et à balayage (MEB)

Pour la microscopie électronique à transmission, les substituts dermiques entiers ont été fixés pendant 4h à 4°C dans du tampon phosphate Sorensen 0,1 M (pH 7,4) contenant 2% de glutaraldéhyde. Ils sont ensuite lavés pendant une nuit dans du tampon phosphate 0,2 M, puis post-fixés pendant 1h à température ambiante avec 1% de tétroxyde d’osmium (OsO4) dans un tampon phosphate/saccharose (0,05 M/250 mM pH 7,4). Les échantillons sont ensuite déshydratés dans une série de solutions d’éthanol à degré croissant. Les feuillets sont ensuite séparés de leurs ancrages en papier puis découpés en lanières. Celles-ci sont imprégnées dans la résine d’inclusion Epon-araldite (Embed 812-Araldite 502). Enfin, des coupes ultra-fines obtenues par des techniques d’ultramicrotomie sont déposées sur une grille en cuivre et contrastées avec de l’acétate d’uranyle afin de visualiser et différencier les éléments intracellulaires. Les observations au microscope électronique à transmission ont été réalisées à la plateforme d’imagerie du CMEAB (Centre de microscopie électronique appliquée à la biologie (CMEAB) Plateforme Réseau Imagerie –Toulouse Réseau Imagerie TRI) sur un microscope électronique à transmission Hitachi HT7700.
Pour la microscopie électronique à balayage, les substituts dermiques entiers ont été fixés pendant 4h à 4°C dans du tampon phosphate Sorensen 0,1 M (pH 7,4) contenant 2% de glutaraldéhyde. Les échantillons sont ensuite déshydratés dans des solutions d’alcool de concentration croissante puis séchés par séchage en point critique avec l’automate Leica EMSCOPE CPD 300. L’alcool absolu est remplacé par du CO2 liquide qui sera éliminé par transition au point super critique (31,1°C ; 73,8 bars). Ce qui permet d’éliminer le liquide de l’échantillon tout en conservant sa structure macroscopique et microscopique. La surface des échantillons est ensuite métallisée par une couche de 4 à 10 nm de platine avec un évaporateur (Leica EMSCOPE MED020) avant observation. Les observations au microscope électronique à balayage ont été réalisées à la plateforme d’imagerie du CMEAB (Centre de microscopie électronique appliquée à la biologie (CMEAB) Plateforme Réseau Imagerie –Toulouse Réseau Imagerie TRI) sur un microscope électronique à balayage FEG FEI Quanta 250.
Pour les expériences de microscopies électroniques, toutes les étapes de préparation de l’échantillon hormis la fixation ont été réalisées par Isabelle Fourquaux sur la plateforme du CMEAB.

Détection des collagènes fibrillaires par génération de seconde harmonique (SHG)

Des Z-stacks tridimensionnels de 425 x 425 µm sont acquis à l’aide d’un microscope droit LSM 7MP à laser multiphotonique (Carl Zeiss SAS, Jena, Allemagne), équipé d’un objectif à immersion X20 (NA 0,95) et couplé à un laser Ti-Sapphire, Chameleon Ultra 2 (Coherent Inc) (Figure 28). Les dimensions d’acquisition en Z sont modulées (60 à 100 µm) afin d’intégrer toute l’épaisseur du feuillet dans les images. La longueur d’onde d’excitation est fixée à 800 nm afin de détecter les collagènes fibrillaires organisés par génération de second harmonique (SHG) à une longueur d’onde d’émission de 400 nm. Les échantillons sont observés directement dans le milieu de pulsation. Les filtres utilisés sont les suivant : SHG, Filtre d’émission LP 430 (BP 390-410 nm). Dans nos conditions de culture le gel de collagène ne peut être imagé avec le microscope droit sans risque de déplacer le gel avec l’objectif en immersion. Le microscope inversé multiphoton LSM 710 couplé au même laser que le LSM 7MP permet d’imager la SHG du gel de collagène.

Table des matières

I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1. Traverser la membrane plasmique
a. La membrane plasmique : une barrière sélective
b. Déstabilisation de la membrane plasmique par des impulsions électriques
c. Mécanismes
d. Applications médicales
e. Electrotransfert de gène : questions en suspend
2. Structure, organisation et fonction de la matrice extracellulaire
a. Les protéines fibreuses : organisation structurale et élasticité de la matrice
b. Les polysaccharides matriciels : résistance de la matrice et réservoir de molécules bioactives
c. Les glycoprotéines: cohésion de la matrice
d. Les enzymes associées à la matrice
e. La peau : un organe riche en matrice extracellulaire
3. Ingénierie tissulaire
a. Du 2D au 3D
b. Modèles de l’ingénierie tissulaire
9II. OBJECTIFS
III. MATERIEL ET MÉTHODES
Culture cellulaire
Production des modèles tissulaires
a. Les sphéroïdes
b. Le gel de collagène
c. Substitut dermique humain reconstruit par ingénierie tissulaire
d. Décellularisation des substituts dermiques
Caractérisation morphologique
a. Coloration histologique au trichrome de Masson sur cryosections
b. Microscopie électronique à transmission (MET) et à balayage (MEB)
c. Détection des collagènes fibrillaires par génération de seconde harmonique (SHG) 83
Application d’un champ électrique pulsé
a. Matériel utilisé
b. Tampon de pulsation
c. Paramètres électriques
d. Marqueur de perméabilité membranaire
e. Électropermeabilisation des substituts dermiques
f. Électrotransfert de gène
g. Marquage fluorescent de l’ADN et localisation dans le tissu
10h. Électroperméabilisation et suivi de température
Viabilité et prolifération
a. Viabilité cellulaire
b. Prolifération cellulaire
Détermination de l’activité des métalloprotéinases
Analyses statistiques
IV. ÉLECTROPERMEABILISATION D’UN MODELE TISSULAIRE CUTANE RICHE EN MATRICE EXTRACELLULAIRE
Le sphéroïde : un modèle 3D de tissu sain ou tumoral
Les outils de caractérisation de la matrice extracellulaire
a. La microscopie électronique à balayage
b. L’histologie
c. La génération de seconde harmonique
Conclusion : le sphéroïde
Le feuillet dermique, un modèle riche en matrice extracellulaire
a. Introduction
b. Publication
c. Conclusion

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