Electrochimie sur carbone vitreux de métabolites de P. aeruginosa et analyse de surnageants de culture

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Solubilité de PQS

La longue chaine alkyle de PQS rend sa solubilisation difficile. Dans la littérature, la solubilité trouvée est de seulement 4μM dans l’eau distillée et de 19μM dans le milieu de culture LB [31]. Ces valeurs sont faibles par rapport aux concentrations de PQS attendues en conditions réelles de culture : jusqu’à 323μM pour PA14 dans du LB après 8h de culture à 37°C [54]. En milieu de culture, ces valeurs sont atteintes car PQS est solubilisé par des protéines produites par la cellule (notamment les rhamnolipides) [53].
Lors de nos expériences, pour ne pas complexifier le milieu, nous avons choisi de ne pas rajouter d’adjuvant. La solubilité de PQS dans le PBS doit probablement être intermédiaire entre celle de l’eau distillée et celle du milieu LB. Lorsque la concentration de PQS dépasse de beaucoup la limite de solubilité, un précipité est observé. Concernant l’analyse électrochimique, la formation du précipité se traduit par l’apparition de nombreux pics redox supplémentaires (Figure 2-18) par rapport au signal de PQS une fois le précipité décanté. Il faut donc rester dans des concentrations proches de la solubilité de PQS pour avoir une mesure électrochimique propre et représentative. Figure 2-18 : Détection comparative en DPV de PQS 1mM en présence ou non de précipité.
Au cours de nos mesures, un manque de répétabilité sur la taille du pic de PQS sur GC a été observé (cf les barres d’erreurs allant jusqu’à 40% de la Figure 2-15) malgré les précautions prises pour réaliser la gamme de concentration. Pour mieux caractériser ce manque de répétabilité et comprendre son origine, plusieurs expériences ont été réalisées.
Pour la première, 40mL de solution contenant du PBS et 30μM de PQS a été préparée.
Cette solution a été répartie dans plusieurs béchers en Téflon. Des mesures ont été réalisées avec une électrode GC (polie avant chaque mesure) après différentes durées suivant la préparation de  la solution. Les voltampérogrammes obtenus montrent que l’intensité du pic de PQS varie considérablement à chaque mesure (Figure 2-19). Toutefois, une décroissance globale est observée au cours du temps après la préparation de la solution. Au bout de 2h, l’intensité du pic de PQS est divisée par 3 à 4 par rapport à l’intensité initiale. Cette expérience met en avant un phénomène lent de vieillissement de la solution lié à la précipitation de PQS et/ou son adsorption sur les éléments de la cellule électrochimique. Il faut donc ne pas trop attendre avant d’utiliser la solution de PQS.
Figure 2-19 : Variation de l’intensité du pic d’oxydation de PQS mesuré en CV en fonction du temps après préparation de la solution.
Pour la seconde expérience, deux types de détection ont été réalisées sur des solutions de PQS 30μM :
· La première est composée de la séquence suivante : polissage/nettoyage de l’électrode, mesure, polissage/nettoyage de l’électrode, mesure immédiate.
· La seconde est : polissage/nettoyage de l’électrode, mesure, attente 5 min, mesure.
Cette expérience a été réalisée en triplicata.
Pour la 1ère séquence, la mesure réalisée après le polissage a une intensité inférieure à la 1ère mesure (-35 ± 10%). L’état de la surface de l’électrode de GC ainsi que le temps d’attente en solution avant la mesure semblent prépondérants pour l’intensité du pic de PQS. Cela n’est pas étonnant, une adsorption partielle de PQS ayant été mis en avant par l’analyse de la dépendance de la réponse en fonction de la vitesse de balayage. Juste après l’étape de polissage/nettoyage, la surface de l’électrode est moins favorable à cette adsorption partielle que lorsque le polissage nettoyage a été effectué plus tôt avant la mesure.
Pour la 2nd séquence, la mesure réalisée après le temps d’attente de 5min donne un pic plus intense que la 1ère mesure (+55 ± 10%). Ce résultat est a comparé avec les résultats obtenus en CV classique dans le paragraphe 2.3.2 qui montraient que lorsque 2 cycles de CV sont enchainés, le pic obtenu pour le 2e cycle est très peu intense. Ce manque d’intensité a été attribué à l’oxydation de PQS partiellement irréversible ainsi qu’à la lenteur de diffusion/adsorption. En effet, après l’oxydation, des sous-produits sont formés et une partie d’entre eux est probablement adsorbés à la surface de l’électrode ce qui restreint son accès aux nouvelles molécules. De plus, les CV s’enchainant, les nouvelles molécules ont peu de temps pour diffuser et venir s’adsorber à la surface. En attendant 5 min avant de réaliser une nouvelle détection, on laisse plus de temps pour cette diffusion/adsorption et plus de temps aux sous-produits de l’oxydation de se décoller de la surface et ainsi de libérer de la surface active. C’est pour ces raison qu’en enchainant les CV le pic est moins intense qu’en laissant du temps entre.
Toutefois, ces phénomènes complexes compliquent la mesure quantitative de PQS. Nous pensons que ce type de phénomène est la cause de la variabilité de l’intensité de l’expérience précédente. Les durées entre nettoyage/polissage, mise en place de l’électrode dans la solution et mesure n’ayant pas été contrôlées.

Influence du pré-équilibrage sur la mesure de PQS

Le but de cette expérience est d’étudier l’influence du pré-équilibrage sur l’intensité du pic de PQS. Pour cela des SWV sont réalisées avec une électrode GC dans une solution de PQS 100μM après différents temps de pré-équilibrage soit au potentiel de circuit ouvert (OCP pour Open Circuit Potential) soit à -0,2V. Ce potentiel a été choisi car il correspondant au potentiel de début du voltampérogramme. L’électrode de GC reste dans la solution pendant toute la durée de l’expérience, pour éviter de changer la surface de l’électrode par le polissage/nettoyage.
Le pré-équilibrage à l’OCP correspond au même type d’expériences que celle réalisée dans le paragraphe précédent mais avec différents temps d’attente entre chaque mesure (dans l’ordre : 0, 30, 60, 120, 360s). Les résultats obtenus sont différents de ceux de l’expérience précédente : la taille du pic diminue légèrement au cours des pré-équilibrages (Figure 2-20). L’enchainement des détections ne laisse pas assez de temps au phénomène de diffusion/adsorption des molécules oxydées et réduites pour obtenir une détection plus intense que celle obtenue pour la première détection. Ce résultat est celui attendu pour les temps d’attente courts, mais il est au 1 er abord surprenant pour les temps d’attente longs, l’expérience du paragraphe précédent ayant montré qu’un pic plus intense est obtenu après 5min d’attente. Toutefois le passé de l’électrode est différent dans les 2 cas : pour l’expérience du paragraphe précédent une seule détection est réalisée avant l’attente de 5 min alors qu’ici l’attente de 360s intervient après 4 mesures rapprochées.
Ce résultat confirme la prépondérance des temps et des mesures sur la mesure suivante.
Un pré-équilibrage à -0,2V a aussi été testé dans les mêmes conditions. Le résultat obtenu est très différent. La taille du pic augmente linéairement avec la durée du pré-équilibrage naturel à l’OCP, en plaçant celle-ci à un potentiel négatif. Cette stratégie pourra être mise en place pour amplifier le signal. Ce résultat est à priori surprenant. Un potentiel négatif est appliqué à l’électrode, ce qui peut avoir comme effet d’attirer les espèces cationiques. Or PQS dans son état réduit est neutre et est clairement attiré à l’électrode à -0.2V. Cela est probablement dû à une polarisation de la molécule de PQS qui doit s’orienter dans le champ électrique de manière avantageant le transfert électronique, ce qui n’est pas le cas lorsqu’aucun champ n’est imposé.
Figure 2-20 : Intensité du pic (SWV 1Hz) de PQS en fonction du temps et du type de pré-équilibrage.

Conclusion générale de l’étude électrochimique

Grâce à ces expériences, nous connaissons en profondeur les réponses électrochimiques des 4 molécules sur l’électrode GC. Ces réponses sont très différentes et devraient permettre de séparer facilement les contributions des différentes molécules dans des mélanges plus complexes.
La technique électrochimique retenue pour la détection des espèces est la SWV. Elle donne une forte intensité de signal pour toutes les espèces et amplifie les réponses redox réversibles. De plus, elle permet de soustraire efficacement le courant de fond.

Analyse électrochimique de surnageants de culture de Pseudomonas aeruginosa

Introduction de l’analyse des surnageants

Après l’étude des 4 métabolites en solution modèle, l’étape suivante a été leur détection dans des solutions réelles. Nous avons choisi de le faire dans le surnageant de culture bactérienne.
Le surnageant, mélange de milieu de culture de composition complexe et de sécrétions bactériennes, est un milieu riche qui peut par des effets de matrice changer certains des paramètres de détection des molécules. Toutefois, il est important de noter que la détection dans ce milieu ne reflète pas celle qui aurait lieu dans un fluide corporel. Certains de ces fluides sont de composition plus simple, d’autres plus complexe, mais contrairement aux milieux de cultures commerciaux, ils peuvent présenter une grande variabilité de composition inter -individus et au cours du temps.
De nombreux milieu de culture bactériens sont utilisés en microbiologie. Pour cette expérience, nous voulions être dans les conditions classiques des laboratoires de microbiologie.
Nous avons donc choisi une culture dans le milieu riche Bouillon Lysogène (LB) Miller : il est composé de chlorure de sodium (10g/L), d’extrait de levure (5g/L) et de peptone (10g/L).
Le surnageant de la souche classique présentée dans le Chapitre 1, PAO1, a été étudié en premier lieu. Cette analyse a été confrontée à celle de son mutant isogénique PAO1DpqsA.

Electrode de PEDOT:PSS, caractérisations et détection de métabolites de P. aeruginosa Contexte de l’utilisation d’électrodes de PEDOT:PSS

Le premier objectif de la thèse était de montrer l’intérêt de l’analyse électrochimique de surnageants bactériens. Cet objectif a été rempli dans le Chapitre 2 avec des résultats très prometteurs sur les voltampérogrammes de surnageants de plusieurs souches sauvages de PA. Le second objectif est relié à la mise en oeuvre de ces analyses, et plus particulièrement au matériau d’électrode. Il s’agit d’étudier si l’utilisation d’une électrode de poly(3,4-éthylènedioxythiophène): poly(styrène sulfonate) (PEDOT:PSS) améliore la détection des métabolites.
Le PEDOT:PSS est un polymère conducteur électronique qui connait un grand engouement depuis quelques années. Il possède de nombreux avantages :
· bonnes caractéristiques électrochimiques (stabilité, réponse électrochimique…) [106],
· biocompatibilité [107],
· facilité de mise en forme [106],
· détection amplifiée de molécules organiques [108], [109], [110].
Pour ces raisons, ce matériau est utilisé avec succès depuis plusieurs années dans le laboratoire de Bioélectronique de l’Ecole des Mines de Saint-Etienne pour des applications couplant biologie et électronique. Les domaines d’applications des recherches menées au laboratoire couvrent en 2016 :
· la neuro-ingénierie, avec l’enregistrement de l’activité cérébrale à l’aide de transistor électrochimique de PEDOT:PSS implantés [111],
· le diagnostic in vitro, avec 2 volets de recherche différents :
o la caractérisation de l’attaque de toxines ou de pathogènes sur des tissus épithéliaux ou endothéliaux grâce à un transistor électrochimique [112], [113],
o la détection de métabolites humains comme le glucose ou le lactate grâce à des enzymes redox couplés aux transistors électrochimiques [114], [115],
· les textiles connectés, le principe est de réaliser des électrodes portées sur la personne pouvant mesurer différents signaux physiologiques [116], [117].
Le PEDOT:PSS a aussi été choisi dans cette thèse pour pouvoir réaliser dans le futur la détection des métabolites en utilisant le matériau en configuration transistor électrochimique. Le
but serait d’amplifier le signal en réalisant la détection des molécules à la grille et la mesure du signal dans le drain, de la même manière que Tybrandt et al. [118].
Après une introduction sur le PEDOT, ce Chapitre est consacré à la caractérisation de l’électrode de PEDOT:PSS par rapport à l’électrode de GC du Chapitre précédent pour la détection de molécules redox.

Le PEDOT, un polymère conducteur

Le PEDOT est un polymère conducteur de la famille des polythiophènes. Cette famille de polymère appartient au groupe des semi-conducteurs de type p (défaut d’électrons).

Polymérisation du PEDOT

Le PEDOT est issu de la polymérisation du 3,4-éthylènedioxythiophène (EDOT) (Figure 3-1). Plusieurs méthodes de synthèse sont couramment employées pour cette polymérisation.
Elles sont présentées dans les paragraphes ci-dessous.

Polymérisation chimique oxydative

La polymérisation chimique oxydative consiste à polymériser chimiquement en phase homogène l’EDOT (généralement en solution aqueuse). L’EDOT étant peu soluble en solution aqueuse (2,1g/L [106]), un agent surfactant est utilisé pour créer des gouttes d’EDOT dans la solution. Puis un agent oxydant est ajouté pour polymériser l’EDOT (Figure 3-2).
Figure 3-2 : Représentation schématique des étapes de la polymérisation chimique oxydative de l’EDOT, extrait de [119].
La polymérisation du PEDOT se déroule en 4 étapes (Figure 3-3). Tout d’abord une étape d’initiation dans laquelle l’oxydant vient générer un cation radical porté par l’atome de souffre (Figure 3-3 « Step 1 »). Dans la seconde étape, il y a dimérisation de 2 cations radicaux d’EDOT en formant une liaison covalente entre 2 des carbones liés au souffre (Figure 3-3 « Step 2 »). Le dimère perd ensuite 2 protons pour retrouver un état neutre et stable (Figure 3-3 « Step 3 »). Puis le dimère va à son tour s’assembler à un nouveau cation radical d’EDOT ou d’oligomères d’EDOT (Figure 3-3 « Step 4 »). Ce processus se poursuit tant qu’il y a des agents oxydants présents en solution. La charge portée par le souffre est délocalisée sur l’ensemble de la chaine ce qui la stabilise. De plus, elle est compensée par les anions du milieu qui viennent former des liaisons ioniques. Le PEDOT est ainsi polymérisé directement sous sa forme chargée et conductrice.
Cette polymérisation est celle mise au point par Bayer AG pour leur commercialisation de dispersion de PEDOT. L’EDOT est polymérisé dans une solution aqueuse de PSS en utilisant Na2S2O8 comme agent oxydant [121]. La réaction se fait à température ambiante et le résultat est une dispersion de PEDOT:PSS bleu foncé. Pour obtenir le polymère sous forme solide, une étape de dépôt doit être effectuée (à la tournette, à la pipette…), puis une étape de séchage. Un film très conducteur et insoluble dans la plupart des solvants est ainsi obtenu [121].

Polymérisation en phase vapeur

Cette polymérisation est aussi une polymérisation chimique oxydative mais elle présente 2 grandes différences avec celle présentée ci-dessus. L’agent oxydant (par exemple le Fer III) est déposé directement sur la surface de dépôt. Puis, cette dernière est exposée à des vapeurs d’EDOT [122]. Pour cela, un peu d’EDOT liquide est placé dans une enceinte étanche chauffée. Au bout de quelques minutes un film de PEDOT est créé sur la surface de dépôt. Des étapes de rinçages sont ensuite réalisées pour enlever l’oxydant en surplus.

Dépôt électrochimique

L’électropolymérisation permet de faire croître un film de polymère sur une électrode de travail par oxydation électrochimique du monomère. Elle peut être réalisée dans de nombreuses conditions différentes. Tout d’abord, de nombreux électrolytes peuvent être utilisés (par exemple : eau ou bien acétonitrile, avec différents sels) [122]. La synthèse peut ensuite être effectuée avec 3 grandes méthodes électrochimiques : des méthodes à courant imposé (galvanostatiques), à potentiel imposé (potentiostatiques) et des méthodes de cyclages où le potentiel varie autour du potentiel d’oxydation du monomère.
Par exemple, l’électropolymérisation peut être réalisée par chronopotentiométrie.
L’équipe de Bobacka et al. [123] utilise une solution aqueuse d’EDOT 0,01 M et de NaPSS 0,1 M et impose une densité de courant de 0,2 mA/cm². D’autres équipes utilisent la voltampérométrie cyclique (CV). Par exemple, l’équipe de Zhu et al. [124] réalisent 10 cycles de CV à la vitesse de 100mV/s dans de l’acétonitrile avec de l’EDOT 0,01M et du LiClO4 0,1M. Au 1er cycle, seul le pic d’oxydation de l’EDOT apparait sur la CV (Figure 3-4a, pic Ox2). Au cours des cycles suivants apparaissent les pics d’oxydation et de réduction du PEDOT (Figure 3-4a, pics Ox1 et Red1). Leurs intensités augmentent au fur et à mesure de la croissance du film (Figure 3-4b).
Figure 3-4 : CV (100mV/s), versus Ag/AgCl électrode, obtenues au cours de l’électropolymérisation de PEDOT à la surface d’une électrode de GC, extrait de [124].

Conductivité du PEDOT

Le PEDOT peut avoir des conductivités très différentes selon son état d’oxydation.
Quand il est sous forme neutre, il est isolant. Il n’y a pas d’état d’énergie intermédiaire autorisé dans la bande interdite entre la bande de conduction et la bande de valence (Figure 3-5). En oxydant le polymère, de nouveaux états d’énergie apparaissent dans la bande interdite. Le gap d’énergie à franchir devient plus faible ce qui augmente la conductivité du matériau. Un matériau de type semi-conducteur est alors obtenu. Ce matériau semi-conducteur et donc oxydé est dit « dopé » par analogie avec les semi-conducteurs extrinsèques dont la conductivité est augmentée en ajoutant des impuretés dans le matériau.
Lorsque le matériau est faiblement dopé (ou oxydé une seule fois tous les 3 monomères), une bande d’énergie un peu au-dessus du niveau de la plus haute orbitale moléculaire occupée (HOMO pour Highest Occupied Molecular Orbital) de la bande de valence devient autorisée (Figure 3-5). On parle de configuration polaron. Lorsque le matériau est fortement dopé (ou oxydé une 2e fois tous les 3 monomères), la bande d’énergie crée dans la bande interdite est plus haute en énergie, et la conductivité du matériau est ainsi plus grande (Figure 3-5). On parle de configuration bipolaron. C’est dans cet état que le PEDOT est le plus conducteur, le gap à franchir étant le plus faible.

Table des matières

Introduction générale
Chapitre 1 Etat de l’art sur les méthodes d’identification des bactéries et contexte de la thèse
1.1. Identification de bactéries en microbiologie clinique
1.1.1. Avant-propos
1.1.2. Méthodes d’identification de bactéries
1.1.3. Conclusions sur l’identification bactérienne
1.2. L’approche de la thèse : l’analyse de surnageants bactériens
1.2.1. Composition du surnageant d’une culture bactérienne
1.2.2. Sécrétôme
1.2.3. Quorum sensing
1.2.4. Utilisation de l’électrochimie pour l’analyse des surnageants bactériens
1.3. La bactérie d’intérêt de la thèse : Pseudomonas aeruginosa
1.3.1. Généralités sur Pseudomonas aeruginosa
1.3.2. Molécules sécrétées par Pseudomonas aeruginosa
1.4. Détection électrochimique de molécules sécrétées par Pseudomonas aeruginosa
1.4.1. Pseudomonas Quinolone Signal et 2-heptyl-4-quinolone
1.4.2. Pyocyanine
1.4.3. 2’-aminoacétophénone
1.4.4. Détections simultanées de molécules de plusieurs familles
1.5. Les objectifs de la thèse
Chapitre 2 Electrochimie sur carbone vitreux de métabolites de P. aeruginosa et analyse de surnageants de culture
2.1. Contexte de l’étude électrochimique
2.2. Electrochimie sur carbone vitreux des 4 métabolites sélectionnés
2.2.1. Avant-propos
2.2.2. Résultats principaux : publication n°1
2.2.3. Résultats complémentaires sur la détection de PQS
2.2.4. Conclusion générale de l’étude électrochimique
2.3. Analyse électrochimique de surnageants de culture de Pseudomonas aeruginosa
2.3.1. Introduction de l’analyse des surnageants
2.3.2. Résultats principaux : publication n°2
2.3.3. Résultat complémentaire : Analyse d’autres milieux de culture
2.3.4. Conclusions sur l’analyses électrochimique de surnageants
Chapitre 3 Electrode de PEDOT:PSS, caractérisations et détection de métabolites de P. aeruginosa
3.1. Contexte de l’utilisation d’électrodes de PEDOT:PSS
3.2. Le PEDOT, un polymère conducteur
3.2.1. Polymérisation du PEDOT
3.2.2. Conductivité du PEDOT
3.2.3. PEDOT:PSS
3.3. Caractérisations de l’électrode de PEDOT:PSS et détection de métabolites de Pseudomonas aeruginosa
3.3.1. Avant-propos : Fenêtres de stabilité de l’électrode de PEDOT:PSS
3.3.2. Résultats principaux : Publication n°3
3.3.3. Résultats complémentaires : Optimisation de la détection de Fe(CN)6
3-, PYO et de PQS sur l’électrode de PEDOT:PSS
3.3.4. Conclusions sur l’utilisation de l’électrode de PEDOT:PSS
Chapitre 4 Mise au point et caractérisations d’une électrode 3D de PEDOT:PSS réalisée par lyophilisation 
4.1. Apport attendu de l’utilisation d’une électrode 3D de PEDOT:PSS
4.2. Etat de l’art des matériaux poreux réalisés à partir de PEDOT
4.2.1. Avant-propos : vocabulaire des matériaux poreux
4.2.2. Mise en forme 3D du PEDOT
4.3. Contraintes et choix effectués pour l’électrode 3D de PEDOT:PSS de la thèse
4.3.1. Cahier des charges technique
4.3.2. Choix de la méthode de fabrication de l’électrode 3D
4.4. Fabrication et caractérisation de l’électrode 3D de PEDOT:PSS
4.4.1. La lyophilisation
4.4.2. Formulations et notations
4.4.3. Les caractérisations
4.5. Résultats concernant la fabrication et la caractérisation de l’électrode 3D de PEDOT:PSS
4.5.1. Etude préliminaire sur lame de verre
4.5.2. Réalisation de dispositifs adaptés
4.5.3. Recherche des conditions permettant d’obtenir une « bonne » électrode
4.5.4. Etude approfondie de l’influence de la DBSA
4.5.5. Caractérisations complètes de la formulation PG3D0.75
4.5.6. Conclusions
4.6. Protocoles des caractérisations du Chapitre 4
4.6.1. Caractérisations morphologies
4.6.2. Caractérisations mécaniques
4.6.3. Caractérisation spectroscopique Raman
4.6.4. Caractérisations électrochimiques
Chapitre 5 Culture et détection de P. aeruginosa avec l’électrode 3D de PEDOT:PSS
5.1. Contextes de l’étude microbiologique
5.2. Caractérisations physiologiques de l’électrode
5.2.1. Préparation et stérilisation
5.2.2. Bactério-compatibilité
5.2.3. Croissance bactérienne au sein des électrodes
5.3. Adaptation de la puce pour les mesures en laboratoire de microbiologie
5.3.1. Structure de la puce
5.3.2. Contre-électrode
5.3.3. Electrode de référence
5.4. Analyse in situ de surnageant
5.4.1. Expérience « test » sur Pseudomonas putida
5.4.2. Analyse de surnageants de PAO1 et PAO1DpqsA
5.5. Conclusions
5.6. Protocoles de microbiologie du Chapitre 5
5.6.1. Tests de bactério-compatibilité sur boites
5.6.2. Tests de bactério-compatibilité en liquide
5.6.3. Evaluation de la croissance bactrienne dans la phase liquide intrapore
5.6.4. Analyse de surnageants in situ
Conclusion générale
Annexes
Bibliographie

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