Effets du Calliofop 36EC sur la longueur moyenne des racines(LMR)

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Répartition et écologie de l’espèce

Ce sont des plantes répandues dans toutes les zones tempérées d’Amérique du Nord. L’élodée est l’une des plantes aquatiques les pluscommunes à Washington .Elles se sont largement naturalisées en Europe, en Afrique, en Asie.
Les sédiments limoneux et les eaux riches en éléments nutritifs favorisent la croissance des élodées dans les lacs fertiles. Toutefois, ces plantes sont capables de s’adapter à diverses conditions écologiques, des eaux profondesaux étangs peu profonds, et à différents types de sédiments. Elles peuvent même prospérer enflottant entre deux eaux, non enracinées…

Lemna minor

Est une angiosperme aquatique, de l‘ordre des Arales et de la famille des Lemnacées. Les lentilles d’eau sont des plantes aquatiques flottantes de petite taille qui se présentent sous forme de colonies de frondes très vertes de 2 à 6 mm de diamètre. Les colonies sont formées de 2, 3 ou 4 frondes réuniespar des pédicelles, chaque fronde porte une fine racine pouvant atteindre 3 cm. Ce végétal colonise très facilement la surface des eaux douces et calmes au niveau des étangs, des chenaux,des mares … Il est très commun sous les latitudes tempérées. Il se multiplie très rapidement et de manière végétative, les frondes mères donnant naissance à des frondes filles qui arrivées à maturité se détachent des frondes mères pour donner de nouvelles colonies. Cet organisme est souvent utilisé pour les études écotoxicologiques et dans des tests normalisés(AFNOR, 1996 ; ISO, 2001).

Description de l’espèce :

Cette plante est présente dans les eaux douces relativement dormantes (étangs, lacs, eaux stagnantes et cours d’eau calmes) et les estuaires des zones tropicales à tempérée(apha et al. ,1992). C’est une espèce cosmopolite dont la répartition est presque mondiale ( godfrey et wooten, 1979).

Distribution et Biotope de l’espèce :

Lemna minor est répandue sur toutes les eaux douces du globe,dormantes et eutrophes (chargées en substances nutritives).
Elle se développe principalement à la surface des eaux calmes, lentes (un brassage de surface est une façon de lutter contre la prolifération des lentilles). Elle affectionne la lumière, la chaleur et les eaux chargées en nutriments. Elleest présente jusqu’à 1800 m d’altitude.

Répartition et écologie de l’espèce

Cosmopolite, Lemna minor est présente presque partout dans le monde (Godfrey et wooten, 1979). Elle est largement répandue dans toute l’Amériquedu nord, sauf dans l’extrême nord et dans les Bahamas. On la trouve aussi en Europe, en Asie, en Afrique et en Australie (Britton et brown, 1970). En Amérique du nord, on la trouve de terre-neuve à l’Alaska et au sud jusqu’en Californie, au Texas et en Floride (Newmaster et al ., 1997).
Les lenticules forment un élément essentiel de l’écosystème des eaux stagnantes et peu profondes. Elles font partie intégrante de la chaine alimentaire, fournissent de la nourriture à la sauvagine et aux oiseaux des marais, tels que les foulques, les canards noirs. Ces plantes fournissent aussi de la nourriture, un abri, de l’ombrage et un substrat aux poissons et aux invertébrés aquatique(Jenner et Janssen, 1989 ; Taraldsen et Noberg-King, 1990 ; Apha
et al ., 1992 ; Newmaster et al.,1997). Dans les conditions favorables à la croissance, elles peuvent se multiplier rapidement et former un tapis dense, constitué de divers genres et espèces (Rimer, 1993), dominé par une seule espèce(Wang, 1987).

Conditions de l’expérimentation :

L’expérience est réalisée en laboratoire, dans desconditions in vitro. Notre expérimentation a porté sur 12 échantillons du même poids (15g) en ayant effectué trois répétitions par paramètres étudié. La durée deitementtra est de 3, 7,14 et 21 jours. Nos essais sont réalisés dans des volumes de 500 ml d’eau aditionné volontairement du xénobiotique Calliofop 36 EC à différentes doses : 0 (témoin), 35, 70 et 140µg de produit.

L’herbicide utilisé :

Nous avons utilisé un herbicide nommé Calliofop 36EC LifeScience dont la matière active est le diclofop-méthyle.
Le diclofop-méthyle est un herbicide de post levée sélectif pour le ontrôlec de la folle avoine et des mauvaises herbes annuelles et herbeuses trouvées parmi les crucifères, l’orge, le blé.(Worthing, c. r, 1983)
La matière active a été développée dansles années 1970 par Hoechst AG. Depuis le 31/12/2001, elle se retrouve dans le domaine public après avoir été la propriété d’Agrevo (puis de Bayer CropSciences).

Les paramètres étudiés

Les paramètres biométriques:

• Matière fraiche et matière sèche (MF/MS)
Ce paramètre a été réalisé après 3,7 ,14 et 21joursde traitement, à l’aide d’une balance de précision pour la détermination du poids frais esd échantillons.
La matière sèche des plantes est obtenue après passage des échantillons à l’étuve, pendant 24h à une température comprise entre 5 et 100°C.
• Longueur moyenne des tiges(LMT) :
Les paramètres d’élongation des tiges sont réaliséspar le suivi des longueurs moyennes des tigelles pendant 3,7 ,14 et 21 jours avec marquage à l’encre de chine.
• Longueur moyenne des feuilles(LMF) :
Les paramètres d’élongation des feuilles sont réalisés par le suivi des longueurs moyennes des feuilles pendant 3,7 ,14 et 21 jours avec marquage à l’encre de chine.
• Longueur moyenne des racines (LMR):
Pour suivre la croissance de la plante, on a mesuré la longueur des racines de chaque échantillon à 3, 7, 14 et 21 jours de traitement avec marquage à l’encre de chine.

Les paramètres biochimiques

• Dosage des Protéines totales :
Les protéines foliaires de Elodea canadensis et Lemna minor sont dosées par colorimétrie selon la méthode de Bradford, (1976).Le principe de la méthode est basé sur la fixation d’un colorant acide (bleu de coomassie) sur les protéines au niveau de résidus basiques et aromatiques, cette fixation provoque un transfert de sa couleur qui passe du rouge au bleu. Ce changement de coloration est mesuré à une longueur d’onde de 595nm par spectrophotomètre (JENWAY 3600) en utilisant l’Albumine Sérum bovine (BSA) comme standard.
• Dosage des sucres totaux
Le dosage des sucres totaux est réalisé selon la méthode de Schields et Burnet (1960) qui utilise l’Anthrone en milieu sulfurique comme réactif (200 mg d’Anthrone, 100 ml d’acide sulfurique) et une solution mère de glucose à 50 µg/ml.
Cette méthode comprend l’extraction d’une pesée de100 mg d’échantillon (MF).On ajoute 3 ml d’éthanol à 80 %, on laisse le tout à u ne température ambiante pendant 48 h. On évapore ensuite l’éthanol, et on rajoute 20 ml d’eau distillé. On prélève 2 ml d’extrait auquel on rajoute 4 ml d’Antrone.
Les absorbances sont mesurées au spectrophotomètreà une longueur d’onde de 585 nm.
• Dosage de la proline
La technique de dosage de la proline utilisée est celle de Troll et Lindsley, (1955), modifiée par Dreier et Goring (1974) .la gamme d’étalonnage est réalisée a partir d’une solution mère de proline (20µg/ml).
Cette méthode est réalisée comme suit : après refroidissement on prélève 1 ml de la solution, à laquelle on ajoute 1 ml d’acide acétique (CH3COOH) et 1 ml de mélange contenant 120ml d’eau distillée+ 300 ml d’acide acétique+ 80ml d’acide ortho phosphorique et 25 mg de ninhydrine.
Les solutions sont portées a ébullition pendant 30 min, elles virent au rouge ; après refroidissement on ajoute 5ml de toluène, et on procède a une agitation, deux phases se séparent :
– une phase inférieure sans proline
– une phase supérieure qui contient la proline, cette phase est ensuite récupérée et déshydratée par l’adjonction de NASO .
On procède enfin a la détermination des densités optiques des échantillons à la longueur d’onde 528 nm, après étalonnage de l’appareil par mélange (acide acétique+eau distillée+acide ortho phosphorique = ninhydrine).

Paramètre physiologique

• Dosage des chlorophylles :
L’extraction des chlorophylles est effectué selon la méthode de Holden (1975), qui consiste en une macération du végétal dans de l’acétone. Le traitement des échantillons se fait comme suit : on pèse 1g des feuille du végétalcoupé en petits morceaux et broyés dans un mortier avec 20ml d’acétone à 80% et environ 100mg de bicarbonate de calcium (CaCO3).
Après le broyage total, la solution est ensuite filtrée et mise dans des boites noires afin d’éviter l’oxydation des chlorophylles par la lumière.
La lecture se fait aux deux longueurs d’onde 645nm et 663nm, après étalonnage de l’appareil avec la solution témoin d’acétone à 80%. L’équation qui nous permet de calculer les valeurs des chlorophylles (Arnon, 1949) est :
Chl.a = 12, 70. DO (663) – 2, 69. DO (645)
Chl.b = 22, 90. DO (645) – 4, 60. DO (663)
Chl. (a+b) = 8,02 DO (663) + 20,20 DO (645)

Dosage des Biomarqueurs

Dosages Enzymatiques

Préparation de l’extrait enzymatique : La méthode utilisée afin d’obtenir l’extrait enzymatique des feuilles des deux Macrophytes : Elodea Canadensis et Lemna minor. L’extrait sera utilisé pour la mesure de l’activité ascorbate-peroxydase (APX), gaïacols-peroxydase (GPX) et le Glutathion transférase (GST).
Après chaque traitement (3, 7, 14, et 21 jours), les feuilles fraiches (1g) sont broyées à froid à l’aide d’un mortier dans 5ml de tampon pho sphate (50mM phosphate, pH=7,5). L’homogénat est ensuite filtré à l’aide d’une toile adéquate avant de procéder à une centrifugation à froid de 12000g pendant 20 min (ce ntrifugeuse Sigma 3-16K). Le surnageant obtenu sera utilisé comme extrait pour la détermination des différentes activités enzymatiques.
Quantification des mesures spectrophotométrique :La formule suivante est utilisée dans la quantification des différentes mesures spectrophotométriques suite aux dosages enzymatiques de la GPX, APX et CAT (Servais, 2004). A.Vt Act. = ε. t.L.Ve.p
Act: Activité enzymatique en nmole/min/mg de Protéines
ε : Coefficient d’extinction linéique molaire en M
A : Différence moyenne de l’absorbance
Vt : Volume total du mélange réactionnel en ml
Ve: Volume de l’extrait enzymatique en ml
L: Largeur de la cuve de mesure en cm
P: Teneur en protéine en mg.
T: temps de lecture en min

Etude du métabolisme respiratoire :

L’appareil utilisé est une électrode à oxygène, detype Hansatech, qui permet la mesure de la production ou de la consommation d’oxygène. L’appareil comprend une cathode polarisé (-) en platine et une anode polarisé (+) irculaire en argent. Le contact entre les deux électrodes est établi par un pont de solution saturée de KCl, la suspension cellulaire est constamment remuée par un agitateur magnétique. L’application d’une faible tension électrique va provoquer la réduction électrolytiquede l’oxygène présent dans la solution. Le courant qui traverse le circuit des deux électrodesquand la tension appliquée est en moyenne de 0,7mV, varie linéairement en fonction de la concentration en oxygène dissout dans la suspension cellulaire selon la réaction : ½ O2 + 2 e- O-
La jaquette est maintenant à une température constante de 25°C. Cet appareil est relié à un ordinateur sur lequel les spectres apparaissent et sont ensuite enregistrés sur une imprimante de type (Epson-LQ 1027). La méthode utilisée est adaptée aux racines isolées. (Djebar et Djebar, 2000).

Effets du Calliofop 36EC sur la longueur moyenne des tiges(LMT) :

La figure (8), représente les effets du Calliofop 36EC sur la longueur moyenne des tiges(LMT) de Elodea Canadensis à 3 jours de traitement après analyse de la variance ANOVA à un critère de Classification (dose) ( Tab. 01), on constate une diminution très significative (p ≤ 0.01) des traités par apport au témoin , après 7et 14 jours de traitement la réduction enregistrée des traités par apport au mointé est significative (p≤ 0.05), après 21jours de traitement la figure 8 , indique une baisse hautement significative (p≤ 0.001) des tiges traitées avec effet dose dépendant.
Le test de DUNETTE indique pour la longueur des tiges X1 : Après 3 jours de traitement, le témoin D est différent de D, D et D . Après 7 jours de traitement le test de DUNNETTE montre que les doses D0, D1, D2, sont identiques entre elles et différentes de la dose D3. Après 14 jours de traitement, les doses D0, D1, D2, sont identiques entre elles et différentes de la dose D. Enfin après 21 jours de traitement le test de DUNNETTE montre que le témoin D est différente des trois autres dose D, D et D . (Tab. 01).
Le test de classement des groupes homogènes HSD de TUKEY nous a révélé pour la longueur des tiges X1 les résultats suivants : après 3 jours de traitement deux groupes de doses apparaissent , le premier groupe A : comprend la dose témoin D et la dose D , et le deuxième groupe B : est composé des doses : D, D , D , cependant la dose D est d’une part identique à la dose témoin D0 et aux doses D2et D3 mais ces deux dernières sont différentes de la dose témoin D. Après 7 jours de traitement le test de TUKEY a permis de mettre en évidence deux groupes de doses, le premier groupe A : comprend la dose témoin D et les doses D et D ;
Le deuxième groupe B : est composé des doses D, D et D , les doses D et D sont d’une part identiques au témoin D et la dose D , mais d’autre part, les dose D et D sont différentes. Après 14 jours de traitement le test de TUKEY a mis en évidence deux groupes de doses, le premier groupe A : comprend la dose témoin D et la dose D et D ; Le deuxième groupe B : est composé des doses D, D et D , les doses D et D sont d’une part identiques au témoin D et la dose D mais d’autre part, les dose D et D sont différentes.
Le test de TUKEY après 21 jours de traitement, a permis de mettre en évidence trois groupes de doses, le premier groupe A : se compose des doses : D0 et D1, le deuxième groupe B : contient les dose D et D , le troisième groupe C : est composé de la dose D La dose D est identique à la dose D et D , en même temps, elle est différente de la dose D. Aussi cette dernière est différente des trois autres doses : D, D , et D . (Tab. 01).

Effets du Calliofop 36EC sur la longueur moyenne des feuilles(LMF) :

La figure (9), indique les effets du Calliofop 36 EC sur la longueur moyenne des feuilles (LMF) de Elodea canadensis. Après 3 et 7 jours de traitement, la diminution de la longueur moyenne des feuilles est non significative (P≥ 0,05) , après 14 jours de traitement la diminution de LMF est significative (p≤ 0.05) des traités comparativement au témoin , à 21 jours de traitement la diminution de LMF est hautement significative (p≤ 0.001) par apport au témoin ,ces résultats sont confirmés par l’analyse de la variance ANOVA à un critère de Classification (dose). (Tab.01).
Le test de DUNETTE indique pour la longueur moyenne des feuilles X2 qu’ après 3 jours de traitement, les doses D1, D2 et D3 sont identiques entre elles, et identique, à la do se témoin D ; Après 7 jours de traitement, le test de DUNNETTE révèle que les doses D, D et D3 sont identiques entre elles, et identiques à la do se témoin D0 ; Après 14 jours de traitement, le test de DUNNETTE montre que les doses D0, D1, D2, sont identiques entre elles et différentes de la dose D. Après 21jours de traitement, le test de DUNNETTE indique que les doses D0 et D1 sont identiques entre elles et différentes des doses D2 et D3. (Tab. 01)
Le test de classement des groupes homogènes HSD de TUKEY nous a révélé pour La longueur moyenne des feuilles X2 qu’ après 3jours de traitement, un seul groupe A : il comprend les doses : D0, D1, D2, et D3, donc les trois doses D1, D2, et D3 sont identiques entre elles et identiques au témoin D, après 7 jours de traitement , le test de TUKEY a permis de mettre en évidence un seul groupeA : il comprend les doses : D0, D1, D2, et D3, donc les trois doses D , D , et D sont identiques entre elles et identiques avec la doses témoin D ; Après 14 jours de traitement ,Le test de TUKEY a permis de mettre en évidence un seul groupe A : il comprend les doses : D0, D1, D2, et D3, donc les trois doses D1, D2, et D3 sont identiques entre elles et identique avec la doses témoin D ; Après 21 jours de traitement , le test de TUKEY a permis de mettre en évidence deux groupes différents, le premier groupe A : contient les doses : D0, D1 et le deuxième groupe B : se compose des doses : D2 et D3, les deux groupes sont parfaitement séparés : la dose D est identique à la dose témoin D et 1 0 différente des doses D et D ces deux dernières sont identiques entre elles et différentes des 2 3, doses D0 et D1 . (Tab. 01).

Effets du Calliofop 36EC sur le ratio matière fraiche et matière sèche (MF/MS):

La figure (10), montre les effets du Calliofop 36EC sur la biomasse chez Elodea Canadensis, l’analyse de la variance ANOVA à un critère de Cla ssification (dose). (Tab.01) montre une réduction très significative du ratio MF/MS (p ≤ 0,01), comparativement au témoin après 3, et 7 jours de traitement. Après 14et 21 jours de traitement la réduction du ratio MF/MS est non significative (P≥ 0,05).
Le test de DUNETTE indique pour le ratio matière fraiche matière sèche MF/MS X3 , après 3jours de traitement, indique que la dose témoin D est différente des trois autres dose D1, D2 par contre après 7jours de traitement, la dose témoin D0 est différente des trois autres dose D1, D2 et D3 ; Cependant ,après 14 jours de traitement les doses D1, D2 et D3 sont identiques entre elles, et identiques à la dose témoin D0 ; et après 21 jours de traitement, le test de DUNETTE révèle que les doses D, D et D sont identiques entre elles, et identiques à la dose témoin D0. (Tab. 01).
Le test de classement des groupes homogènes HSD de TUKEY nous a révélé pour le ratio matière fraiche matière sèche MF/MSX3 ; Après 3jours de traitement, le test de TUKEY a permis de mettre en évidence trois groupes différents le premier groupe A : se compose des doses D0 , D1 , le deuxième groupe B : contient les doses D1, D2 , et le troisième groupe C : est composé des doses D et D , la dose D est d’une part identique a la dose témoin D et D , d’une autre part la D est différente de la dose témoin D , et identique à la dose D , cependant la dose témoin D est différente de la dose D, alors qu’après 7jours de traitement le test de TUKEY a permis de mettre en évidence deux groupes différents le premier groupe A : se compose des doses D0 et D1 , le deuxième groupe B : comprend les doses D1, D2 et D3 . La dose D1 est identique à la doses témoin D0 et au doses D2 et D3 quoi que ces deux dernières sont différentes par rapport à D .Après 14jours de traitement, le test de TUKEY a0 permis de mettre en évidence un seul groupe A : il comprend les doses : D0, D1, D2, et D3, donc les trois doses D , D , et D sont identiques entre elles et identiques avec le témoin D ; Après 21jours de traitement le test de TUKEY a permis de mettre en évidence un seul groupe A : il comprend les doses : D0, D1, D2, et D3, donc les trois doses D1, D2, et D3 sont identiques entre elles et identiques avec le témoinD0. (Tab. 01).

Table des matières

Chapitre 1 : Introduction générale
Généralités 
Les herbicides 
•Modes d’action des herbicides
La phytoremédiation 
Différents types de remediaion 
Chapitre 2 : Matériel et Méthodes
A-Matériel expérimental 
1. Elodea Canadensis 
1.1 Description de l’espèce
1.2 Distribution et biotope de l’espèce
1.3 Classification de l’espèce
1.4. Répartition et écologie de l’espèce
2. Lemna minor 
2.1. Description de l’espèce
2.2 . Distribution et Biotope de l’espèce 
2.3. Classification et taxonomique
2.4. Répartition et écologie de l’espèce
3. Condition de l’expérimentation 
B- L’herbicide utilisé 
C – Conduite de l’essai
D. Les paramètres étudiés 
a) Les paramètres biométriques 
– Matière fraiche et matière sèche (MF, MS)
– Longueur moyenne des tiges(LMT)
– Longueur moyenne des feuilles(LMF)
-Longueur moyenne des racines (LMR)
b) Les paramètres biochimiques 
-Dosage des Protéines totales
-Dosage des sucres totaux
– Dosage de la proline
c) Paramètre physiologique 
-Dosage des chlorophylles
d) Dosage des Biomarqueurs 
1. Dosages Enzymatiques 
-Dosage de l’activité Ascorbate-peroxydases (APX)
-Dosage de l’activité Catalase (CAT)
-Dosage de l’activité Glutathion S-Transférase (GST)
2. Le Dosage non Enzymatique 
– Dosage de malondialdehyde (MDA) 
– Le Glutathion (GSH)
e) Etude du métabolisme respiratoire 
f) Etude du métabolisme photosynthétique 
E. Analyse statistique 
Chapitre 3 : paramètres biométriques
Introduction 
1. Objectif du travail 
2. Analyse statistique 

3.2. Lemna minor 
3.2.1 Effets du Calliofop 36EC sur la longueur moyenne des racines(LMR)
3.2.2 Effets du Calliofop 36EC sur le ratio matière fraiche et matière sèche (MF/MS)
•Discussion 
•Conclusion 
Chapitre 4 : Paramètres biochimiques et physiologiques
Introduction 
•Le potentiel épuratoire des plantes aquatiques 
•Mécanismes d’adaptation des plantes au stress 
– La capacité photosynthétique
– La teneur en chlorophylle
– Accumulation de la proline en condition de stress
– Les sucres
1. Objectif du travail 
2. Analyse statistique des résultats 
3. Résultats 
3.1 Effets du Calliofop 36EC sur les paramètres biochimiques 
3.1.1 Elodea canadensis 
a) Effets du Calliofop 36EC sur la teneur en protéines totales
b) Effets du Calliofop 36EC sur la teneur en sucres totaux
c) Effets du Calliofop 36EC sur le taux en proline
3.1.2 Lemna minor 
a) Effets du Calliofop 36EC sur la teneur en protéines totales
b) Effet du Calliofop 36 EC sur le taux des sucres totaux
c) Effet du Calliofop 36 EC sur le taux en proline Sommaire
a) Elodea Canadensis 
b) Lemna minor 
• Discussion 
• Conclusion 
Chapitre 5 : Paramètres enzymatiques
A. Le stress oxydatif chez les plantes 
– Le statut redox cellulaire
– Les Espèces Réactives de l’Oxygène
B. Les principales sources enzymatiues 
– Les antioxydants
C. Les principaux systèmes non enzymatiques 
– L’ascorbate ou vitamine C 
– Le Glutathion
D. Les principales enzymes antioxydantes 
– Les superoxydes dismutases (SOD)
– Les catalases (CAT)
– Les enzymes du cycle Asada-Halliwell-Foyer
– Les peroxydases (POX)
– Les peroxyredoxines
– La glutathion S-transférase
E. Les mécanismes de la résistance aux herbicides 
– La résistance par métabolisation
1. Objectif du travail 
2. Analyse statistique des résultats 
3. Résultats
3.1 Effets du Calliofop 36EC sur les activités enzymatiques 
3.1.1 Elodea canadensis 
a) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Ascorbate-peroxydases (APX)
b) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité la Gaïacol-peroxydases (GPX)
c) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Catalase (CAT)
d) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Glutathion S-Transférase (GST)
3.1.2 Lemna minor 
a)Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Ascorbate-peroxydases (APX)
b) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité la Gaïacol-peroxydases (GPX)
c) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Catalase (CAT)
d) Effets du Calliofop 36 EC sur l’activité Glutathion S-Transférase (GST)
3.2 Effets du Calliofop 36EC sur les biomarqueurs non enzymatiques 
3.2.1. Elodea canadensis 
a) Effets du Calliofop 36 EC sur Le Glutathion (GSH)
b) Effets du Calliofop 36 EC sur malondialdehyde (MDA) (µM/mg de protéines)
3.2.2. Lemna minor
a)Effets du Calliofop 36 EC sur Le Glutathion (GSH)
b) Effets du Calliofop 36 EC sur le taux du malondialdehyde (MDA) (µM/mg de protéines)
• Discussion 
• Conclusion 

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