Effets des facteurs abiotiques sur la croissance de Trichoderma

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Ecologie

Comprendre les facteurs écologiques qui affectent la distribution de Trichoderma dans leurs habitats naturels peut conduire à une meilleure compréhension de la dynamique, de la survie et de la prolifération des populations de ce champignon antagoniste dans le sol et la rhizosphère. Pour cette raison, une analyse minutieuse du comportement de ce champignon dans l’écosystème du sol est nécessaire.
Grâce à sa grande capacité d’adaptation aux différentes conditions climatiques, le genre Trichoderma est très répandu dans la nature. On le trouve aussi bien en milieu terrestre que marin. En effet, les Trichoderma sont remarquables pour leur croissance rapide et leur capacité à utiliser différents substrats et sont, par conséquent, l’élément majeur dans la microflore terrestre et marine.
Les Trichoderma terrestres se développent quasiment dans tous les sols (forestiers ou cultivés), en particulier dans ceux contenant un important contenu en matière organique et sur les végétaux en décomposition. Ils semblent être des colonisateurs secondaires à cause de leur isolement fréquent dans la matière organique bien décomposée (Danielson et al., 1973). Les Trichoderma se trouvent également sur la surface des racines de diverses plantes; écorce en décomposition, surtout quand il est endommagé par d’autres champignons (Danielson et al., 1973) et sur les sclérotes ou autres propagules d’autres champignons ( Davet 1979, Wels et al., 1972). Ils contaminent fréquemment le compost de la culture industrielle des champignons comestibles, mais sont rarement parasites de plantes vivantes.
Dans la mer, les Trichoderma ont été identifiés à tous les niveaux. Ils ont été également isolés à partir d’algues marines prélevées de la côte Atlantique et méditerranéenne ibériques ainsi qu’à partir de moules au Canada. Leur présence dans le tractus digestif et la surface de plusieurs espèces de concombre des mers reste insolite, puisque ces derniers bio-synthétisent des glycosides tri terpéniques aux fortes activités antifongiques et cytotoxiques (Pivkin., 2000).
La répartition de Trichoderma dans les écosystèmes varie en fonction des contraintes biotiques et abiotiques. Lorsque les conditions sèches du sol sont maintenues pendant une longue période, les populations de Trichoderma (T.) diminuent (Davet, 1979). Danielson et Davey (1973) également ont conclu que certaines souches de T. hamatum et T. pseudokoningii sont adaptées à des conditions d’humidité excessive du sol et que T. viride et T. polysporum sont restreints à des zones où les températures sont basses. T. harzianum est plus souvent présent dans les régions chaudes tandis que T. hamatum et T. koningii sont largement distribués dans les zones de conditions climatiques variées. Les déterminants supplémentaires physiques et chimiques qui agissent sur la répartition de Trichoderma sont le pH du sol, le CO2, le HC03, la teneur en sel, en matière organique et la présence ou l’absence d’autres micro-organismes dans le sol. La teneur en fer du sol peut aussi être un élément déterminant de la micro préférence du site de Trichoderma (Papavizas, 1985). L’inventaire des souches fongiques marines du littoral atlantique montre que le genre Trichoderma est l’un des 3 prédominants (Sallenave-Namont, 2000). Il vient à la 3ème position après les genres Penicillium et Aspergillus en importance numérique. La présence des Trichoderma sp. en milieu terrestre (6% du nombre total des espèces fongiques) semble comparable à celle en milieu marin (6,4% à 10,4%) (Landreau, 2001). L’abondance des Trichoderma sp. dans les écosystèmes est due à leur capacité à produire diverses substances bioactives et des enzymes. Ils sont de ce fait un maillon important dans les chaînes biologiques (Mohamed-Benkada., 2006).

Morphologie

L’aspect macroscopique de Trichoderma sp. est apprécié à partir de cultures sur géloses nutritives appropriées, réparties en boîtes de Petri. Les colonies fongiques peuvent être légèrement floconneuses ou bien compactées en touffes. Entre ces deux extrêmes, existent des aspects intermédiaires. Les colonies sont colorées en fonction de la pigmentation des phialides. Cinq jours après sa germination, la conidie donne naissance à un mycélium d’abord blanc et stérile en forme de cercle. Deux jours plus tard, une couleur verte est visible sur les parties aériennes du mycélium, correspondant à la conidiogenèse. D’autres cercles concentriques réguliers se forment par la suite, et entre le 16ème et le 20ème jour un feutrage épais se superpose à la culture. Au microscope optique on peut observer un mycélium composé d’hyphes jaunes, septés, ramifiés à parois lisses. Les conidiophores ont une forme conique ou pyramidale. Très ramifiés, ils portent des phialides en forme de flasques ou de quilles. A leur tour, les phialides portent les spores encore appelés phialospores ou bien conidies (Cournut, 1984 ; Landreau, 2001).

Les conidiophores

Les conidiophores sont très ramifiés et donc difficile à définir ou à mesurer. Lâche ou compacte, ils sont souvent formés dans différents cercles concentriques ou au niveau de longs hyphes. Les branches principales des conidiophores produisent des branches latérales qui peuvent être appariés ou non. Les plus longues branches éloignées de la pointe et les phialides sont souvent insérées directement à l’axe principal près de la pointe. Les branches principales peuvent être ramifiées à nouveau en branches secondaires. Les branches principales et secondaires forment un angle de près de 90 ° par rapport à l’axe principal. Le conidiophore (figure 3) typique du genre Trichoderma est donc ramifié et formé de branches ayant un aspect pyramidal ou conique (Samuels et al., 1994). En général, le conidiophore se termine par une ou quelques phialides. Chez certaines espèces (par exemple, T. polysporum) les ramifications principales sont terminées par de longs crochets simples ou ramifiés, droites ou sinueuses avec des cloisonnements à paroi mince et terminés par des allongements stériles ou fertiles. L’axe principal peut être de même largeur que la base de la phialide ou elle peut être beaucoup plus large. Les conidiophores portent les phialides en formes de flasques ou de quilles (Samuels et al., 2013).

Les phialides

Les phialides hyalines sont généralement élargies au milieu en forme de bouteilles renflées à la base mais peuvent être cylindriques ou presque subglobuleuses . Elles sont souvent disposées en verticilles à un angle de 90 ° par rapport aux autres membres de la spire ou diversement pénicillées. Les phialides peuvent être solitaires (par exemple T. longibrachiatum) ou disposées en grappes denses sur l’axe principal (par exemple, T. polysporum , T. hamatum ). Elles portent à leurs extrémités les spores encore appelés conidies ou phialospores (Samuels et al., 2013).

Les conidies

Les conidies apparaissent généralement sèches, mais chez certaines espèces, elles peuvent être détenues dans des gouttes de liquide vert ou jaune clair (par exemple, T. virens , T. flavofuscum ). Les conidies de la plupart des espèces sont unicellulaires, ellipsoïdales de dimensions 3-5 x 2-4 um (L / l => 1,3). Il existe aussi des conidies de formes globuleuses. Les conidies sont généralement lisses, mais finement verruqueuses. Cependant on peut observer aussi des conidies qui ont une forme tuberculée chez certaines espèces de Trichoderma. Elles ont une couleur verte et une paroi lisse ou rugueuse regroupées dans des tètes collantes à l’extrémité des phialides (Samuels et al.,2013).

Les chlamydospores.

Les chlamydospores peuvent être produites par toutes les espèces de Trichoderma lorsque les conditions du milieu le permettent. Les chlamydospores sont généralement subglobuleuses, unicellulaires et mettent fin à des hyphes courts. Elles peuvent également être formées dans les cellules des hyphes. Chez certaines espèces de Trichoderma les chlamydospores sont multicellulaires (par exemple T. stromaticum ) (Samuels et al.,2013).

Cycle de vie de Trichoderma

Trichoderma est un champignon asexué. Les conidiophores représentent la phase dominante de la multiplication. Dans des conditions appropriées (figure 4), les conidiospores germent et l’observation microscopique après environ 11 heures d’incubation révèle la formation d’un tube germinatif. Après 40 heures d’incubation dans les conditions optimales de croissance, une multiplication active du mycélium est observée et la formation de nombreuses ramifications. Quelques jours plus tard, il y a formation des conidiophores portant à leurs extrémités les phialides et des conidies (Roussos, 1985).

Pouvoir antagonistes de Trichoderma

Les propriétés antagonistes de Trichoderma sont connues depuis longtemps puisque la première publication qui en fait mention date de 1887. Cependant, l’étude approfondie du phénomène d’antagonisme et de son application comme moyen de lutte à l’égard des parasites des plantes cultivées n’a débuté qu’entre les deux guerres mondiales. Les modèles étudiés s’intéressaient essentiellement aux parasites du sol mais déjà, en 1952, Wood signalait l’efficacité de Trichoderma pour contrôler Botrytis cinerea sur la laitue. Trichoderma a la capacité d’attaquer les agents pathogènes via différents modes d’action. Il peut utiliser l’antibiose, la compétition et le parasitisme.

Antibiose

La sécrétion de substances antibiotiques est un phénomène très commun dans la nature. Ainsi, l’antibiose résulte de la production de substances qui agissent comme des « antibiotiques » et qui inhibent la croissance, la germination et la sporulation de l’agent pathogène. Une étude récente a montré que le filtrat de culture de Trichoderma harzianum peut complètement inhiber la germination et causer des gonflements au niveau des conidies des pathogènes responsables de la pourriture du collet du bananier par le mécanisme d’antibiose (Krimi, 2009)

Compétition

La compétition peut être définie comme étant une demande active et simultanée d’une même ressource de la part de deux ou plusieurs organismes et conduisant à la restriction de la taille de la population ou de l’activité microbienne de l’un ou de plusieurs d’entre eux (Clarke, 1965). Ces ressources sont le plus souvent des éléments nutritifs, de l’oxygène ou d’espace. La compétition se manifeste par l’aptitude de Trichoderma à utiliser les mêmes ressources du milieu (aires d’alimentation, sites de développement) que les champignons pathogènes mais Trichoderma emploie ce mode d’action surtout pour occuper les lieux avant l’arrivée des indésirables;

Mycoparasitisme

L’action mycoparasitaire de Trichoderma se manifeste par la destruction de l’agent pathogène lorsque Trichoderma s’enroule autour de celui-ci soit en l’étranglant soit en pénétrant à l’intérieur et lui « injectant » des substances (enzymes) qui le détruisent.
Trichoderma possède plusieurs mécanismes d’attaque potentiellement utilisables mais qui demeurent toutefois complexes. Il peut employer un ou plusieurs modes d’action en même temps pour maîtriser un agent pathogène. Le déploiement des modes d’action varie également selon les partenaires en présence et les conditions physico-chimiques du milieu (températures, humidité, etc.…). Trichoderma est efficace lorsqu’on lui permet de s’installer avant l’arrivée des champignons pathogènes. Son action est donc préventive. Il permet, au niveau des racines, de créer un manchon protecteur autour de celles-ci et ainsi contrer l’entrée des agents pathogènes à l’intérieur des racines. Une fois installé, Trichoderma peut avoir un effet stimulant pour la plante en absence de champignons pathogènes. (Caron et al., 2002)

Stimulation de la croissance de la plante

La production d’agents de lutte biologique (ALB) à base de Trichoderma date de longtemps et a été révisée au cours des dernières décennies par plusieurs scientifiques qui lui ont attribuée une importance en agriculture pour la lutte contre les maladies causées par les pathogènes. Les sols inoculés protègent les cultures et garantissent un milieu sain pour un développement normal de la végétation (Harman 2000). En effet, ce champignon secrète de multiples enzymes, antibiotiques, hormones qui sont utiles pour la croissance des plantes et leur confèrent une protection contre les pathogènes. Il en résulte aussi une amélioration du contenu du sol en nutriments. La présence de Trichoderma dans le sol joue à la fois un rôle préventif et curatif (Harman et al., 2004; Singh et al., 2007). Il a été prouvé que la souche T-22 de Trichoderma est capable d’augmenter le développement des racines chez le maïs et chez d’autres plantes (Harman 2000; Harman et al., 2004). Cet effet peut durer toute la vie des plantes annuelles et peut être induit par l’ajout de petites quantités de bioinoculants à base de Trichoderma appliquées sur les semences (moins de 1 g/ha). Les recherches récentes ont prouvé que les Trichoderma sont des opportunistes qui vivent en association bénéfique avec des plantes autant qu’ils sont des parasites pour quelques champignons. Au moins quelques souches établissent une colonisation robuste et durable au niveau des surfaces racinaires et pénètrent jusqu’à l’épiderme ce qui améliore la croissance racinaire, la productivité, la résistance au stress abiotique et l’assimilation et l’utilisation des nutriments (Harman et al. 2004).
De récentes recherches ont montré que T. viride est un améliorateur de croissance chez le soja (Harman, 2001) ; il protège la tomate, le piment (Verma, 2007) et quelques cucurbitacées contre les phytopathogènes.
Harman et al. 2004 ont ajouté que la colonisation des racines des plantes par Trichoderma améliore la croissance et le développement des racines mais aussi la productivité, la résistance au stress abiotique et le prélèvement et l’utilisation des nutriments. Le maïs répond généralement à l’ajout de fertilisants riches en azote par l’amplification de l’intensité de la couleur verte, une bonne croissance et un rendement maximum. Cependant, les plantes de maïs issues de semences traitées avec Trichoderma T-22 ont donné un rendement maximum avec un fertilisant contenant 40% moins d’azote par rapport à des semences non traitées avec T-22 (Harman 2000, 2001).

Production de métabolites intéressants

La mise en évidence de la production de métabolites secondaires par les Trichoderma sp. a été rapportée pour la première fois par Weidling (1936), concernant un antifongique (Papavizas, 1985). Depuis, les études successives ont démontré que ces micromycètes étaient virtuoses dans la biosynthèse de métabolites secondaires (Vizscaino et al., 2005), processus régi par des interactions biochimiques extrêmement complexes et parfaitement coordonnées (Vining, 1990). La littérature cite que les métabolites importants de Trichoderma sp. sont principalement des enzymes et des molécules bioactives.

Production d’enzymes

La production des enzymes est variable d’une souche à l’autre et sont principalement des xylanases ou des cellulases (Sandgren et al., 2005), exploités dans divers domaines biotechnologiques (Kubicek et al., 2003).

Production de substances bioactives

Parmi les substances bioactives produites par les Trichoderma on a :
 Les métabolites volatils représentées principalement par : le 6 pentyl α pyrone, l’éthylène, le cyanure d’hydrogène, les alcools, les aldéhydes (Vizscaino et al., 2005).
 Les métabolites non volatils diffusibles dont les plus connus sont : les polyacétates (antifongiques, antibiotiques), les trichotécènes (variété de toxines actives sur microorganismes et mammifères) notamment les trichodermines.
 Les métabolites polypeptidiques ciclosporines immunosuppresseurs anti-inflammatoire et les peptaïbols qui sont généralement assimilés à des mycotoxines peptidiques (Landreau., 2001).

Synthèses d’acides aminés

La biosynthèse des acides aminés (AA) chez les micromycètes : Les champignons sont capables de synthétiser les 20 AA usuels des deux séries levogyre (L) et dextrogyre (D), en plus d’autres particuliers, en partant de l’ammoniaque environnant provenant soit de la dégradation enzymatique de composés azotés organiques ou inorganiques ou bien suite à la fixation bactérienne de l’azote atmosphérique. Le rythme de croissance élevé des Trichoderma sp. leur permet d’assimiler rapidement l’ammoniaque.
La biosynthèse des AA est initiée par la production de glutamate, rare et précieux dans la nature, car il est la trame de synthèse du reste des AA et se trouve de ce fait à des concentrations élevées dans les cellules vivantes (Ahmed et al., 1995 ; Voet ., 1998).

Aspect de Trichoderma sur différents types de milieux de culture

Patato Dextrose Agar (PDA)

Sur milieu PDA, les colonies sont à croissance très rapide et peuvent envahir la boite de Petri dans les 48h. Le mycélium est de couleur blanche au départ et devient verte plus tard marquant le début de la conidiation. Le revers de la culture est incolore. Un ou plusieurs cercles concentriques de couleur verte peuvent se former autour du pont d’inoculation. La conidiation peut se faire du centre vers la périphérie de la boite et les conidies sont ensuite dispersées dans toute la boite. Chez certaines espèces, par exemple T. pseudokoningui, il peut y avoir la formation d’une zone irrégulière sans formation de conidies autour du point d’inoculation (Shah et al., 2012). On peut observer aussi la présence d’un pigment jaune secrété typiquement sur milieu PDA (Samuels et al., 2013)

Malt Extract Agar (MEA)

Sur milieu MEA, les colonies sont à croissance rapide d’aspect grumeleux, de couleur blanche au départ et devenant vert foncé par endroit. La moisissure se répartit de façon hétérogène sur la boîte de Petri. Le revers est jaune-orange. La présence de chlamydospores est possible et leur taille peut aller jusqu’à 14 μm. Des cercles concentriques peuvent se former ou non au niveau du mycélium cotonneux de couleur blanche et des conidies vertes d’aspects lumineux ou non peuvent se former sur toute la boite. Le pH du milieu augmente légèrement mais reste acide.

Czapek Dox (Dox)

Sur milieu Czapek, les colonies sont à croissance un peu plus lente que sur les autres milieux, Les  colonies ont un aspect gélatineux presque transparent. Le revers est de couleur crème. Les conidies peuvent se former dans toute la boite de Petri au niveau des cercles concentriques. On peut observer aussi des grappes jaunes formées de conidies autour du point d’inoculation (Shah et al., 2012). La croissance de l’espèce basidifie le pH du milieu.

Sabouraud (SB)

Sur milieu SB, les colonies compactées en touffes sont à croissance rapide. Le mycélium est cotonneux de couleur blanche tandis que le revers de la culture est crémeux. Des conidies peuvent se former dans toute la boite avec la présence de cercles concentriques blanchâtres autour du point d’inoculation.

Présentation du site d’échantillonnage

Les prélèvements de sols ont été effectués dans des parcelles de tomates au niveau du champ école de la licence professionnelle agro ressource et entreprenariat (LPAG). Ce champ (Figure 5) se trouve au niveau du jardin botanique du Département de Biologie Végétale de la Faculté des Sciences et Techniques de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar. Le sol est caractérisé : par un pH basique (8.4) mesuré à l’aide d’un pH-mètre à température ambiante avec agitation magnétique d’un mélange de 10 g de sol dans 25 ml d’eau, et une teneur en phosphore assimilable d’environ 7.14 mg/Kg de sol (Ndiaye, 2007). Ce champ est crée par le département de biologie végétale dans le but d’apporter des solutions à la maitrise de l’eau qui est un facteur clé dans le développement de l’agriculture d’un pays. Ainsi le champ école LPAG est entièrement équipé d’un système d’irrigation goutte à goutte et permet aux étudiants de mener leurs travaux de recherches.

Technique de prélèvement du sol

L’échantillonnage est effectué au niveau des racines des tomates. La surface du sol est d’abord débarrassée des feuilles mortes et des débris des végétaux. Puis à l’aide de spatules préalablement désinfectées à l’alcool, le sol est creusé jusqu’à des profondeurs allant de 10 à 30 cm au niveau de la rhizosphère. Ensuite les prélèvements sont effectués à ces horizons et le sol est mis dans des sachets en plastique puis ramené au laboratoire. La terre ainsi récolté est séchée à l’étuve à 30° pendant 2 jours et est immédiatement utilisée pour l’isolement des champignons du genre Trichoderma. Au niveau de ce site, les prélèvements ont été effectués dans trois parcelles de tomates. Pour chaque parcelle l’échantillonnage a été effectué dans deux zones choisies de manière aléatoire. Ce qui correspond à un total de 6 échantillons de sol.

Technique d’isolement

La technique utilisée pour l’isolement des Trichoderma est celle dite de « suspension dilution ». Le principe consiste à mettre le sol en suspension dans de l’eau stérile, puis à incorporer les différentes dilutions de cette suspension dans le milieu d’isolement. Cette technique comprend plusieurs étapes, allant de la préparation des dilutions jusqu’à l’interprétation des résultats (Rapilly, 1968). La préparation des dilutions consiste tout d’abord à ajouter 10g de sol à 90 ml d’eau physiologique stérile, puis à agiter pendant 30 mn, ce qui constitue la dilution 10—1. L’agitation permet d’homogénéiser le milieu et de libérer les microorganismes des différentes particules. Des prélèvements successifs de 10 ml dans cette suspension, puis dans les suivantes sont ajoutés chaque fois à 90 ml d’eau stérile et vont constituer les dilutions 10—2, 10—3, … jusqu’à 10—6(Figure 8). Rappelons que pour réaliser ces différents prélèvements, il est nécessaire d’utiliser des pipettes stériles qui sont changées à chaque dilution. Au moment de l’analyse 1 ml de chaque dilution est incorporé dans les boites de Petri et on verse par dessus le milieu de culture. Deux milieux de culture ont été utilisées pour l’isolement du champignon, le milieu PDA et le milieu MA2. Les milieux sont stérilisés à l’autoclave à 121° pendant 20mn. Les boites de Petri ensemencées sont homogénéisées par des mouvements circulaires et sont laissées sous la hotte jusqu’à leur solidification. Les boites sont ensuite para filmées puis incubées à la température ambiante. Trois boites sont ensemencées pour chaque dilution. Après 6 jours d’incubation les colonies individuelles présentant une couleur verdâtre et un aspect circulaire sont repiquées dans un nouveau milieu PDA.

Table des matières

Introduction
Synthèse bibliographique
1. Généralités sur Trichoderma
1.1. Historique de la classification
1.2 Ecologie
1.3 Morphologie
1.3.1. Conidiophores
1.3.2. Phialides
1.3.3. Conidies
1.3.4. Chlamydospores
1.4. Cycle de vie de Trichoderma
2. Importance de Trichoderma
2.1. Pouvoir antagonistes de Trichoderma
2.1.1. Antibiose
2.1.2. Compétition
2.1.3. Mycoparasitisme
2.2. Stimulation de la croissance de la plante
2.3. Production de métabolites intéressants
2.3.1. Production d’enzymes
2.3.2. Production de substances bioactives
2.3.3. Synthèses d’acides aminés
3. Aspect de Trichoderma sur différents milieux de culture
3.1.Patato Dextrose Agar
3.2.Malt Extract Agar
3.3.Czapek Dox
3.4.Sabouraud
Matériel et méthodes
1. Isolement de Trichoderma
1.1. Présentation du site d’échantillonnage
1.2. Technique de prélèvement des échantillons de sol
1.3. Technique d’isolement
2. Identification de Trichoderma
2.2. Au plan microscopique
3. Conservation des souches
4. Etude de la biologie de Trichoderma
4.1. Culture dans différentes conditions abiotiques
4.1.1. Culture dans différents milieux de culture
4.1.2. Culture dans différents pH
4.1.3. Culture dans différents température d’incubation
4.1.4. Culture dans différents pourcentage de sel
5. Tests d’antagonisme in vitro ..
5.1. Méthode de confrontation directe
5.2. Méthode de confrontation à distance
Résultats
1. Identification de Trichoderma
1.1.Examen macroscopique
1.2.Examen microscopique
2. Effets des facteurs abiotiques sur la croissance de Trichoderma
2.1.Effet des milieux de culture sur la croissance de Trichoderma
2.2.Effet de la Température d’incubation sur la croissance de Trichoderma
2.3.Effet du pH sur la croissance de Trichoderma
2.4.Effet de la salinité sur la croissance de Trichoderma
3. Tests d’antagonisme in vitro
3.1.Confrontation directe
3.2.Confrontation à distance
Discussion
1. Isolement de Trichoderma sp
2. Culture in vitro de Trichoderma sp
3. Tests d’antagonismes
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques

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