EFFETS DE L’EXTRAIT EB2 SUR LES ANIMAUX

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Les Albizia malgaches

A Madagascar, il existe 30 espèces d’Albizia dont 24 endémiques, 3 pantropicales et 3 introduites (DU PUY et coll., 2002). Grâce aux trav aux réalisés au LABASM, des données scientifiques sont disponibles sur quelques espèces d’ Albizia malgaches.

Usages traditionnels

• Albizia gummifera : les racines et les feuilles sont purgatives, et elles sont utilisées pour traiter la diarrhée et les affections oculaires ; la décoction de feuilles est réputée avoir des vertus antitussives et elle est administrée pour traiter l’asthme ; les feuilles sont appliquées sur les plaies et les fractures (DU PUYet coll., 2002).
• Albizia lebbeck : en médecine traditionnelle locale, elle est considérée comme ayant des propriétés astringentes. Suivant les endroits, elle peut être utilisée pour traiter les furoncles, la toux, les conjonctivites, la grippe, les gingivites, les tumeurs abdominales (LOWRY et coll., 1994).
• Albizia adianthifolia : diverses parties de la plante sont employées en médecine traditionnelle. La sève de l’écorce est appliquée sur les yeux pour traiter l’onchocercose et la conjonctivite. Elle est administrée par voie interne pour soigner les affections respiratoires, les douleurs et les réactions allergiques. Elle est aussi appliquée sur les plaies pour soulager les maux de dents. Une infusion ou une décoction de l’écorce est administrée pour traiter la gale et d’autres affections cutanées, et pour traiter la fièvre. L’écorce broyée est utilisée par voie externe suresl furoncles et les démangeaisons de la peau, et par voie interne comme vermifuge. Une décoction d’écorce des jeunes rameaux est administrée comme purgatif et comme antalgique (ARBONNIER, 2000 ; DU PUY, 2002).

Albizia étudiées au LABASM

Douze espèces d’Albizia ont déjà fait l’objet d’études au LABASM. Ces espèces sont endémiques de Madagascar. Leur liste est donnée dans le tableau n°2 suivant:
Tableau n°2 : Les espècesd’Albizia étudiées auLABASM
D’après les résultats, les principes actifs sont variables selon les espèces ou l’organe utilisé. Ces composés sont présentés dans le tableau n°3 (p. 9).
La plupart de ces composés sont de nature saponosidique ou alcaloïdique.
Les extraits ont présenté une activité sur sourisur, des animaux à sang froid, sur les végétaux et sur des microorganismes.
• Effets sur les animaux
Les résultats obtenus sur les animaux sont résumésdans le tableau n°4 (p. 10).
• Effets sur les microorganismes
Les différents extraits issus des Albizia malgaches se sont montrés actifs sur des germes GRAM + et GRAM -. Les résultats des tests d’activité antimicrobienne de quelques espèces d’Albiziasont récapitulés dans le tableau n°5 suivant.
• Effets sur les végétaux
Les extraits d’ Albizia ont été testés sur la germination de quelques graines de plantes potagères Monocotylédones et Dicotylédones et sural croissance des jeunes plantules. Les résultats sont résumés dans le tableau n°6 suivant:
Tableau n°6 : Effets de divers extraits des Albizia étudiés au LABASM sur les végétaux

Description botanique

Description de l’espèce greveana (DU PUY et coll., 2002)

Albizia greveana est un arbre ou arbuste de 10 m, le diamètre est de 40 cm, d’écorce grise (voir figure 1 suivante). Les feuilles sont à pinnule assez grande. Les gousses de 15 cm de long sont de couleur grise (voir figure 2 suivante). Les graines aplaties sont sub-quadrangulaires (voir figure 3, p. 16). Leur habitat est dans la savane à Tamarindus indica et Albizia sp.

Répartition géographique de l’espèce

Albizia greveana (voir figure 4, p. 17) est très fréquente à Mahajanga, Maintirano : 5 km à l’est sur la route vers Morafenobe et sur tout e la partie ouest de Madagascar. On la trouve surtout dans les forêts denses sèches ou dans les savanes.

Date et lieu de récolte

Les graines qui constituent le matériel d’étude ontété récoltées à Maintirano le 13 Août 2008 par Andriamahay M. et Rakotoarisoa S.E. du Silo National des Graines Forestières (SNGF).

Préparation et mode de conservation du matériel

Les graines sèches sont lavées avec de l’eau de javel 10% pour les désinfecter. Elles sont ensuite rincées avec de l’eau distillée puis échées à l’air libre pendant 1h. Les graines sèches sont broyées dans un mortier au moyen d’un pilon et le broyat est tamisé. Le matériel est soumis à une série de broyages/tamisages jusqu’à l’obtention d’une poudre très fine. Cette dernière est conservée dans des bocaux bien ferméset placés dans un endroit sec à la température ambiante.

Les produits chimiques

Les produits chimiques utilisés dans les expériences sont généralement de marque Merck, Prolabo ou Labosi et sont de qualité pure ou« pour analyse ».
Le support utilisé pour la chromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice 60F254 (Merck) muni d’un indicateur de fluorescence, étalé sur des feuilles en plastique (plaques prêtes à l’emploi de dimensions 20 20 cm, épaisseur de la couche : 0,2 mm).

METHODES

Méthodes d’extraction

Extraction aqueuse à froid (KAMOUN, 1991)

La poudre de graines est mise en suspension dans de l’eau distillée selon le rapport 1/10 (P/V), c’est-à-dire 1g de poudre dans 10 ml d’ eau distillée. La suspension obtenue est soumise à une agitation magnétique pendant 3h puis laissée macérer pendant une nuit à +4°C. Le macérat est mis au repos pendant quelques minutes à la température ambiante, puis agité une seconde fois pendant 30 min avant d’être filtrésur 4 épaisseurs de gaze. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10 000 tours/min pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse (Jouan, modèle TH12) Le culot est écarté et le surnageant est évaporé à sec (voir méthode de concentration §II.2.3, p. 21). Le résidu sec obtenu est repris dans de l’eau distillée dans le rapport 1/1 (P/V) c’est-à-dire 1g de poudre de graines pour 1 ml d’ex trait brut.

Extraction par épuisements successifs

Le matériel végétal est soumis à plusieurs épuisements par des solvants de polarité croissante. Il s’agit successivement de :
• l’hexane, solvant le moins polaire qui sert à l’ext raction des lipides et d’autres produits apolaires ;
• l’acétate d’éthyle (AcOEt) qui extrait les produits peu polaires comme les cardénolides et les composés phénoliques, ou les avonoïdesfl ;
• le méthanol (MetOH), solvant le plus polaire qui sert à extraire les stéroïdes, les sucres, les tanins, les quinones et les alcaloïdes.
Cinquante grammes de poudre de graines sont mis en suspension dans 500 ml de solvant (rapport 1/10, P/V). Le mélange est agité àla température ambiante pendant 3 h à l’aide d’un agitateur magnétique, laissé décanter 1h puis filtré sur papier filtre. Ce processus est répété jusqu’à épuisement du matériel, c’estdire-à- jusqu’à ce que l’extrait soit aussi limpide que le solvant de départ. Les filtrats sontalors rassemblés. Le marc est séché à l’air libre avant de continuer avec le second solvant, et ainsi de suite. Chaque extrait obtenu est évaporé à sec.

Méthodes de purification

Fractionnement par l’acétate d’éthyle (KAMOUN, 1987)

Principe

C’est une méthode d’extraction liquide-liquide basée sur le transfert d’un ou plusieurs constituants d’une première phase liquide (la solution aqueuse) vers une seconde phase liquide extractive (le solvant organique) pour laquelle ils ont plus d’affinité.

Mode opératoire

L’extrait aqueux à traiter et l’AcOEt sont mélangés volume à volume dans une ampoule à décanter puis le mélange est agité fortement. Il est laissé au repos jusqu’à séparation totale de deux phases : la phase supérieure organique et la phase inférieure aqueuse. La phase organique est recueillie. Le volume de la phase aqueuse est mesuré puis elle est soumise à deux autres fractionnements. Les trois phases organiques ainsi obtenues sont rassemblées, débarrassées du solvant par évaporation après ajout d’un grand volume d’eaudistillée et concentrées jusqu’à obtention du volume initial de l’extrait. La phase aqueuse est débarrassée de l’AcOEt résiduel par évaporation après ajout d’eau distillée.

Fractionnement par le n-butanol (KAMOUN, 1987)

Principe

Selon le même principe que précédemment, des substances mises en présence de deux solvants non miscibles et de polarités différentesse séparent en fonction de leur affinité relative vis-à-vis de ces solvants.

Mode opératoire

L’extrait à traiter est mélangé volume à volume avec le n-butanol dans une ampoule à décanter. Après une agitation énergique, le mélangeest laissé se décanter totalement, donnant 2 phases distinctes. La phase organique (phase supérieure) est recueillie et la phase aqueuse (phase inférieure) subit encore deux autres fractionnements successifs. Les trois extraits butanoliques ainsi obtenus sont rassemblés, additionnés d’un grand volume d’eau distillée et évaporés pour éliminer le solvant organique. Le butanol résiduel de la phase aqueuse est également éliminé par évaporation après ajout d’eaudistillée.

Méthode de concentration

Les volumes des extraits obtenus sont réduits par évaporation à 50°C au moyen d’un évaporateur rotatif (Büchi, Rotavapor R110) jusqu’au rapport 1/1 (P/V). Les solvants sont éliminés par évaporation à sec dans les mêmes conditions. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide. Les précipités éventuellement ormésf sont éliminés par centrifugation pendant 15 min à 10 000 tours/min (centrifugeuse Jo uan, modèle TH12).

Rendements

Le rendement est déterminé après l’extraction et àchaque étape de la purification.
L’extrait obtenu à chaque étape est évaporé à sec puis le résidu obtenu est pesé.
Trois types de rendements ont été déterminés :
• le rendement d’extraction calculé pour l’extrait brut par rapport à la poudre de départ ;
• le rendement calculé pour l’extrait purifié par raport à l’extrait brut, appelé rendement de purification ;
• le rendement calculé pour l’extrait purifié par raport à la poudre de départ, appelé rendement en toxines.
Le rendement est calculé selon la formule ci-dessou :
R : rendement en %
Pc : poids du ballon avec le résidu sec (g)
Pv : poids du ballon vide (g)
Q : poids de la poudre de départ (g)

Méthodes d’analyse

Chromatographie sur couche mince (RANDERATH, 1962 ; AUDIGIE et coll., 1982)

Principe

La chromatographie sur couche mince (CCM) est un procédé de microanalyse basé sur les phénomènes physico-chimiques de partage et d’adsorption. La séparation des molécules dépend de leur affinité pour l’adsorbant d’une part et leur solubilité relative dans les différentes phases en présence d’autre part.
Ainsi, l’échantillon est soumis :
• à des échanges entre la phase organique mobile (solvant de migration) et la phase polaire fixe (le support solide) ;
• aux forces d’adsorption dues au support chromatographique.

Mode opératoire

• Dépôt des échantillons :
Les plaques de gel de silice Merck (60F254) utilisées peuvent être découpées aux dimensions voulues. Les extraits à analyser sont déposés à l’aide d’un fin capillaire en traits horizontaux de 7 mm de long. Les dépôts sont espacé de 6 mm et situés à 1,3cm de deux bords latéraux et à 1,5cm du bord inférieur de la plaque. Chaque dépôt est immédiatement séché à l’aide d’un séchoir à main.
• Développement de la plaque :
La plaque préparée précédemment est placée verticalement dans une cuve chromatographique DESAGA. L’intérieur de celle-ci a été préalablement saturé par les vapeurs du solvant de migration : le système Butanol/Acide acétique/Eau (B/A/E ; 60/20/20 ; P/P/P), en tapissant ses parois internes de papier filtre imbibé de solvant. Quand le front du solvant parvient à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque, la chromatographie ascendante est arrêtée en retirant la plaque de la cuve et en laéchants à l’aide d’un séchoir à main.
• Révélation du chromatogramme
Elle se fait généralement de deux façons :
– par exposition de la plaque aux rayons ultra-violets (UV) de longueurs d’ondes 254 nm et 366 nm;
– par pulvérisation de la plaque avec le réactif à lavanilline sulfurique (composition en Annexe I).

Criblage phytochimique

Définition et principe (FONG et coll., 1977 ; DALTON, 1989 ; CORDELL, 1981)

Le criblage phytochimique est l’ensemble de tests physico-chimiques qui ont pour but de mettre en évidence les grandes familles chimiques présentes dans un matériel végétal.
Les composés réagissent avec des réactifs spécifiques et donnent naissance à des réactions de coloration, de précipitation, de floculation ou à des troubles caractéristiques.
La composition chimique des réactifs utilisés est onnéed enAnnexe II.

Préparation des extraits à tester

Quatre extraits sont préparés en vue d’effectuer lecriblage : les extraits aqueux, acide, hydroéthanolique 80% et chloroformique. 1 g de poudre de graines ou de résidu d’évaporation à sec d’extrait à analyser est mis en suspension da ns 10 ml de solvant puis laissé macérer à +4°C en une nuit. Le macérat est ensuite filtré surdu coton hydrophile. Le filtrat constitue l’extrait à analyser.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
I INTRODUCTION
II MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Matériel végétal
II.1.1.1 Classification de la plante
II.1.1.2 Description botanique de l’espèce
II.1.1.2.1 Description de l’espèce greveana
II.1.1.2.2 Répartition géographique de l’espèce
II.1.1.2.3 Lieu de récolte
II.1.1.2.4 Préparation et mode de conservation du matériel
II.1.2 Produits chimiques
II.2 METHODES
II.2.1 Méthodes d’extraction
II.2.1.1 Extraction aqueuse à froid
II.2.1.2 Extraction par épuisement
II.2.2 Méthodes de purification
II.2.2.1 Fractionnement par l’acétate d’éthyle
II.2.2.2 Fractionnement par le n-butanol
II.2.3 Méthode de concentration
II.2.4 Rendement d’extraction
II.2.5 Méthodes d’analyse
II.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
II.2.5.2 Criblage phytochimique
II.2.5.2.1 Définition et principe
II.2.5.2.2 Préparation des extraits à tester
II.2.5.2.3 Les différents tests de criblage phytochimique
II.2.5.2.3.1 Les alcaloïdes
II.2.5.2.3.2 Les tanins et polyphénols
II.2.5.2.3.3 Les saponosides
II.2.5.2.3.4 Les anthraquinones
II.2.5.2.3.5 Les désoxyoses
II.2.5.2.3.6 Les irridoïdes
II.2.5.2.3.7 Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
II.2.5.2.3.8 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
III RESULTATS
III.1 EXTRACTION
III.2 PURIFICATION
III.2.1 Fractionnement par l’acétate d’éthyle
III.2.2 Fractionnement par le n-butanol
III.2.3 Rendement de purification
III.2.4 Analyse des extraits par chromatographie sur couche mince
III.3 CARACTERISATION CHIMIQUE
III.3.1 Nature chimique
III.3.2 Propriétés physico-chimiques
IV DISCUSSION-CONCLUSION
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
I INTRODUCTION
II MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Les animaux d’expérimentation
II.1.1.1 Les souris
II.1.1.2 Les larves de moustique
II.1.1.3 Les têtards de grenouille
II.1.2 Les plantes d’expérimentation
II.1.3 Les matériels utilisés en microbiologie
II.1.3.1 Les microorganismes utilisés
II.1.3.2 Le milieu de culture
II.1.3.3 Les disques pour les tests d’antibiogramme
II.2 METHODES
II.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux
II.2.1.1 Test de toxicité aiguë sur souris
II.2.1.2 Détermination de la DL 50
II.2.1.3 Test sur les animaux à sang froid
II.2.1.4 Test sur les têtards de grenouille
II.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
II.2.2.1 Test sur le pouvoir germinatif des graines
II.2.2.2 Test sur la croissance des jeunes plantules
II.2.2.3 Test sur le développement des bourgeons axillaires
II.2.3 Méthodes d’étude des effets sur la croissance des microorganismes
II.2.3.1 Stérilisation
II.2.3.2 Etude de l’activité antimicrobienne
III RESULTATS
III.1 EFFETS DE L’EXTRAIT EB2 SUR LES ANIMAUX
III.1.1 Effets sur souris
III.1.1.1 Symptômes
III.1.1.2 Détermination de la DL 50 24h
III.1.2 Effets de l’extrait sur les animaux a sang froid
III.1.2.1 Effets de l’extrait sur les larves de moustique
III.1.2.2 Effets de l’extrait sur les têtards de grenouille
III.2EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
III.2.1 Effets de EB2 sur la germination des graines
III.2.2 Effets de EB2 sur la croissance des jeunes plantules
III.2.3 Effets de EB2 et E3 sur le développement des bourgeons axillaires
III.3EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
IV DISCUSSION-CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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