Effet inhibiteur de l’EHAD sur l’ulcère gastrique provoqué par la contrainte

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Etude chimique

Cette étude a été effectuée pour obtenir l’extrait hydro-alcoolique dépigmenté (EHAD) de la plante qui est utilisé pour les tests pharmacologiques et connaître les différentes familles de composés chimiques contenus dans la plante.

Préparation de l’extrait

Deux cents grammes de poudre de feuilles et de petits rameaux ont été macérés dans 1,5 litre d’un mélange l’éthanol-eau (80 : 20) pendant 3 jours à la température ambiante de laboratoire. Après filtration, le marc a été traité une deuxième fois dans les mêmes conditions. Puis après filtration, les deux filtrats ont été mélangés et évaporés sous vide à la température de 70°C à l’aide de ROTAVAPOR (Buchi type w 240) pour obtenir l’extrait brut.
L’extrait brut a été lavé à plusieurs reprises avec 250 ml d’hexane jusqu’à l’obtention d’une coloration claire. Après filtration, les filtrats ont été évaporés à sec sous vide à 40°C pour obtenir l’extrait hexanique tandis que le résidu séché par évaporation sous vide à 70°C constitue l’extrait hydro-alcoolique dépigmenté (EHAD). Le Schéma 1 résume la préparation de l’extrait brut et celle de l’extrait dépigmenté.

Test phytochimique

Ce test, basé sur la formation de complexes insolubles (réaction de précipitation) ou sur la formation de complexes colorés (réaction de coloration) en présence de différents réactifs pour chaque famille chimique (FONG et coll., 1977) a été effectué pour déterminer qualitativement la présence des différentes familles chimiques contenues dans l’EHAD d’Olax humbertii(Tableau I).

Etude pharmacologique

Le but de cette étude est d’évaluer l’activité anti-ulcéreuse de l’EHAD d’Olax humbertii sur différents modèles animaux chez le Rat.

Animal d’expérience

Des Rats adultes de souche Wistar, de sexe mâle ou femelle, pesant entre 180 et 200 grammes ont été utilisés.
Pour les test de toxicité, des Souris adultes de race Swiss, des deux sexes, de poids moyen de 25 grammes ont été utilisées.
Ces animaux sont issus de l’animalerie du Laboratoire de Pharmacodynamie de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo.
La veille de l’expérience pharmacologique et du test de toxicité, les animaux ont été mis à jeun, avec accès libre ou non à l’eau selon le protocole expérimental, dans des cages à plancher grillagé pour empêcher la coprophagie.

Mode d’administration de l’extrait

La voie orale a été le mode d’administration de l’EHAD utilisé dans tous les tests chez l’animal ; ceci pour être fidèle à l’utilisation traditionnelle. Pour cela, l’extrait a été dissous dans de l’eau distillée avant l’administration.

Protocoles expérimentaux

Pour mesurer l’activité anti-ulcéreuse de l’EHAD d’Olax humbertii, des tests in vivo chez le Rat ont été effectués en utilisant 3 techniques. Elles reposent sur le même principe : c’est de provoquer expérimentalement l’ulcère gastrique chez le Rat et d’étudier l’effet anti-ulcéreux de l’EHAD.

Ulcère de contrainte (GAIRARD et Coll., 1967)

Après 24 heures de jeûne ( suppression de nourriture et d’eau ) les animaux ont été répartis en 7 lots de 6 animaux, un lot témoin et 6 lots traités. Les animaux du lot témoin ont reçu 1 ml d’eau distillée et le même volume d’EHAD à différentes doses (25, 50, 100, 200 et 250mg/kg )ou de cimétidine, produit de référence, à la dose de 100mg/kg a été administré aux lots traités.
Tout de suite après l’administration de ces produits, chaque animal a été attaché par les pattes et fixés en décubitus dorsal par extension des quatre pattes sur un support grillagée en position horizontale.
Dix-huit heures après l’administration des produits, les animaux ont été sacrifiés et leur estomac a été prélevé, ouvert suivant la grande courbure, rincé et étalé pour compter le nombre d’ulcères (N ) afin de calculer l’indice d’ulcère ( IU) selon le mode suivant :
– lésions de plus de 3 mm, IU = N x 4.
– lésions de moins de 3 mm IU = N x 1.5.
– points hémorragiques, IU = N x 0.5.
L’indice d’ulcère calculé et présenté dans les résultats est la moyenne des valeurs de l’indice d’ulcère de chaque lot d’animaux.

Ulcère provoquée par l’éthanol 98° (MORIMOTO et Coll., 1991 )

Les animaux ont été mis à jeun mais ont eu accès libre à l’eau 24 heures avant le jour de l’expérience, puis ils ont été répartis en 7 lots de 6 animaux :
– 1 lot témoin où les animaux ont reçu 1 ml d’eau distillée.
– 6 lots traités dont 1 lot a reçu du Lansoprazol ( Lanzor® ) à la dose de 20mg/kg et les 5 autres lots de l’EHAD aux doses de 50, 100, 150, 200 et 250mg/kg.
Une heure après l’administration de ces produits, chaque animal a reçu, par voie orale 1 ml d’éthanol 98°.
Les animaux ont été sacrifiés une heure après l’administration de l’éthanol. Leur estomac a été prélevé puis ouvert le long de la grande courbure afin de mesurer la longueur de l’hyperhémie.
La valeur moyenne de la longueur totale de l’hyperhémie de chaque lot a été calculée.

Ulcère de contrainte de Shay par ligature de pylore ( Shay et coll.,1945)

L’intérêt de cette technique est basé sur la sécrétion gastrique qui représente un facteur essentiel de l’ulcérogénèse ( BADO, 1999 ).
Les animaux, mis à jeun la veille de l’expérience avec accès libre à l’eau, ont été répartis en 7 lots de 6 animaux.
L’abdomen de l’animal a été incisé sous anesthésie en utilisant l’éther et le pylore a été ligaturé. Immédiatement après cette opération, de l’eau distillée (lot témoin ) ou de la cimétidine ( lot de référence ) à 100mg/kg ou de l’EHAD (lot traité ) à 25, 50, 100, 150 et 200mg/kg a été administré par voie intraduodénale.
Après l’administration de ces produits, leur abdomen a été fermé par des sutures interrompues, lavé avec du sérum physiologique (NaCl 0.9%). Quatre heures après, chaque animal a été sacrifié. Leur abdomen a été réouvert et leur œsophage a été ligaturé. L’estomac a été prélevé et son contenu versé dans un tube gradué à centrifugation par une petite incision sur la grande courbure proche du pylore ligaturé. Le volume total de ce contenu gastrique a été mesuré puis centrifugé à 2000 tours par minute. Après la mesure de son volume, le surnageant a été récupéré et son pH a été mesuré à l’aide d’un pH-mètre électronique. L’acidité totale du surnageant a été déterminée par titration avec de la solution de NaOH 0.01N. Pour ce faire, 3 gouttes de phenolphtaléine ont été ajoutées dans le surnageant, puis la solution de NaOH a été versée dans ce mélange (surnageant/phénolphtaléine) incolore jusqu’à l’obtention de couleur rose. Le volume de NaOH versée a été enregistré .
Nb (mEq/L) x Vb (ml).
Acidité total (mEq/L) = Vs (ml).
Où :
Nb : Normalité de la NaOH.
Vb : Volume de la NaOH versée.
Vs : Volume du surnageant.
La valeur moyenne du pH, de l’acidité totale et du volume de la sécrétion gastrique pour chaque lot a été calculée.

Toxicité aiguë

Malgré l’innocuité apparente de l’utilisation traditionnelle d’Olax humbertii, il est indispensable de déterminer la toxicité éventuelle de cette plante ainsi que ses effets secondaires.
Après un jeûne de 24 heures avec accès libre à l’eau, les animaux ont été répartis en 5 lots de 6 animaux. Les animaux du lot témoin a reçu de l’eau distillée tandis que ceux des autres lots traités ont reçu des doses croissantes de l’EHAD :1g/kg (dose représentant approximativement 10 fois plus grande que la moyenne des valeurs de DE50 calculée pour chaque technique), 3g/kg, 5g/kg et 7g/kg. Le volume administré est fixé à 0.5 ml par animal.
Les animaux ont été observés 5mn, 10mn, 15mn, 30mn, 1h, 2h, 4h et 6h après l’administration de l’EHAD et de l’eau distillée ; pendant ces 6 premières heures d’observation, les animaux sont privés de nourriture et d’eau. Passé ce delai, ils ont été ensuite observés une fois par jour jusqu’au septième jour (MALONE et ROBICHAUD, 1962). Pendant cette deuxième période, les animaux ont reçu, à volonté, de la nourriture et de l’eau.

Expression des résultats et analyse statistique

– Pour l’étude pharmacologique, les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± s.e.m.
– Pour la comparaison des résultats, le test « t » de Student a été utilisé avec un seuil de degré de signification de 5% (p<0.05).

Etude pharmacologique

Ulcère de contrainte

L’immobilisation forcée des animaux provoque une ulcération de l’estomac souvent associée d’inflammation. Ces ulcères sous forme de tâches noires ou de points rouges, à bords lisses, de taille variant entre 0.5mm à 6mm de longueur, concernent surtout le corps de l’estomac (photographie 1)
Les résultats rapportant le pourcentage d’inhibition de l’ulcère gastrique en fonction de la dose de produits testés sont présentés sur le Tableau III et l’indice d’ulcère gastrique sur la Figure 1.
Ces résultats montrent que l’indice d’ulcère du lot témoin est 23.5. Le traitement par l’administration orale de l’EHAD de différentes doses (25, 50, 100, 200, 300mg/kg) ou de la cimétidine (10mg/kg) diminue cet indice d’ulcère. En effet, l’administration de l’EHAD à la dose de 25mg/kg diminue de façon significative (p<0.05) l’indice d’ulcère qui passe de 23.5 à 17.75 soit 24.46% d’inhibition par rapport au groupe témoin. Cette valeur de l’indice diminue de façon dose-dependante et n’est plus que de 2.83 (87,94%) à la dose de 300mg/kg, effet comparable à celui de la M-Cimétidine testée à 100mg/kg. La DE50 calculée est de 70.13 mg/kg.
Ce résultat montre que l’EHAD exerce une activité anti-ulcéreuse sur l’ulcère provoquée par la contrainte chez le Rat et cette activité varie avec la dose.

Ulcère de contrainte de Shay par ligature du pylore.

Après la ligature du pylore, le volume et l’acidité du suc gastrique du lot témoin augmentent. Le Tableau V rapporte l’effet de l’administration intraduodénale de l’EHAD (25, 50, 100, 150, 200mg/kg) sur les paramètres mesurés.
Ce tableau montre que le volume total du suc gastrique du lot témoin est de 4.13ml. et l’administration de doses croissantes de l’EHAD diminue ce volume en fonction de la dose de l’EHAD, Cette diminution est significative à partir de 100mg/kg d’EHAD et elle est de 0.76ml à la dose de 200mg/kg (p<0.001). Dans les mêmes conditions, la Cimétidine(100mg/kg) réduit le volume total du suc gastrique à 1.79ml.
Ces résultats montrent que l’administration intraduodénale de l’EHAD diminue de façon dose-dépendante le volume total du suc gastrique chez les animaux traités. Quand à la valeur du pH du suc gastrique, elle augmente chez les animaux traités par rapport à celui des animaux témoins. Ainsi, chez le lot témoin, le pH est de 1.43. et à partir de la dose de 50mg/kg le pH augmente significativement avec les doses téstées et atteint 4.08 à la dose de 200mg/kg. La Cimétidine(100mg/kg) augmente le pH à 5.08.
Ces résultats montrent que l’EHAD administré par voie intraduodénalet augmente de façon dose-dépendante le pH du suc gastrique.
Les résultats montrent aussi que chez les rats traités avec l’EHAD, l’acidité du suc gastrique diminue de façon significative, par rapport à celle des animaux témoins (143.46mEq/L/4h), à partir de 100mg/kg (92.66mEq/L/4h à 200mg/kg). Dans les mêmes conditions expérimentales, la cimétidine réduit aussi l’acidité gastrique (74.13mEq/L/4h à 100mg/kg).

Table des matières

INTRODUCTION
TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. Etude chimique
A. Préparation de l’extrait
B. Test phytochimique
II. Etude ethnopharmacologique
A. Animal d’expérience
B. Mode d’administration de l’extrait
C. Protocoles expérimentaux
1. Ulcère de contrainte
2. Ulcère provoqué par l’ethanol
3. Ulcère de contrainte de Shay par ligature de pylore
D. Toxicité aiguë
E. Expression des résultats et analyse statistique
RESULTATS OBTENUS
I. Etude chimique
A. Rendement
B. Criblage phytochimique
II. Etude pharmacologique
A. Effet inhibiteur de l’EHAD sur l’ulcère gastrique provoqué par la contrainte
B. Activité inhibitrice de l’EHAD sur l’ulcère gastrique provoqué par l’éthanol
C. Activité inhibitrice de l’EHAD sur le volume, le pH et la sécrétion acide
Gastrique provoqué par la ligature de pylore
D. Test de toxicité aiguë
DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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