Soutenance mémoire
Les denrées stockées remonte jusqu’à la récente histoire de l’humanité, au moment où l’homme commençait à stocker ses denrées alimentaires afin de subvenir à ses besoins pendant les périodes difficiles où la nourriture se faisait rare, l’homme doit sans relâche protéger ses réserves alimentaires. Les pertes de production avant récolte des cultures mondiales majeures dues aux ravageurs (insectes, micro-organisme) et aux adventices sont estimées à 35 %. Sans une protection efficace des cultures, ces pertes seraient de 70 % (Popp et al., 2013). Les pesticides sont actuellement utilisés dans de nombreux domaines comme la santé publique, l’hygiène vétérinaire, la protection des denrées alimentaires, les usages domestiques ou encore l’entretien des espaces publiques. Cependant, ces produits restent principalement utilisés dans le domaine agricole afin d’accroitre, de stabiliser les rendements et d’assurer une meilleure rentabilité de la production alimentaire (Nauen & Bretschneider, 2002; Calvet et al., 2005). Leur utilisation a également contribué à l’amélioration de la santé publique en luttant contre certains insectes vecteurs de maladies (Ramade, 2011). De ce fait, ils sont devenus un enjeu économique et sanitaire important. Néanmoins, leur utilisation massive dans l’environnement peut perturber plusieurs systèmes physiologiques tels que la croissance, la reproduction et le métabolisme des organismes non visés (Kegley et al., 1999). L’usage des pesticides en agriculture existe depuis des millénaires. D’abord, on utilisait des composés relativement simples à base d’arsenic, de soufre, de chaux, ensuite des dérivés du pétrole et des substances à base de fluor ou extraits de plantes comme la nicotine (Philogène et al., 2002). Cependant, ce n’est qu’au XIXe siècle que l’utilisation des pesticides a connu un développement important justifié par l’accroissement démographique de la population humaine, l’affaiblissement des terres agricoles et l’apparition du machinisme agricole. Depuis, les traitements des cultures sont à base de sulfate de cuivre ou de mercure. Les insecticides tels l’arsénite de cuivre, l’acétoarsénite de cuivre, l’arséniate de plomb et le pyrèthre ont fait leur apparition. Au cours de la seconde guerre mondiale, les pesticides ont profité très largement du développement de la chimie organique avec l’apparition des insecticides de synthèse qui sont majoritairement des composés organochlorés. Le dichlorodophenyltrichloroethane (DDT) fut très efficace dans la lutte contre les insectes ravageurs comme les moustiques vecteurs du paludisme .
Matériel biologique
Présentation du matériel biologique
Ephestia kuehniella (Zeller) 1879, insecte holométabole lépidoptère de la famille des pyralidés, est une espèce cosmopolite qui est originaire de l’Inde mais existe aussi dans les régions tempérées, notamment la méditerranée. Elle provoque des dégâts principalement sur la farine (Doumandji–Mitiche, 1977) d’où le nom « Pyrale de la farine », mais également sur les grains de céréales, biscuits, pâtes alimentaires, chocolat et riz. Sa position systématique est la suivante :
Règne : Animalia
Sous règne : Metazoa
Embranchement : Arthropoda
Sous Embranchement : Hexapoda
Classe : Insecta
Sous classe : Pterygota
Super ordre : Endopterygota
Ordre : Lepidoptera
Famille : Pyralidae
Genre : Ephestia
Espèce : kuehniella (Zeller)
De type à mœurs nocturnes, Ephestia kuehniella (Zeller) se tient au repos contre les murs ou caché dans la farine (Balachowsky, 1972). Ses larves facilement identifiables, présentent une tête bien développée et un corps clairement découpé en trois segments. Leur développement est fortement influencé par l’environnement, à savoir la température, l’humidité, et les sources de nourriture.
Cycle de vie d’E. kuehniella
Le cycle complet du développement d’Ephestia kuehniella (Zeller) est de 80 jours (Figure 1). L’accouplement a lieu immédiatement après le début de la vie adulte. Juste après, sur une période de 3 jours, la femelle pond environ 100 à 200 œufs de couleur blanchâtre, de forme ovoïde, d’une longueur de 440 µm, et une largeur de 250 µm. Après 4 à 5 jours, les œufs formant un amas au fond et sur les parois des sacs de farine, éclosent en donnant naissance à des larves blanchâtres.
Six mues plus tard, les larves achèvent leur croissance, elles sont totalement brunes et mesurent entre 10 à 13 mm. Elles quittent alors leur source de nourriture en tissant une enveloppe de soie «cocon » contenant des substances nutritives dans laquelle elles évolueront pendant 8 à 12 jours donnant un stade immobile dans les coins sombres des bâtiments ou des machines. À l’émergence, l’adulte de couleur grise, mesure 10 à 12 mm d’envergure; il a une petite tête globulaire et formé par deux paires d’ailes : deux ailes antérieures grisâtres avec des points noires et deux ailes postérieures blanchâtres finement frangées. La finalité de la vie adulte est la reproduction. Les mâles meurent en général quelques jours après l’accouplement, les femelles après la ponte (Balachowsky, 1972). La distinction des sexes est bien visible au stade larvaire où les larves mâles portent des taches brunes qui représente les testicules.
Condition d’élevage
La farine infestée a été obtenue du moulin Hippone (Annaba). L’élevage est réalisé au laboratoire à une température de 27°C et une humidité relative de 80% et une photopériode de 14h de lumière (Payne, 1966). Les larves femelles du dernier stade sont récoltées, et isolées dans des boites en plastique contenant la farine et du papier plissé pour qu’elles puissent se nymphoser. Après la mue nymphale, les chrysalides sont traitées et mises dans des boites de pétrie.
Présentation de l’insecticide
Le (RH-2485), communément appelé méthoxyfénozide, est le nom commun du 3- methoxy-2-methylbenzoic acide 2- (3,5-dimethylbenzoyl) -2- (1,1dimethylethyl) hydrazine; N-tert-butyl-N’- (3 methoxy-o-toluoyl)- 3,5 xylohydrazide. Sa formule empirique est : C22 H28 N2 O3 et son poids moléculaire est de 368,47g (Fig. 2). Le méthoxyfénozide a été découvert par la compagnie (Rohm & Haas, Spring House PA, USA) en 1998, cette molécule a été aimablement fourni par Pr. G. Smagghe (Ghent University, Belgium). C’est un régulateur de croissance, agoniste de la 20E, qui mime l’action de l’hormone de mue, dérivé de la bisacylhydrazine à structure non steroidiale.
Dose et traitement
Le RH-2485 a été administré in vivo par une application topique aux deux doses de : 0,01µg/insecte pour une inhibition de 50 (DL50), et 0,37µg/insecte pour une inhibition de 90 (DL90). Les deux doses ont été déterminées précédemment par Soltani-Mazouni et al., 2012. Le produit a été dilué dans l’acétone, 2µl ont été déposé sur la face ventrale de l’abdomen des chrysalides femelles nouvellement exuviées (0 jour) à l’aide d’une seringue Hamilton. Les chrysalides témoins ne reçoivent aucun traitement.
Morphométrie de l’ovaire
Les paramètres morphométriques des ovaires témoins et traitées ont été mesurées sur des coupes histologiques au cours de la métamorphose (1, 3, 5, 7, et 9 jour). La longueur, la largeur de l’ovocyte basal, ainsi que l’épaisseur de l’épithélium folliculaire ont été mesurées à l’aide d’un micromètre oculaire monté sur un microscope préalablement étalonné.
Techniques histologiques
La structure des ovaires des séries témoins et traitées, ainsi que le tégument sternal abdominal ont été déterminées sur des coupes semi – fines à différentes âges au cours de la métamorphose (0, 1, 3, 5, 7, et 9 jour) préparées selon la technique histologique, réalisées selon les indications de Martoja & Martoja, (1967). Les échantillons doivent passer par plusieurs étapes afin d’éviter toute altération des tissus et assurer la stabilité de leurs structures macromoléculaires. Ces étapes sont : fixation, inclusion, confection des coupes, coloration, et montage.
* Fixation : cette étape a pour but la conservation des structures contre l’attaque microbienne et l’opposition à l’autolyse des constituants fondamentaux sous l’effet d’enzymes cellulaires pour éviter la destruction des protéines des tissus, le durcissement des pièces de façon à faciliter les coupes et la préparation de l’échantillon aux traitements ultérieurs, notamment en augmentant l’affinité du protoplasme pour les colorations. La fixation a été réalisée sur la chrysalide entière dans du Bouin alcoolique (formol 26 ml, acide acétique 7 ml, 45ml de solution d’acide picrique à 1 % dans l’alcool 95°et 22 ml d’eau distillée) pendant 48 heures.
* Inclusion : la pièce fixée, doit être incluse dans une matière plastique chimiquement neutre. Le principe de l’inclusion consiste à traiter les pièces dans un ordre déterminé par différents solvants de manière à faire pénétrer dans un tissu, à l’origine hydraté, une substance hydrophobe, qui maintiendra ses éléments en place lors de la coupe : ceci implique que la pièce soit soumise à une série de traitements successifs par des mélanges dont chacun est destiné à préparer la pénétration de celui qui le suivra et à éliminer celui qui l’a précédé. Chaque solvant doit être évidement miscible à celui qui le précède et à celui qui le suit. On procède tout d’abord à deux bains de 24 heures dans l’alcool 95°, puis à trois bains de 24 h dans le butanol (liquide d’attente ou intermédiaire), ensuite on passe à l’inclusion dans la paraffine. On effectue d’abord une imprégnation par plusieurs bains de paraffine.
La mise en bloc se fait dans des cassettes en plastique, qui nous donne des blocs de paraffine, avec la pièce à l’intérieure.
* Confection des coupes : les coupes sont réalisées à l’aide d’un microtome (Stassinier LEICA AN 2125 RT) qui comporte un support de rasoir, un support d’objet et un système d’avance mécanique. Le bloc, contenant la pièce est taillé et fixé sur le porte objet sous l’action de la chaleur. L’excès de paraffine, entourant la pièce est enlevé, avec une lame de scalpel. Le bloc est orienté parallèlement au rasoir. On obtient ainsi des rubans droits de paraffine. L’épaisseur des coupes est de 5 à 7µm.
Les rubans obtenus mis sur des lames soigneusement nettoyées, marquées avec une pointe de diamant sur lesquelles on dispose de l’eau gélatinée, qui permet de coller les rubans des coupes. La lame est mise sur une platine chauffante (20°C), Ces lames sont mises dans une étuve à 37°C pendant 24h afin de compléter le séchage des coupes.
* Déparaffinage et coloration : le déparaffinage élimine le milieu d’inclusion et précède la coloration. Les coupes sont d’abord traitées par le xylène (3 bains de 3 minutes chacun). Elles sont ensuite plongées dans trois bains d’alcool 95° (2 minutes chacun) et lavées à l’eau courante et à l’eau distillée. Les coupes sont ensuite colorées à l’hématoxyline pendant 10 minutes. Le rinçage se fait dans l’eau, puis dans l’eau ammoniaquée, l’eau courante puis à l’eau distillée. On colore ensuite les coupes à l’éosine pendant 5 minutes et on les rince à l’eau courante et à l’eau distillée. On les passe dans deux bains d’alcool (95°) afin d’éliminer l’excès d’éosine puis dans un mélange acétone-xylène.
* Montage : les coupes colorées ne supportant pas le desséchement, il est nécessaire d’interposer entre la lame et la lamelle un milieu de montage qui doit être transparent pour satisfaire les conditions d’observation. Les lames colorées doivent être conservées, pour cela on utilise du baume de Canada. Ensuite elles sont séchées dans une étuve à 37°C pendant 24 h. Les lames sont observées par un microscope photonique préalablement étalonné pour faire les mensurations.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel biologique
1.1. Présentation de matériel biologique
1.2. Cycle de vie d’E. kuehniella
1.3. Condition d’élevage
2. Présentation de l’insecticide
3. Doses et traitement
4. Morphométrie de l’ovaire
5. Techniques histologiques
6. Analyse quantitatif et qualitatif des protéines ovariennes
6.1. Etude électrophoritique des protéines ovariennes
6.1.1. Extraction des protéines ovariennes
6.1.2. Principe de l’électrophorèse
6.2. Dosage des protéines ovariennes
7. Quantification des vitellogénines et des vitellines
7.1. Prélèvement des ovaires
7.2. Extraction et dosage des vitellogénines et des vitellines
8. Analyse statistique
CHAPITRE 1 : Impacts sur la reproduction
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
2.1. Effet du méthoxyfenozide sur la morphométrie de l’ovaire
2.1.1. Effet du méthoxyfenozide sur la taille de l’ovocyte basale
2.1.2. Effet du méthoxyfenozide sur l’épaisseur de l’épithélium
folliculaire
2.2. Effet du méthoxyfenozide sur les protéines ovariennes
2.2.1. Effet du methoxyfenozide sur la quantité des protéines ovariennes
2.2.2. Effet du méthoxyfenozide sur profil électrophorétique des protéines ovariennes
2.3. Effet du méthoxyfenozide sur les vitellogénines et les vitellines dans les ovaires
2.3.1. Effet du méthoxyfénozide sur les vitellogénines dans les ovaires
2.3.2. Effet du méthoxyfenozide sur les vitellines dans les ovaires
3. DISCUSSION
3.1. Effet sur la morphométrie de l’ovaire
3.2. Effet sur l’épithélium folliculaire
3.3. Effet sur la structure de l’ovaire
3.4. Effet sur les protéines ovariennes
3.5. Effet sur les vitellines et les vitellogénines
CHAPITRE 2 : Impacts sur le développement
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
2.1. Effet du méthoxyfenozide sur la sécrétion cuticulaire
2.1.1. Effet du méthoxyfenozide sur l’épaisseur de la cuticule nymphale totale
2.1.2. Effet du méthoxyfenozide sur l’épaisseur de la nouvelle cuticule
2.2. Effet du méthoxyfénozide sur la structure du tégument sternal abdominal
3. DISCUSSION
3.1. Effet du méthoxyfenozide sur la sécrétion cuticulaire
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RESUMES
Français
Anglais
Arabe
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE
