Dynamique des cellules souches intestinales et voies de signalisation

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Dynamique des cellules souches intestinales et voies de signalisation

L’analyse des mécanismes contrôlant le maintien et le renouvellement des cellules souches intestinales (ou ISC pour « Intestinal Stem Cells ») est essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie du tissu. De nombreuses analyses ont été faites et ont montré le rôle fondamental de la voie de signalisation Wnt dans ce processus. En effet, le patron d’activation de la voie Wnt canonique corrèle avec les capacités prolifératives des cellules épithéliales intestinales : en effet, cette activité est majoritairement retrouvée dans les cryptes (Gregorieff et al., 2005) (Figure 7). La fixation d’un ligand de Wnt sur son récepteur entraine la stabilisation du cofacteur de transcription β-CATENINE qui est alors relocalisé dans le noyau et permet l’expression des gènes cibles de Wnt, en association avec les facteurs de transcription TCF/LEF (Figure 8). Ainsi, dans l’épithélium intestinal, le KO du facteur de transcription Tcf4 chez la souris est létal 1 jour après la naissance (Korinek et al., 1998). De même, le KO conditionnel chez l’adulte entraîne la perte totale de la prolifération 3 jours après le début de l’induction, ainsi que la perte de l’expression des gènes marqueurs des cellules souches CBC, cibles ou non de Wnt (Lgr5, Olfm4). Enfin, 1 semaine après la délétion de Tcf4, la taille des villosités diminue fortement, ce qui prouve le rôle de la voie Wnt dans l’homéostasie de l’épithélium et son renouvellement (van Es et al., 2012a). L’inhibition de la voie Wnt par son inhibiteur physiologique DKK1 entraîne l’apparition du même phénotype (Kuhnert et al., 2004). A l’inverse, l’activation constitutive de la voie Wnt, via la perte d’un autre inhibiteur de la voie : APC, entraîne une augmentation du nombre de cellules prolifératives, dont la localisation n’est alors plus restreinte au compartiment de la crypte (Sansom et al., 2004). Cette perte favorise aussi l’apparition de tumeurs intestinales (Fodde et al., 1994). Enfin la voie Wnt est également importante pour l’inhibition de la différenciation dans les cryptes. Pour cela, cette voie inhibe l’expression du facteur de transcription majeur de la différenciation : Cdx2, ainsi que sa cible Muc2 (marqueur des cellules à mucus différenciées), grâce à l’expression dans la crypte du facteur de transcription cible de Wnt : Sox9 (Blache et al., 2004). Tout ceci montre l’importance de la voie Wnt dans le maintien de la prolifération, de l’identité des cellules de la crypte intestinale et, par conséquence, l’importance de cette voie dans le renouvellement et le maintien de l’épithélium intestinal.
De manière similaire, la voie de signalisation Notch a également un patron d’activation restreint aux cryptes (cf Figure 7), ce qui suggère là encore un rôle dans le maintien des cellules souches (van Es et al., 2005; Riccio et al., 2008). La voie Notch agit via une signalisation juxtacrine, c’est-à-dire qu’elle nécessite un contact entre des facteurs exprimés par 2 cellules adjacentes : l’une qui exprime le ligand (ex : DLL1 ou 4) et l’autre qui exprime le récepteur (ex : NOTCH 1 ou 2) (Figure 9A). L’activation de la voie Notch dans la cellule réceptrice inhibe l’expression des ligands de Notch dans cette même cellule, qui ne pourra donc pas activer la voie dans ses cellules voisines. Ce mécanisme, appelé inhibition latérale, permet de contrôler l’activation de cette voie de façon binaire (Figure 9B). L’inhibition de cette voie, via le KO d’un facteur de transcription essentiel de la voie : Rbpj, ou via le KO des récepteurs Notch1 et Notch2, entraine une perte de la prolifération des cellules de la crypte. Ces cellules sont remplacées par des cellules post-mitotiques à mucus (van Es et al., 2005; Riccio et al., 2008). Ces études montrent l’importance de la voie Notch pour le maintien de l’identité et de la prolifération des ISC.
La localisation très spécifique de l’activation de ces voies fondamentales pour le maintien des ISC (cf Figure 7), appelée niche des cellules souches, pose la question des types cellulaires capables de générer cette niche. La localisation des cellules de Paneth, intercalées entre les cellules souches, font d’elles de bonnes candidates pour la régulation de la niche et donc le maintien des cellules souches. Une étude en 2011 a montré que ces cellules sont indispensables à la survie des ISC in vivo chez la souris, grâce probablement à leur sécrétion de ligands de la voie Wnt (WNT3 et 11) et d’EGF, ainsi qu’à l’expression des ligands de Notch (DLL1 et 4) (Sato et al., 2011). Cependant, 2 études plus récentes ont montré que la perte des cellules de Paneth n’entrainait pas de perte des ISC in vivo au cours du développement (Kim et al., 2012), ni durant le renouvellement normal ou après irradiation de l’épithélium (Durand et al., 2012). La différence majeure entre les 3 études est le modèle d’induction de la perte des cellules de Paneth : dans la première, il s’agit soit d’un KO du facteur répresseur de transcription Gfi1 qui est impliqué dans la différenciation des cellules de Paneth et des cellules à mucus, soit de l’expression de toxine diphtérique A sous la dépendance du promoteur de la cryptidine (spécifique des cellules de Paneth), ou encore via le KO du facteur de transcription Sox9 (Sato et al., 2011). Dans les 2 autres études, la déplétion des cellules de Paneth est obtenue par le KO du facteur de transcription spécifique du lignage sécrétoire : Math1 (ATOH1 chez l’homme) (Durand et al., 2012; Kim et al., 2012). Une étude récente montre que le phénomène d’inhibition latérale survient entre les cellules de Paneth et les ISC (Chen et al., 2017) (Figure 9B), les cellules de Paneth exprimant les ligands de Notch (DLL1 et 4), ce qui active la voie Notch dans les ISC et a pour conséquence le maintien des ISC, mais aussi la diminution de l’expression de Math1 dans ces cellules. On peut donc émettre l’hypothèse que la diminution de l’expression de Math1 dans les ISC est importante pour leur maintien. L’augmentation de la prolifération dans les cryptes des souris sous l’effet d’une suractivation de Notch, et donc d’une diminution de l’expression de Math1, est en accord avec cette hypothèse (Fre et al., 2005), de même que l’augmentation de l’expression de certains marqueurs des ISC dans le KO Math1 (Durand et al., 2012). Cette hypothèse permettrait de réconcilier les 2 hypothèses sur le caractère indispensable ou non des cellules de Paneth pour la niche des ISC, où les cellules de Paneth seraient indispensables pour activer la voie Notch dans les ISC, et notamment pour diminuer l’expression de Math1 (Chen et al., 2017; Durand et al., 2012; Sato et al., 2011). Cependant les cellules de Paneth ne semblent pas indispensables pour la production des autres signaux de la niche souche (WNT, EGF…), comme en témoigne l’intégrité des ISC, même sans cellules de Paneth dans le KO Math1 (Durand et al., 2012; Kim et al., 2012). De plus, une étude a montré que la sécrétion des ligands de Wnt, par les cellules épithéliales, n’est pas indispensable au maintien de l’épithélium (San Roman et al., 2014), ce qui confirme le caractère non indispensable de la sécrétion de WNT par les cellules de Paneth. La localisation spécifique des cellules de Paneth est également cohérente avec le mode de signalisation juxtacrine de la voie Notch. De plus, dans le colon, où il n’y a pas de cellules de Paneth, il a été montré qu’une sous-famille de cellules à mucus exprime les ligands de Notch (DLL1 et 4) et est localisée entre les cellules souches du colon (Rothenberg et al., 2012). Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, il semble intéressant d’analyser le maintien des ISC, et donc le renouvellement de l’épithélium, après inhibition de l’expression des ligands de ces voies de signalisation spécifiquement dans les cellules de Paneth. Au vu de ces résultats, la présence d’un autre type de cellule capable de sécréter les facteurs essentiels à la niche des ISC semble requise. Les cellules mésenchymateuses localisées en dessous de l’épithélium intestinal semblent jouer ce rôle. Il a été montré, par de nombreux travaux, que les cellules mésenchymateuses proches des cryptes expriment et sécrètent les facteurs essentiels au maintien des ISC de l’épithélium (Stzepourginski et al., 2017) (Figure 10). Par exemple, il a été montré que l’ablation d’une sous-population de ces cellules, les fibroblastes Foxl1+ entraine la perte des ISC de l’épithélium (Aoki et al., 2016). Ces cellules produisent les facteurs WNT2b, WNT5a, RSPO3 et GREM1 et 2, et ont pour fonction d’activer la voie Wnt et d’inhiber la voie Bmp. Cependant, une autre étude a montré que l’inhibition de la sécrétion des ligands de Wnt dans un autre type de cellules mésenchymateuses, les myofibroblastes, grâce au KO de Porcn (gène codant pour la protéine PORCN qui permet la sécrétion des ligands de WNT) n’a pas d’effet sur la signalisation Wnt dans l’épithélium et le maintien des ISC (San Roman et al., 2014). De plus, lorsque Porcn est délété à la fois dans ces myofibroblastes et dans l’épithélium, il n’y a, là non plus, pas d’effet sur le maintien des ISC. L’absence d’effet de ces délétions sur les cibles de la signalisation Wnt dans ces souris suggère que d’autres cellules mésenchymateuses sont capables de produire les ligands de Wnt (San Roman et al., 2014).
Tous ces résultats montrent la complexité de la régulation de la niche des ISC. Certains types cellulaires semblent indispensables à la production de certains signaux spécifiques, alors que d’autres semblent plutôt être impliqués dans la robustesse des signaux de la niche des ISC.

Choix, engagement dans un lignage et différenciation en cellules spécialisées

Rôle des voies de signalisation

Les ISC s’auto-renouvellent mais aussi se divisent en cellules progénitrices ; pour cela, elles se divisent soit de manière symétrique (une cellule souche qui donne 2 cellules souches), soit de manière asymétrique (une cellule souche qui donne 1 cellule souche et une cellule progénitrice). Les cellules progénitrices sont localisées au-dessus de la zone des ISC dans les cryptes. Elles prolifèrent de manière très active et s’engagent ensuite vers la différenciation d’un des 2 lignages (cf Figure 4 et 5). Pour le maintien de la prolifération et de l’identité de ces cellules, les voies de signalisation Notch et Wnt sont essentielles, comme le montre la perte du marquage de cellules prolifératives KI67 dans les cryptes lors de l’inhibition de ces voies (van Es et al., 2005, 2012a). Le choix de l’engagement dans le lignage sécrétoire ou absorbant est principalement contrôlé par la voie de signalisation Notch, via le contrôle du ratio entre les facteurs de transcription HES1 (favorisant le lignage absorbant) et MATH1 (favorisant le lignage sécrétoire ; appelé ATOH1 chez l’Homme) (voir Figure 5). Il a été montré que l’activation constitutive de la voie Notch, via l’expression de la forme constitutivement active du récepteur NOTCH1 dans l’épithélium intestinal, entraine la perte de tous les types cellulaires du lignage sécrétoire. De plus, les entérocytes présentent des microvillosités moins nombreuses et moins rigides à leur pôle apical, comme pour les cellules moins différenciées, confirmant le rôle de Notch dans le maintien de l’identité des cellules progénitrices peu différenciées (Fre et al., 2005). Lors de l’inhibition de Notch, par le KO du facteur de transcription Rbpj ou par inhibition pharmacologique, le phénotype inverse apparait avec la perte des entérocytes au profit du lignage sécrétoire, et notamment des cellules à mucus (van Es et al., 2005). Dans ces 2 cas, les expressions des facteurs de transcription Hes1 et Math1 sont dérégulées de manière opposée et l’étude du rôle de ces facteurs dans le contrôle du choix du lignage a donc été menée. Le KO de Math1 entraine la perte des cellules du lignage sécrétoire, alors que les entérocytes ainsi que l’expression de Hes1 semblent non affectés (Shroyer et al., 2007; Yang et al., 2001). Le KO de Hes1 a peu d’effet sur l’épithélium intestinal, avec seulement une légère augmentation du nombre de cellules du lignage sécrétoire, une absence d’effet majeur qui peut être expliquée par la compensation par d’autres facteurs de transcription de la même famille : HES3 et 5. D’ailleurs, le KO des 3 engendre une plus forte augmentation du nombre des cellules sécrétoires et une augmentation de l’expression de Math1 (Ueo et al., 2012). Enfin Kim et ses collaborateurs ont étudié l’épistasie entre ces facteurs. Le KO Rbpj, comme dans les études précédentes, entraine l’augmentation du lignage sécrétoire et la perte des entérocytes avec la diminution de l’expression de Hes1 et l’augmentation de l’expression de Math1. Le KO de Math1, additionné à celui de Rbpj, réverse le phénotype avec une perte du lignage sécrétoire et une différenciation des entérocytes qui parait normale (Kim and Shivdasani, 2011). Ces résultats confirment l’épistasie entre la voie Notch et le facteur de transcription MATH1 dans le contrôle du choix du lignage. Cela confirme également le rôle fondamental de MATH1 dans le choix du lignage sécrétoire, et suggère que la perte des entérocytes dans le KO Rbpj n’est pas directement dû à l’inhibition de la voie Notch, mais plutôt à la très forte augmentation des cellules sécrétoires grâce à la dé-répression de Math1. Cette hypothèse est corroborée par la présence, dans les KO Hes1/3/5, d’entérocytes qui semblent fonctionnels (Ueo et al., 2012). La présence ou non du facteur de transcription MATH1 est donc essentielle au choix du lignage dans l’épithélium intestinal, et la voie Notch contrôle cette présence via le facteur de transcription HES1. Enfin, l’inhibition latérale médiée par la voie Notch permet de favoriser le lignage absorbant par rapport au lignage sécrétoire. En effet, lors du choix du lignage, une cellule progénitrice active pour la voie Notch, qui sera un futur entérocyte, inhibe la voie Notch de sa cellule voisine, qui sera une future cellule sécrétoire. Or la première continue de proliférer et donne donc plusieurs précurseurs d’entérocytes, alors que la seconde arrête rapidement. Ceci montre comment, à partir de 2 cellules progénitrices, la voie Notch, via l’inhibition latérale, permet la prédominance des cellules absorbantes au sein de l’épithélium intestinal (Sancho et al., 2015).
Pour terminer la différenciation des cellules, un changement d’activité des voies de signalisation est nécessaire. Comme développé précédemment, l’activité des voies Wnt et Notch est restreinte aux cryptes grâce à l’action des cellules de la niche des cellules souches (Stzepourginski et al., 2017), ce qui autorise la différenciation des cellules ayant migré dans les compartiments supérieurs (cf Figure 7). Cependant, l’activation d’autres mécanismes est également requise pour la différenciation terminale des cellules de l’épithélium intestinal. Ainsi, la voie Bmp est essentielle à la réalisation de ce processus : pour cela, les ligands (BMP 2, 4…) se lient aux récepteurs de type II (BMPRII) qui recrutent alors les récepteurs de type I (BMPRI), et ceci amorce la cascade de signalisation qui aboutit à l’activation (par phosphorylation) des facteurs de transcription SMAD (Figure 11). La voie Bmp est fortement active dans les villosités, suggérant un rôle dans la différenciation des cellules. Ce gradient est permis par une légère augmentation de la sécrétion des ligands (BMP 1, 2, 5 et 7) proche des cellules différenciées (Kosinski et al., 2007), mais également par la présence d’inhibiteur de cette voie (NOGGIN, GREMLIN 1 et 2) exclusivement aux abords des ISC et qui sont sécrétés par les cellules mésenchymateuses sous-jacentes aux cryptes (He et al., 2004; Kosinski et al., 2007; Li et al., 2007b). Les KO du récepteur Bmpr1a ou celui du facteur de transcription Smad4 dans l’épithélium intestinal entraînent l’apparition de structures, au sein des villosités, contenant des cellules prolifératives, ce qui confirme son rôle dans l’inhibition de la prolifération dans les villosités ainsi que dans la compartimentalisation de l’épithélium intestinal (Auclair et al., 2007; He et al., 2004; Qi et al., 2017). De plus, l’inhibition de cette voie entraîne l’augmentation du nombre d’ISC, et donc leur localisation plus haute dans la crypte, mais également l’augmentation de l’expression des gènes importants pour l’identité des ISC (Lgr5, Olfm4…), montrant le rôle de cette voie dans l’inhibition du caractère souche (Qi et al., 2017). Enfin, les cellules à mucus sont plus petites, les marqueurs de cellules de Paneth sont moins exprimés, le nombre de cellules entéroendocrines diminue fortement (Auclair et al., 2007) et l’expression des gènes spécifiques aux entérocytes est également compromise (Chen et al., 2019) dans ces souris, montrant le rôle fondamental de la voie Bmp dans la différenciation terminale des cellules intestinales des différents lignages. Ces études suggèrent qu’un simple changement de position des cellules au sein de l’axe crypte-villosité change leur identité cellulaire grâce notamment à ces gradients d’activation des voies de signalisation.
Dans le même ordre d’idée, l’interaction entre les cellules épithéliales et une matrice extracellulaire dont la composition est différente le long de l’axe crypte-villosité joue également un rôle important dans le changement d’identité des cellules au cours de la différenciation, participant là aussi à cet effet de position. Par exemple, la laminine5α, qui est un des constituants de la matrice extracellulaire présents au contact des cellules épithéliales, est impliquée dans l’inhibition de la différenciation et de la polarisation des entérocytes (Lepage et al., 2018). L’étude complexe de la composition en laminine de la matrice extracellulaire le long de l’axe crypte-villosité, et des mécanismes de signalisation intracellulaires mis en jeu dans les interactions cellules/matrice, est donc un autre champ d’investigation essentiel à la compréhension des mécanismes d’homéostasie de l’épithélium intestinal (Beaulieu, 1999).
Transcriptomes des ISC Lgr5+ et des cellules de la villosité mesurés par RNA-seq. En rouge : les 3317 gènes plus exprimés dans les cellules de la villosité, et en bleu : les 2889 gènes plus exprimés dans les ISC (différences > 2 fois et p-value < 0,05). En gris : les 6752 gènes qui ont une expression comparable entre les 2 populations cellulaires. A noter : Cdx2 est exprimé fortement et de manière comparable entre les 2 populations. D’après San Roman et al., 2015.

Les facteurs de transcription

La différenciation peut être définie par le changement de phénotype d’une cellule (i.e. la spécialisation de la cellule) grâce aux changements d’expression de groupes de gènes (Potten et al., 2009). En effet, durant la différenciation intestinale le changement de transcriptome est énorme (entre 4000 et 6000 gènes sont différentiellement exprimés selon plusieurs études (Kazakevych et al., 2017; San Roman et al., 2015a) (Figure 12), ce qui suggère un rôle important des facteurs de transcription dans la mise en place de l’identité cellulaire spécialisée.
Le facteur de transcription de la famille des gènes homéobox CDX2, spécifique de l’épithélium intestinal, a été le sujet de nombreuses études. L’activité de CDX2 est notamment essentielle à la différenciation des cellules de l’épithélium intestinal. Tout d’abord, CDX2 réprime la prolifération des cellules HIEC, modèle des cellules intestinales humaines de la crypte. Au niveau transcriptionnel, cette répression passe notamment par l’inhibition de l’expression du gène Cycline D1, qui est essentiel au bon déroulement du cycle cellulaire (Escaffit et al., 2006). Une autre étude a montré, dans des cellules humaines de cancer colorectal, que CDX2 a un rôle répresseur de la voie WNT en inhibant l’interaction entre la β-CATENINE et TCF4 (Guo et al., 2010). Cependant, in vivo chez la souris, le KO de Cdx2 dans l’épithélium intestinal affecte la prolifération de manière contrastée. En effet, une étude ne montre aucun effet sur la prolifération des cellules progénitrices (San Roman et al., 2015a), alors que Gao et ses collaborateurs ont montré une augmentation du nombre de ces cellules (Gao et al., 2009). Ces résultats contrastés concernant l’effet de CDX2 sur la prolifération, in vivo chez la souris, peuvent être expliqués par les différences de fenêtre d’induction du KO. La première étude a réalisé la délétion de Cdx2 dans l’épithélium adulte (San Roman et al., 2015a) alors que la deuxième l’a induite dans l’endoderme embryonnaire à E8.5 (Gao et al., 2009). Le rôle de CDX2 sur la prolifération in vivo chez la souris pourrait donc dépendre du stade de développement.
Le facteur de transcription CDX2 est également impliqué dans le contrôle de la différenciation des cellules épithéliales intestinales. De nombreuses études ont montré que CDX2 est essentiel à la différenciation de ces cellules, ce qui est plutôt cohérent avec son rôle antiprolifératif. Par exemple, la surexpression de Cdx2 dans l’épithélium gastrique de souris entraîne un grand changement de l’identité de ces cellules. Les cellules pariétales de gastriques exprimant Cdx2. B : Immunohistochimie de SI (sucrase isomaltase) à la surface de l’épithélium gastrique exprimant Cdx2. D’après Mutoh et al., 2005.
l’estomac sont perdues, ce qui entraîne la neutralisation du pH gastrique, et sont remplacées par des cellules à l’identité intestinale qui présentent des microvillosités et une expression de marqueurs fonctionnels comme des enzymes digestives intestinales (Sucrase isomaltase Si, et Lactase phlorizine hydrolase Lph) (Figure 13). Ce changement d’identité entraîne notamment l’augmentation de la capacité de digestion et d’absorption des sucres par l’estomac de ces souris, caractéristique de l’intestin grêle. D’ailleurs, ces souris survivent pendant un mois après l’ablation de l’intestin grêle alors que des souris sauvages meurent en quelques jours. Enfin, les cellules sécrétoires sont aussi fortement modifiées, avec l’expression de la Mucine 2 (plutôt intestinale) à la place des mucines normalement gastriques : Muc5AC et Muc6 (Mutoh et al., 2002, 2005).
A l’inverse, le KO de Cdx2 entraîne l’apparition d’entérocytes immatures au niveau de l’intestin grêle, qui comportent peu de microvillosités ainsi qu’une expression diminuée des marqueurs de différenciation entérocytaire, notamment Lph et Alpi (Alcaline phosphatase intestinale). L’expression des marqueurs de cellules à mucus (Muc2…) est également diminuée, et les cellules entéroendocrines sont perdues. Les cellules de Paneth ne semblent, en revanche, pas affectées, ce qui est cohérent avec la faible expression de Cdx2 dans ces cellules. Par RNAseq et ChIPseq, les auteurs ont montré que le KO de Cdx2 entraîne l’augmentation et la diminution de l’expression de gènes, cependant Cdx2 se fixe principalement aux niveaux des régions régulatrices des gènes qui sont sous-exprimés dans le KO, montrant l’effet activateur direct de CDX2 sur la transcription, l’effet négatif étant probablement indirect. Enfin, ces études ont montré que CDX1 est capable de partiellement sauver le phénotype dû à la perte de CDX2, puisque les effets sont renforcés dans le double KO, et que le simple KO Cdx1 n’a pas d’impact sur l’épithélium intestinal (Verzi et al., 2011). Ces résultats in vivo abondent dans le sens des premiers travaux effectués in cellulo (dans des lignées humaines) et in vitro qui montraient le rôle activateur de CDX2 sur l’expression de SI (Boudreau et al., 2002), LPH (Mitchelmore et al., 2000) ou encore MUC2 (Yamamoto et al., 2003). Tous ces résultats montrent le rôle essentiel de CDX2 dans la mise en place et le maintien de l’identité des cellules épithéliales intestinales différenciées.

Plasticité du tissu

Malgré l’aspect apparemment définitif de l’engagement dans un lignage et de la différenciation qui s’en suit, de nombreuses études ont montré récemment que les cellules de l’épithélium intestinal conservent une grande plasticité. Ce terme de plasticité définit ici les cellules progénitrices ou différenciées qui sont capables de se dédifférencier en cas de perte des CBC Lgr5+ pour donner naissance à de nouvelles cellules souches, qui peuvent alors renouveler l’épithélium en entier. La première description de ce phénomène a été faite en 2012 par le laboratoire de Hans Clevers (van Es et al., 2012b). Les auteurs ont montré Nombre de clones LacZ+ après induction de la CRE dans les cellules Dll1+ et perte des ISC (dû à l’irradiation). Le groupe 1 représente le contrôle négatif car il n’y a pas d’irradiation. L’absence de clones LacZ+ dans le groupe 2 avec l’induction de la CRE 14 jours avant l’irradiation couplée à la présence de clones LacZ+ dans le groupe 3 avec l’induction de la CRE 1 jours avant l’irradiation montre, en plus de la dédifférenciation de ces cellules, que les cellules Dll1+ ne sont pas des cellules souches quiescentes à longue durée de vie. D’après van Es et al., 2012 qu’une population de cellules progénitrices du lignage sécrétoire, localisée au-dessus du compartiment des CBC et exprimant le marqueur moléculaire Dll1, est capable de se dédifférencier. Pour démontrer cela, les auteurs ont utilisé la technique de suivi du lignage (comme décrite en Figure 6) des cellules Dll1+. En conditions d’homéostasie, 4 jours après l’induction de la CRE sous la dépendance du promoteur Dll1 et d’expression de LacZ, quelques cellules sont positives dans les cryptes et les villosités, marquant des cellules de Paneth, des cellules à mucus, entéroendocrines et de « tufts ». Ceci montre le caractère progéniteur du lignage sécrétoire des cellules Dll1+. De plus, 10 jours après l’induction, seules des cellules de Paneth sont encore positives, confirmant une durée de vie courte des autres types de cellules Dll1+. Pour tester la plasticité les souris ont été irradiées à 6G , ce qui cause la perte des CBC Lgr5+. Les auteurs ont montré que, 28 jours après l’irradiation et l’induction de la CRE, des clones de cellules positives font leur apparition tout le long de la crypte et de la villosité (Figure 15, groupe 3). Tous les types cellulaires sont représentés dans ces cellules positives, et le marqueur Lgr5 spécifique des CBC est réexprimé. Ces résultats montrent la dédifférenciation des cellules Dll1+ en cellules souches CBC après perte des cellules Lgr5+ pour permettre le renouvellement normal de l’épithélium. De plus, les auteurs ont également montré que, lorsqu’ils ont induit la CRE 14 jours avant l’irradiation, 28 jours après l’irradiation aucune cellule n’est positive à LacZ (Figure 15, groupe 2). Ceci confirme que les cellules Dll1+ sont des progéniteurs avec une courte durée de vie et pas des cellules souches quiescentes (van Es et al., 2012b). Une autre étude a directement analysé une population de cellules dites quiescentes, grâce à leur capacité à retenir un marquage à long terme (ici H2B-YFP) comme décrit par Potten et ses collaborateurs (Potten et al., 1978). Dans cette étude, ces cellules sont localisées dans la crypte, avec une préférence pour la position 3, et sont nommées LRC (Label-retaining cells) (Buczacki et al., 2013). L’étude transcriptomique de ces cellules montrent qu’elles expriment à la fois des marqueurs de cellules souches, de cellules du lignage sécrétoire ainsi que les marqueurs des cellules « +4 ». En conditions d’homéostasie, les auteurs ont montré que ces cellules donnent naissance principalement aux cellules de Paneth et aussi aux cellules entéroendocrines. Enfin, par suivi du lignage ils ont montré que ces cellules sont capables de renouveler l’épithélium en entier, mais seulement en réponse aux dommages causant la perte des CBC Lgr5+. Les auteurs ont donc fait l’hypothèse que ces cellules décrites comme des cellules souches quiescentes par Potten et ses collaborateurs (Potten et al., 1978) pourraient être en fait des précurseurs du lignage sécrétoire avec une durée de vie assez longue, et capables de se dédifférencier en cas de perte des CBC Lgr5+ (Buczacki et al., 2013). Cette hypothèse est en accord avec Bjerknes et ses collaborateurs qui avaient montré l’existence de cellules progénitrices du lignage sécrétoire à longue durée de vie (Bjerknes and Cheng, 1999). Cette étude a l’avantage de n’être pas basée sur des marqueurs moléculaires, qui ne sont pas toujours spécifiques, mais sur la capacité de la cellule à retenir un marquage, ce qui caractérise les cellules souches quiescentes selon Potten. Une autre étude a montré que les cellules Bmi1+, qui ont été caractérisé comme des cellules souches quiescentes en position +4 (Sangiorgi and Capecchi, 2008), seraient en fait une population de cellules entéroendocrines différenciées (Yan et al., 2017). Cette population contient plusieurs sous-populations, en accord avec l’hétérogénéité des cellules entéroendocrines, et est capable de renouveler l’épithélium après irradiation et perte des CBC Lgr5+ (Yan et al., 2017). Enfin, il a également été montré que les cellules progénitrices du lignage entérocytaire, Alpi+, sont capables de régénérer l’ensemble des cellules épithéliales intestinales à long terme après perte des cellules Lgr5+ alors qu’elles ont une courte durée de vie et une descendance exclusivement entérocytaire dans l’homéostasie normale (Tetteh et al., 2016) (Figure 16).
Toutes ces études suggèrent que les cellules +4, qui permettent, comme d’autres cellules progénitrices, le maintien de l’épithélium suite à la perte des CBC Lgr5+, seraient en fait des cellules différenciées ou en cours de différenciation, qui sont capables de se dédifférencier en cas de problème. Cette hypothèse est cohérente avec la grande hétérogénéité des cellules présentes au niveau de cette position en terme moléculaire (Bmi1+, Hopx+, Prox1+…) ou en termes de sensibilité à l’irradiation. Cette hypothèse suggère que les cellules présentes au-dessus de la zone des CBC se retrouvent en positions inférieures lors de la perte des CBC et donc au contact de la niche des cellules souches qui leur impose alors une identité souche. Ce mécanisme mis en place par l’organisme pour maintenir l’intégrité du tissu quoi qu’il arrive, assure la robustesse fonctionnelle du tissu. Toutefois, il a pour inconvénient de permettre à n’importe quelle cellule de l’épithélium de se dédifférencier, de proliférer et, donc potentiellement, d’entrainer l’initiation de la tumorigénèse en réponse à des signaux environnementaux. Par exemple, une étude a montré que la surexpression de la β-Caténine stabilisée, en association avec l’activation des oncogènes NF-κB ou KRAS, dans les cellules Lgr5- (grâce à l’expression de la CRE sous la dépendance du promoteur Xbp1) de l’épithélium intestinal entraîne la tumorigénèse intestinale. Les polypes formés sont très prolifératifs mais surtout ils expriment un grand nombre de gènes marqueurs des ISC (Lgr5, Ascl2…), ce qui montre que la surexpression de ces oncogènes dans les cellules différenciées de l’épithélium intestinal a engendré la dédifférenciation de ces cellules et donc la tumorigénèse (Schwitalla et al., 2013). De plus, dans un modèle permettant l’ablation des cellules Lgr5+ par ajout de toxine diphtérique, après la formation des tumeurs, la déplétion de ces cellules entraîne l’arrêt de la croissance des tumeurs jusqu’à l’arrêt du traitement qui engendre alors la reprise de la croissance (de Sousa e Melo et al., 2017). Ceci suggère que des cellules de la tumeur, après la fin du traitement, se sont dédifférenciées pour relancer la prolifération et donc la croissance tumorale. Ceci pourrait expliquer la résistance de certaines tumeurs vis-à-vis des traitements ciblant les cellules souches cancéreuses.
Là aussi, la plasticité de l’épithélium intestinal étant fortement liée aux mécanismes de mise en place de l’identité cellulaire, la chromatine pourrait avoir un rôle majeur dans ce processus et donc dans le maintien à long terme de l’homéostasie de l’épithélium intestinal.

Modèle d’homéostasie : les organoïdes

Le manque de modèle ex vivo de cellules épithéliales recréant la complexité de l’axe crypte-villosité a pendant longtemps compliqué les investigations sur l’homéostasie de l’épithélium intestinal. Le laboratoire de Hans Clevers a décrit un modèle, nommé « organoïde », pour la première fois en 2009 (Sato et al., 2009). Pour cela, les auteurs ont isolé des cryptes intestinales, dissocié les cellules puis mis celles-ci en culture dans du Matrigel pour fournir un support extracellulaire proche de celui existant in vivo avec des laminines et du collagène. Lors de la mise en culture, les cryptes se referment sur elles-mêmes et forment une sphère avec une lumière au centre (Figure 17A). La croissance de ces organoïdes nécessite des facteurs permettant de stimuler la voie Wnt (WNT3a et R-SPONDIN pour amplifier la signalisation Wnt), de l’EGF important pour la prolifération et de la NOGGIN pour inhiber la signalisation Bmp. Grâce à ces facteurs, les organoïdes croissent et forment au bout de quelques jours des bourgeonnements contenant des cellules souches ainsi que des cellules de Paneth, donc similaires à des cryptes. Les cellules différenciées se trouvent hors des cryptes dans des domaines récapitulant l’organisation des villosités (Figure 17A, B et C). Ces organoïdes peuvent être dissociés et les cryptes réensemencées pour donner naissance à de nouveaux organoïdes, qui peuvent être ainsi cultivés pendant une durée supérieure à 8 mois (Sato et al., 2009). Ce système est donc le premier à permettre la culture à long terme de cellules épithéliales intestinales qui s’auto-organisent pour recréer les équilibres de l’homéostasie intestinale et en mimer la physiologie de l’axe crypte-villosité. Cette technique montre que les cellules de l’organoïde sont capables de recréer l’asymétrie entre la crypte et la villosité sans l’aide des cellules mésenchymateuses. Par exemple, l’agoniste de WNT (R-Spondin) est présent dans tout le milieu de culture, mais pourtant seules les cellules de la crypte des organoïdes ont une signalisation Wnt active (Sato et al., 2009). Enfin, les auteurs ont également montré la possibilité de créer des organoïdes à partir de cellules souches Lgr5+ isolées. Cependant cette culture nécessite l’ajout supplémentaire, par rapport à la culture à partir de cryptes entières, d’agoniste de la voie Notch pour pouvoir former des organoïdes (Sato et al., 2009). Ceci semble confirmer le caractère indispensable des cellules de Paneth pour activer la voie Notch dans les ISC et permettre le maintien de ces dernières.
Ce modèle facilite donc l’analyse de l’homéostasie de l’épithélium intestinal par une approche ex vivo. Il permet notamment d’aborder le rôle de différents facteurs dans le maintien du caractère souche ou l’induction des lignages, par exemple par des approches de pertes de fonctions (siRNA, CRISPR-Cas9, …) ou en comparant différents génotypes. Par exemple, la mise en culture des villosités de souris sauvages n’entraîne pas la formation d’organoïdes, prouvant le caractère différencié et non prolifératif des cellules des villosités. Cependant, la mise en culture des villosités provenant des souris ayant la voie Wnt et l’oncogène KRAS activés dans tout l’épithélium entraîne la formation et la croissance d’organoïdes, prouvant ainsi que, dans ces souris, certaines cellules des villosités ont des caractéristiques souches (Schwitalla et al., 2013). Aussi, l’ajout d’un agoniste de la voie Bmp (BMP4) dans le milieu de culture des organoïdes entraine la perte de la formation de ces structures (Qi et al., 2017). Ce modèle est donc puissant pour analyser le caractère souche des cellules.
Ce modèle permet également l’analyse de la perméabilité de l’épithélium par injection de molécules fluorescentes à l’intérieur des organoïdes, puis analyse du maintien de la fluorescence à l’intérieur de l’organoïde au cours du temps. Par exemple, dans une étude, il a été montré que l’ajout de la toxine de Clostridium, dans le milieu de culture, entraîne la perte de la fluorescence en 20h, contrairement aux organoïdes contrôles non traités dans lesquels cette fluorescence est encore présente (Hill et al., 2017). Cette technique permet donc d’analyser la perméabilité de l’épithélium intestinal en réponse à des molécules en temps réel. La micro-injection permet également d’analyser la relation hôte-pathogène. Par exemple, la micro-injection de Salmonella enterica dans la lumière d’organoïdes a permis de montrer le rôle protecteur de l’Interleukine-22 contre l’invasion intracellulaire de cette bactérie (Forbester et al., 2018). Tous ces exemples montrent la multitude de possibilités d’utilisation des organoïdes comme modèle d’étude des caractères physiologiques du tissu.
L’un des atouts de ces organoïdes est également l’une de leurs principales limitations : ils sont uniquement constitués de cellules épithéliales, ce qui permet de découpler leurs propriétés et physiologie de celles du mésenchyme (Sato et al., 2009). Or les cellules entourant l’épithélium intestinal in vivo ont également un rôle prépondérant dans le contrôle de sa physiologie et son homéostasie. Pour remédier à ceci de plus en plus d’études utilisent les organoïdes en coculture avec un autre type cellulaire (revue Holloway et al., 2019). Par exemple, une étude a montré la possibilité de cultiver les organoïdes intestinaux avec des lymphocytes intraépithéliaux (IEL). La coculture de ces IEL avec les cellules épithéliales donne naissance à des organoïdes qui présentent ces lymphocytes au sein de l’épithélium (Nozaki et al., 2016). Cette co-culture pourrait, notamment, permettre l’analyse plus complète de la réponse immunitaire intestinale ex vivo. La coculture de cryptes provenant du colon sur un tapis cellulaire de myofibroblastes sous-épithéliaux a montré une plus forte capacité à former des colonoïdes que la culture sans ces cellules (Hirokawa et al., 2014). L’étude de la coculture de différents types cellulaires avec les cellules épithéliales n’est qu’au début de son investigation mais semble très prometteuse dans la meilleure compréhension de la physiologie de l’épithélium intestinal.

Table des matières

I- L’épithélium intestinal et le contrôle de son homéostasie
1) Ontogénèse de l’intestin grêle
2) Structure de l’intestin grêle adulte
3) Les cellules souches intestinales
4) Dynamique des cellules souches intestinales et voies de signalisation
5) Choix, engagement dans un lignage et différenciation en cellules spécialisées
a) Rôle des voies de signalisation
b) Les facteurs de transcription
6) Plasticité du tissu
7) Modèle d’homéostasie : les organoïdes
II- La Chromatine
1) Une structure dynamique et collaborative
a) Remodelages ATP-dépendants de la chromatine et modifications posttraductionnelles des histones
b) Interdépendance des modificateurs et/ou modifications de la chromatine
c) Rôle de la dynamique chromatinienne dans la transcription
d) Rôle de la dynamique chromatinienne dans le devenir cellulaire
2) Dynamique des marques chromatiniennes dans l’épithélium intestinal : destin cellulaire vs plasticité cellulaire
a) La dynamique chromatinienne au sein de l’épithélium intestinal normal
b) Rôle de la dynamique de la chromatine dans le choix et la mise en place d’un destin cellulaire
– H3K27me3 et le complexe PRC2
– Les HDAC et l’acétylation des histones
– La méthylation de l’ADN
– Les complexes de remodelage de la chromatine
c) Rôle de la dynamique de la chromatine dans la conservation de la plasticité cellulaire
3) Le variant d’histone H2A.Z
a) Rôle de H2A.Z et de ses modifications post-traductionnelles dans la transcription
b) Dynamique d’enrichissement en H2A.Z et devenir cellulaire
c) Dynamique d’incorporation de H2A.Z
d) Différences ou redondances fonctionnelles entre les isoformes de H2A.Z
RESULTATS
I- H2A.Z1 contrôle l’homéostasie de l’épithélium intestinal
1) Contexte
2) Résultats
3) Conclusion
II- H2A.Z1 et H2A.Z2 ont des rôles redondants et spécifiques dans le contrôle de l’identité des cellules intestinales
1) Contexte
2) Résultats
3) Conclusion
DISCUSSION
I- La dynamique du variant d’histone H2A.Z1 contrôle l’identité des cellules intestinales
a) H2A.Z1 contrôle la dynamique du facteur de transcription CDX2
b) H2A.Z1 et paysage chromatinien dans le contrôle de l’homéostasie
II- Rôles redondants ou spécifiques des 2 isoformes de H2A.Z
1) Rôles redondants
a) Les isoformes de H2A.Z assurent la robustesse du renouvellement de l’épithélium intestinal
b) Lien étroit entre H2A.Z et MATH1 dans le contrôle de l’identité des cellules progénitrices
2) Rôles spécifiques
a) Rôle spécifique dû aux modifications post-traductionnelles ?
b) Rôle spécifique dû à la dynamique du nucléosome ?
c) Rôle spécifique dû à l’interactome ?
III- Régulation de la dynamique de H2A.Z et de ses isoformes au sein de l’épithélium intestinal
1) Dynamique de H2A.Z total
a) Rôle des voies de signalisation
b) Rôle des complexes responsables de son incorporation et/ou éviction
c) Rôle des modifications post-traductionnelles
2) Dynamique spécifique de H2A.Z1 et H2A.Z2
IV- H2A.Z contrôle l’identité intestinale au cours du développement ?
V- H2A.Z et pathologies intestinales
1) H2A.Z et cancers
2) H2A.Z et maladies inflammatoires de l’intestin
VI- H2A.Z dans la réponse à l’environnement extérieur
ANNEXE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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