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Les phages qui ont deux modes de réplication séquentiels
Dans la majorité des cas, les bactériophages synthétisent leur ADN par deux modes séquentiels de réplication. Après l’éjection du génome dans la cellule (infection) ou leur excision du chromosome bactérien (induction de phages tempérés, voir section I.3.3), l’ADN viral linéaire se recircularise soit par recombinaison homologue au niveau de ses extrémités redondantes soit par hybridation d’extrémités cohésives (séquences cos). Un premier mode de réplication (theta) de la molécule d’ADN circulaire conduit à l’accumulation de copies du génome sous forme de cercles. Puis, un switch de réplication vers le mode sigma conduit à la réplication par cercle roulant. Elle mène à la synthèse de concatémères du génome qui sont le substrat pour l’encapsidation dans les particules virales. Des concatémères peuvent être aussi générés par réplication couplée à la recombinaison comme dans le cas du bactériophage T4 (Kreuzer, 2000). Les mécanismes de réplication theta et sigma sont détaillés dans la section I.4.3 pour le bactériophage SPP1.
La première usine virale caractérisée avec une telle stratégie de réplication de son génome viral est celle du phage tempéré λ qui infecte la bactérie Gram-négative E. coli. Juste après l’infection, le génome du phage va préférentiellement se localiser proche des pôles de la cellule et y rester pendant sa réplication. Ceci corrèle avec la position de fixation du virus à l’extérieur de la bactérie suggérant que le point d’éjection de l’ADN du phage va déterminer sa localisation dans la cellule (Figure 6) (Edgar et al, 2008). La taille du foyer augmente au fur et à mesure du temps. Par contre, dans le cas où le génome du phage est intégré dans le génome de la bactérie au locus attλ, deux petits foyers apparaissent au milieu de la cellule correspondant à la localisation du nucléoïde bactérien (Edgar et al, 2008).
Figure 6 : Localisation de l’ADN du phage λ pendant le cycle lytique (Edgar et al, 2008). Pour suivre l’ADN du phage λ dans la cellule, il a été utilisé un système rapporteur LacI/lacO dans lequel 64 répétitions de la séquence lacO ont été insérées dans le génome du phage et la fusion lacI-gfp a été insérée dans le chromosome de la bactérie. (A) Galerie de cellules infectées par le phage λ. (B) Images (time-lapse) prises à 5, 10, 15, 27 et 57 minutes post-infection. Localisation de la fluorescence de LacI-GFP après l’éjection de l’ADN du phage λ aux pôles (gauche) ou au centre (droite) de la cellule.
Une localisation de l’ADN phagique rappelant celle du phage λ a été retrouvée pour le phage lytique SPP1 (Jakutyte et al, 2011). La particule virale de SPP1 se fixe préférentiellement proche des pôles de la cellule lors de son interaction avec l’enveloppe de B. subtilis. Ceci est attribué à l’enrichissement du récepteur membranaire YueB aux pôles de la bactérie. Après éjection de l’ADN du phage dans le cytoplasme, un foyer d’ADN phagique apparait dans la cellule et il augmente en taille au cours de l’infection (Figures 7A et 7B) (Jakutyte et al, 2011). A des temps tardifs, ce foyer va se localiser le plus fréquemment au 2/3 de la cellule (Figures 7C et 7D) (Jakutyte et al, 2011).
Le phage 201Φ2-1
Le jumbo myophage lytique 201Φ2-1, qui infecte la bactérie Gram-négative Pseudomonas chlororaphis, a un des plus grands génomes phagiques connus (316 kpb) (Yuan & Gao, 2017, Thomas et al, 2009). Il code pour la protéine tubuline-like (PhuZ : Phage Tubulin /FtsZ). PhuZ s’assemble pour former des filaments dynamiques pendant l’infection qui vont centrer l’ADN du phage dans la cellule (Figures 8A et 8B) (Kraemer et al, 2012). En revanche, dans un mutant GFP-FhuZD190A dont la mutation dominante négative rend statique les filaments PhuZ, l’ADN de 201Φ2-1 se localise préférentiellement au quart de la cellule (Figures 8C et 8D). La partie C-terminale de la protéine PhuZ est conservée parmi un certain nombre de tubulines de phages y compris celles de Clostridium suggérant que ce mécanisme n’est pas uniquement restreint au phage de Pseudomonas (Kraemer et al, 2012).
Figure 8 : PhuZ positionne l’ADN viral au centre de la cellule hôte infectée par le phage 201Φ2-1 (Kraemer et al, 2012). (A) Cellule infectée marquée avec le marqueur membranaire FM4-64 (rouge) et du DAPI (bleu) à 90 minutes post-infection montrant une grande quantité d’ADN dans le centre de la cellule. (B) Cellule infectée montrant des filaments GFP-FhuZ de part et d’autre de l’ADN viral marqué au DAPI. (C) Cellule infectée produisant la protéine mutante GFP-PhuZD190A à 90 minutes post-infection. Dans ce cas, le nucléoïde du phage se localise dans le pôle de la cellule. (D) Histogramme montrant le pourcentage de cellules en fonction de la distance au pôle du nucléoïde viral dans la souche produisant GFP-FhuZ (rouge) ou produisant GFP-FhuZD190A (bleu).
Des études de protéomique de cellules infectées par le phage 201Φ2-1 ont mis en évidence qu’une protéine phagique, gp105, était très fortement produite dès le début de l’infection. Elle se localise dans les cellules infectées autour du nucléoïde viral en l’emprisonnant dans une cage. Les protéines virales et cellulaires nécessaires à la synthèse de nouvelles molécules d’ADN sont retrouvées dans cette structure apparentée à un noyau, délimitée par une coque protéique. Les partenaires cellulaires impliqués dans la voie d’assemblage du virion sont quant à eux exclus de cette cage, se localisant à l’extérieur (Figure 9) (Chaikeeratisak et al, 2017). La cryotomographie électronique permet de révéler le compartiment de réplication du génome. Des particules virales pour certaines vides (probablement des procapsides en attente d’encapsidation du génome) et pour d’autres pleines (ayant encapsidé de l’ADN) sont retrouvées au contact de sa coque protéique. Des virions matures prêts à infecter de nouvelles cellules sont aussi visibles dans le cytoplasme bactérien (Figure 9B). C’est le premier modèle bactérien dans lequel les étapes de réplication de l’ADN du phage et d’assemblage de la particule virale sont complètement séparées faisant intervenir une structure protéique qui délimite spatialement ces deux étapes. Le compartiment de réplication peut ici être comparé au noyau d’une cellule eucaryote.
Ces études pionnières sur la restructuration de l’espace cytoplasmique lors de l’infection des bactéries mettent en avant le potentiel des bactériophages pour étudier la biologie cellulaire bactérienne et comment la manipuler.
Les virus de bactéries : les bactériophages
Mis en évidence à partir d’un filtrat d’eau du Gange ayant une activité bactéricide contre la bactérie Vibrio cholerae en 1896 par Ernest Hanbury Hankin (Hankin 1896) puis décrits comme « virus ultra-microscopiques » en 1915 par Frederick Twort (Twort, 1914), l’existence des virus bactériens a clairement été démontrée en 1917 par Félix d’Hérelle (d’Hérelle 1917). Il les nomma « bactériophages » (mangeurs de bactéries) en établissant leur potentiel en tant qu’agents antibactériens et fit ainsi émerger le concept de virus bactériens. Les bactériophages (ou phages) constituent l’entité biologique la plus répandue et la plus diversifiée génétiquement sur Terre. Présents dans l’ensemble de la biosphère, leur nombre est estimé à 1031 sur la planète ce qui correspond à un nombre 2 fois plus élevé que celui des bactéries estimées à 4-6.1030 (Whitman, Coleman et Wiebe 1998). Ils jouent un rôle environnemental essentiel, notamment en régulant la prolifération des populations bactériennes mais également en contribuant à l’évolution génétique de nombreux micro-organismes comme vecteurs du transfert horizontal de gènes. Leur étude a contribué à la compréhension de la biologie moléculaire et à son essor. Aujourd’hui encore, ils sont utilisés comme outils en tant que vecteurs de transfert de gènes horizontaux, de sources de diagnostic ou de nouveaux agents thérapeutiques (phagothérapie).
La classification des bactériophages
Constituant le plus grand groupe viral existant dans la nature, les bactériophages présentent des morphologies diverses. Ils peuvent être caudés, cubiques (ou polyhédraux), pléomorphiques ou filamenteux (Ackermann, 2003). La classification des phages a débuté en 1967 (Bradley, 1967). Elle définissait au départ seulement 6 morphotypes (de A à F) basés sur la nature de l’acide nucléique et sur la morphologie du virion (étoiles noires dans la Figure 10). Aujourd’hui, la classification des bactériophages selon l’ICTV (« International Committee on Taxonomy of Viruses ») inclue un ordre, les Caudovirales (phages caudés), et 7 autres familles (Tectiviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Microviridae, Leviviridae, Plasmaviridae et Inoviridae) qui sont toutes de petites tailles et pour l’une d’entre elles, n’a qu’un seul membre (Plasmaviridae) (Figure 10) (Pietila et al, 2014). Ils infectent les membres de 179 genres bactériens, principalement les membres des Firmicutes et des protéobactéries.
Les bactériophages sont majoritairement des virus non-enveloppés. Plus de 95 % ont un génome composé d’ADN (11 % sont ADN simple-brin et 89 % sont ADN double-brin) et ils sont regroupés dans 8 familles différentes. Les bactériophages à ARN ne représentent que 4 % des phages décrits et ne sont retrouvés que dans 3 familles (61 % sont ARN simple-brin et 39 % sont ARN double-brin) (Krishnamurthy et al, 2016). Ces chiffres tendent à augmenter avec la disponibilité croissante de données métagénomiques. Cependant, ces analyses excluent les bactériophages à ARN car la technique est basée sur du séquençage direct de l’ADN de plusieurs génomes contenus dans un milieu. Enfin, la composition en bases G-C de ces bactériophages reflète généralement celle de la bactérie hôte avec cependant un contenu en bases A-T 4 à 10 % supérieur (Rocha & Danchin, 2002 ; Almpanis et al, 2018).
Les phages caudés
Les quelques 6 300 virus de procaryotes décrits depuis 1959 (Figure 11) comprennent ≈ 6 200 virus de bactéries et ≈ 100 virus d’archées. La catégorie la plus représentée est l’ordre des Caudovirales (cauda : queue en latin) avec environ 6 050 membres dénombrés à ce jour (équivalent à 96,3 % des virus bactériens décrits) (Figure 11).
Figure 11 : Nombre cumulatif de virus de procaryotes décrits de 1967 à 2011 (Ackermann & Prangishvili, 2012). La lettre T (Tailed) correspond aux virus caudés et les lettres PFP (Polyhedral, Filamentous, Pleomorphic) correspondent aux virus cubiques, filamenteux et pléomorphiques. L’ordre des Caudovirales est subdivisé en 3 familles (Figures 10 et 12) classées en fonction de la morphologie de leur queue:
– les Podoviridae (pous, podo : pied en grec, se réfère à la queue courte) (14 % des phages décrits) : queue courte, ADNdb (exemples : T7, Φ29, P22, LUZ24).
– les Siphoviridae (sipho : tube en grec, se réfère à la longue queue) (62 %) : longue queue non contractile, ADNdb (exemples : λ, T1, T5, SPP1, HK97).
– les Myoviridae (myo : muscle en grec, se réfère à la queue contractile) (24 %) : longue queue contractile, ADNdb (exemples : T4, P1, Mu, SPO1).
Figure 12 : Ordre des Caudovirales (schémas et clichés reproduits de Richter et al, 2018 ; Krupovic et al, 2011 ; Lawrence et al, 2002 ; Alonso et al, 2006). Les phages P22, SPP1 et T4 ont été visualisés par microscopie électronique après coloration négative à l’acétate d’uranyl. L’échelle représente 50 nm
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Table des matières
I. Introduction
I.1. Les virus dans la biosphère
I.2. Les usines virales
I.2.1. Les usines virales chez les eucaryotes
I.2.2. Les usines virales de réplication du génome chez les bactéries
I.2.2.1. Les phages dont le génome est linéaire
I.2.2.2. Les phages qui ont deux modes de réplication séquentiels
I.2.2.3. Le phage 201Φ2-1
I.3. Les virus de bactéries : les bactériophages
I.3.1. La classification des bactériophages
I.3.2. Les phages caudés
I.3.3. Le cycle de multiplication des bactériophages caudés
I.3.4. Les bactéries et les prophages
I.4. Le bactériophage SPP1, un modèle pour les phages caudés
I.4.1. Caractéristiques du bactériophage SPP1
I.4.2. Les étapes du cycle viral de SPP1 dans la bactérie B. subtilis
I.4.3. La réplication du génome viral de SPP1
I.4.3.1. La réplication précoce en mode theta ()
I.4.3.2. La réplication tardive générant des concatémères
I.4.4. L’assemblage de la particule virale de SPP1
I.5. La réplication du chromosome bactérien et sa structuration
I.5.1. La réplication du chromosome bactérien
I.5.2. Les différentes étapes de la réplication de l’ADN de la bactérie B. subtilis
I.5.2.1. Initiation
I.5.2.2. Elongation
I.5.2.3. Terminaison
I.5.3. Condensation et structuration de l’ADN répliqué
I.6. Les objectifs de la thèse
II. Matériel et Méthodes
II.1. Le matériel
II.1.1. Les milieux
II.1.2. Les souches bactériennes
II.1.3. Les bactériophages
II.1.4. Les plasmides
II.1.5. Les amorces
II.1.5.1. Amorces utilisées pour le clonage
II.1.5.2. Amorces utilisées pour la PCR quantitative
II.2. Les méthodes
II.2.1. Biologie moléculaire
II.2.1.1. Stratégie de clonage
II.2.1.1.1. Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
II.2.1.1.2. Purification des produits de PCR
II.2.1.1.3. Clonage
II.2.1.1.4. Transformation d’E. coli et criblage des transformants
II.2.1.2. Constructions des souches
II.2.1.2.1. Fusion lacI-mcherry, rapportrice de l’ADN viral, insérée dans le locus thrC
II.2.1.2.2. Fusions de gènes de SPP1 au gène mcitrine et insertion dans le locus sacA
II.2.1.2.3. Fusions de gènes de l’hôte au gène mcfp et insertion dans le locus amyE
II.2.1.2.4. Fusion du gène 12 de SPP1 au gène mcfp et insertion dans le locus amyE
II.2.1.2.5. Fusions de gènes de l’hôte au gène gfp et insertion dans le locus amyE
II.2.1.2.6. Système minimal de réplication in vivo
II.2.2. Microbiologie et génétique
II.2.2.1. Préparation des bactéries (pré-)compétentes
II.2.2.1.1. E. coli
II.2.2.1.2. B. subtilis
II.2.2.2. Transformations bactériennes
II.2.2.2.1. E. coli
II.2.2.2.2. B. subtilis
II.2.2.3. Transduction dans B. subtilis
II.2.2.4. Titration des phages
II.2.3. Biochimie
II.2.3.1. Purification de l’ADN chromosomique de B. subtilis
II.2.3.2. Préparation d’extraits de B. subtilis infectée par SPP1
II.2.3.3. Production et purification des intermédiaires d’assemblage de SPP1
II.2.3.4. Production et purification de particules virales de SPP1
II.2.3.5. Western blot
II.2.4. Analyses quantitatives de l’ADN
II.2.4.1. Préparation d’extraits d’ADN total et d’ADN protégé de l’action de la DNAse de B. subtilis infectée par SPP1
II.2.4.2. Purification des extraits d’ADN et quantification par PCR quantitative (qPCR)
II.2.4.3. Quantification par Qubit
II.2.5. Microscopie de fluorescence
II.2.5.1. Observation sur pad d’agarose
II.2.5.2. Observation en système microfluidique
II.2.5.3. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) des usines de réplication
II.2.5.4. Observation de l’infection de bactéries filamentées
II.2.6. Analyse quantitative des images de microscopie de fluorescence
II.2.6.1. Détection et identification des cellules
II.2.6.2. Localisation et morphologie des usines de réplication de l’ADN du phage
II.2.6.3. Localisation et morphologie des zones d’accumulation de procapsides et de capsides
II.2.7. Microscopie électronique
II.2.7.1. Préparation des cellules infectées
II.2.7.2. Coupe et marquages des cellules infectées
II.2.7.3. Conditions d’observation des grilles de cellules immuno-marquées
II.2.8. Calcul du coût énergétique de l’infection virale pour la cellule
III. Résultats
III.1. Réplication de l’ADN viral dans la bactérie infectée par SPP1
III.1.1. Quantification de la réplication et de l’encapsidation du génome viral pendant l’infection
III.1.2. Coût de l’infection de SPP1delX110lacO64 pour la cellule
III.1.3. Localisation de l’ADN viral libre dans la cellule infectée
III.1.4. Protéines cellulaires impliquées dans la réplication virale
III.1.5. Protéines virales impliquées dans la réplication de l’ADN du phage
III.1.5.1. Initiation de la réplication
III.1.5.2. Switch du mode de réplication theta au mode sigma
III.1.6. Dynamique de l’ADN viral dans la cellule infectée
III.2. Assemblage de la particule virale dans la cellule infectée
III.2.1. Etude de l’état nucléocapside de la particule virale
III.2.2. Etude de l’état procapside pendant l’assemblage viral
III.2.3. Organisation ultra-structurale de la bactérie infectée
III.3. La déstructuration du chromosome bactérien pendant l’infection virale
IV. Discussion
IV.1. Facture énergétique de l’infection phagique
IV.2. Les usines de réplication du génome de SPP1
IV.3. Structuration du nucléoïde bactérien
IV.4. Programme spatial d’assemblage de la particule virale de SPP1
IV.5. Comparaison de l’architecture des usines virales
IV.5.1. Les virus qui utilisent les membranes présentes chez leur hôte
IV.5.2. Les virus qui isolent physiquement la réplication de l’assemblage de la particule virale
IV.5.3. Les virus dont le génome est linéaire et qui dépendent des protéines du cytosquelette de l’hôte
IV.5.4. Les virus qui forment des structures aux propriétés d’organelles liquides
IV.6. Impact de la quantité d’ADN viral sur la lyse cellulaire
V. Conclusions et perspectives
V.1. La transition de réplication theta-sigma
V.2. La structure du chromosome bactérien lors de l’infection virale
Bibliographie
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