DOSAGES DES PROTEINES TOTALES DE Chlorella vulgaris DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PAR LA METHODE DE KJELDAHL

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Chlorella vulgaris

Répartition géographique

Chlorella se trouve un peu partout sur la terre : dans les ruisseaux, les lacs ou les forêts humides.

Une plante supérieure

La feuille de Manihot esculenta a été utilisée pour être comparé avec Chlorella vulgaris. Le choix de Manihot esculenta est basé sur sa capacité à produire beaucoup de tonnes de denrées alimentaires par hectare par an par rapport au riz et aux autres plantes et aussi parce que cette plante est cultivée un peu partout à Madagascar.

METHODES

METHODES D’ETUDE QUANTITATIVE DES CHLOROPHYLLES

Principe

Le principe est basé sur l’absorption de la lumière par les extraits des pigments chlorophylliens dans l’acétone 80%. Les coefficients d’absorption spécifique dans l’acétone 80% de la chlorophylle a à 663 nm est 0,0127 et à 645 nm de 0,00269 ; pour la chlorophylle b à 663nm de 0,00468 et à 645nm de 0,0229 ont été déterminés par Mac Kinney [70]. Le dosage repose sur la loi de Beer-Lambert :
D.O = k .C .d
D.O = densité optique
K = coefficient d’absorption spécifique
d = épaisseur de la cuve du spectrophotomètre
C = concentration de l’échantillon

Méthodes

Extraction des pigments chlorophylliens

Les manipulations sont effectuées dans un lieu sombre et à basse température. La réfrigération des matériels végétaux, des verreries, du pilon en porcelaine doit être effectué 2 heures avant utilisation et toute manipulation est réalisée dans un bac à glace.
Après agitation, chaque échantillon, c’est-à-dire 0,2 ml de suspension, est prélevé dans les deux tubes de centrifugation, additionné chacun de 1,8 ml d’eau distillée puis de 8ml d’acétone pure. Les tubes sont bouchés et agités énergiquement avant une centrifugation de 5min à 3000g. Cette fois, ce sont les surnageants qui sont récupérés dans trois tubes à essai pour les mesures des D.O.

Mesure des D.O.

Les D.O de chaque surnageant sont mesurées à 645 nm, 652nm, et à 663nm à l’aide d’un spectrophotomètre en utilisant comme témoin l’acétone 80% (acétone 8ml+eau distillé 2ml).

Détermination de la masse de matière sèche

En connaissant la correspondance entre D.O. et le nombre de cellules de Chlorella vulgaris dans un millilitre de milieu de culture, et en séchant dans une étuve à 120 °C quelques millilitres de culture avec une D.O connue. A la fin du séchage, c’est-à-dire à l’obtention d’un poids constant, confirmé par pesage répétitif et périodique, le poids de la matière sèche devrait être obtenu.

Calculs

Ca = concentration en chlorophylle « a » Cb = concentration en chlorophylle « b » Ca = 0,0127 x D.O 663 – 0,00269 x D.O 645 Cb = 0,0229 x D.O 645 – 0,00468 x D.O 663
Ca+b = 0,0202 x D.O 645 + 0,00468 x D.O 663 ou (D.O 652) / 36
Les chiffres : 0,0127, 0,00269, 0,0202, 0,00468 sont les cœfficients
d’absorptions des chlorophylles à chaque longueur d’onde appliquées.
Pour obtenir les concentrations en chlorophylle de chaque suspension, les résultats des mesures des D.O sont portés dans ces formules. La matière sèche (MS%) est obtenue par la formule :
M1 = masse du récipient vide
M2 = masse du récipient + masse de l’échantillon avant étuvage
M3 = masse du récipient + masse de l’échantillon après étuvage H% = humidité

METHODES D’ETUDE QUALITATIVE DES CHLOROPHYLLES

Principe

Le principe est basé sur la capacité des pigments à absorber une lumière de longueur d’onde spécifique. Ceci aboutit à l’obtention d’un spectre d’absorption qui permet de déterminer par la suite les différents pigments présents et leurs quantités relatives, et aussi de déterminer la zone d’absorption minimale.

Méthodes

Extraction des pigments

Une suspension de volume 0,6 ml déjà utilisés précédemment est mélangés avec de l’eau distillée de 5,4ml et de l’acétone pure de 24 ml. Le tout est agité puis centrifugé à 3000g pendant 15min. Le surnageant correspondant à la suspension pigmentaire, les mesures des D.O de la suspension sont effectuées. La coloration grise du culot de centrifugation indique l’extraction totale.

Mesure des D.O

Le témoin au spectrophotomètre est l’acétone 80%. Avant les prélèvements, la suspension pigmentaire est agitée. Elle est soumise ensuite à un balayage en commençant par la longueur d’onde 400nm jusqu’à 700nm, à raison de 10nm par mesure .Pour effectuer la mesure de D.O ,1ml de la suspension pigmentaire est prise avec une pipette de 1ml puis versée dans la cuve du spectrophotomètre. Trente mesures sont nécessaires pour passer de 400nm à 700nm.

Détermination des pigments

Une bande d’absorption spécifique correspond à chaque type de pigment. La présence d’un pigment dans une suspension est vérifiée par la présence de sa bande d’absorption spécifique (autour d’un pic) dans le spectre d’absorption de la plante. La hauteur du pic indique le taux correspondant de la chlorophylle dans la suspension.

RESULTATS ET INTERPRETATIONS

METHODES D’ETUDE QUANTITATIVE DES CHLOROPHYLLES

Les formules suivantes donnent les pourcentages des poids des chlorophylles a et b par rapport au poids frais et poids sec.
Ca = concentration en chlorophylle a
Cb = concentration en chlorophylle b
Ca = 12,7 x D.O 663 – 2,69 x D.O 645
Cb = 22,9 x D.O 645 – 4,68 x D.O 663
Ca+b= 20,2 x D.O 645 + 8,0 x D.O 663
Ca+b = D.O 652 / 36
Pour Chlorella vulgaris
La D.O à 663nm = 5,952
La D.O à 652nm = 5,388
La D.O à 645nm = 4,164
(mg.l-1)
(mg.l-1)
(mg.l-1)
(g.l-1) [11]
D’après les calculs, 1g de Chlorella vulgaris fraîche contient 25,8303 mg de chlorophylle, et cela représente 2,583% par rapport au poids frais.
Pour la feuille de Manihot esculenta
La D.O à 663nm = 2,16
La D.O à 652nm = 1,77
La D.O à 645nm = 1,55
Ainsi, avec 1g de la feuille de Manihot esculenta frais, 9,15 mg de chlorophylle est obtenus, et cela représente 0,915% par rapport au poids frais.

METHODES D’ETUDE QUALITATIVE DES CHLOROPHYLLES

Le témoin au spectrophotomètre est l’acétone 80%. Un balayage allant de la longueur d’onde 400nm à 700nm, à raison de 10nm par mesure a été effectué.
Discussion sur les résultats de l’étude quantitative de la chlorophylle :
Dans 1g de Chlorella vulgaris fraîche, il y a 25,83 mg de chlorophylle. 1g de feuille de Manihot esculenta frais renferme 9,15 mg de chlorophylle. Le taux de chlorophylle dans Chlorella vulgaris n’a pas atteint 3%, taux courant chez cette microalgue. Par l’analyse de ces données, la condition requise pour la production n’est pas encore réunie. Mais comparé avec la feuille de Manihot esculenta, elle présente un taux largement supérieur.
Chlorella vulgaris peut être exploiter en vue de produire de la chlorophylle. Ce taux chlorophyllien inférieur à 3% est dû en effet, que l’optimisation n’est pas encore orientée à la production d’un produit spécifique comme la chlorophylle. Peut être que l’éclairage n’est pas optimisé, et/ou la durée de la phase lumineuse et la phase obscure n’est pas équilibrée. [21]
Discussion sur les résultats de l’étude qualitative de la chlorophylle :
Les spectres d’absorption des chlorophylles de ces deux plantes renseignent sur les zones d’absorption minimale de source lumineuse du spectrophotomètre. Pour Chlorella vulgaris, cette zone se trouve entre 530nm et 570nm, et pour la feuille de Manihot esculenta cette zone se trouve entre 510nm et 550nm.
L’allure de la courbe de spectre d’absorption de Chlorella vulgaris permet de vérifier et de confirmer le choix de la longueur d’onde 550nm (qui se trouve dans sa zone d’absorption minimale) utilisée lors du suivi des cultures ultérieures.
Les spectres d’absorption indiquent aussi l’existence de deux pics, la base du premier pic se trouve au-dessus de 430nm et 460nm, le deuxième pic se trouve au-dessus de 660nm. Cela prouve que la microalgue peut contenir à la fois la chlorophylle a et b.
Puisque selon les bibliographies, les produits et les dérivés des macroalgues et des microalgues sont utilisés dans différents types d’industries, le dosage de l’un ou de deux ou plus de ces produits (chlorophylle, protéine, …) à partir de la biomasse de nos récoltes est une manière de vérifier la potentialité de cette nouvelle pratique qui est la culture d’algue.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Première partie : RESUME BIBLIOGRAPHIQUE
1 Chlorella vulgaris
1-1 Historique
1-2 Description botanique
1-2-1 Taxonomie
a Classification
1-2-2 Morphologie
1-3 Situation de la production
1-4 Répartition de Chlorella
1-5 Importance de Chlorella
1-5-1 Sur la santé
1-5-2 Les autres utilités de Chlorella
1-5-3 Les conditions de culture des microalgues
1-6 Physiologie de Chlorella
1-6-1 Facteurs internes
a Pigments chlorophylliens
b Pigments non chlorophylliens
1-6-2 Facteurs externes
a Salinité
b Lumière
c Température
d pH
e Aération
f Agitation
g Concentration de l’inoculum
h La nature de l’eau
Deuxième partie : ETUDE DES PIGMENTS PHOTOSYNTHETIQUES DE Chlorella vulgaris
1 INTRODUCTION
2 MATERIELS ET METHODES
A MATERIELS
1 Chlorella vulgaris
a Répartition géographique
2 Une plante supérieure
B METHODES
1 METHODES D’ETUDE QUANTITATIVE DES CHLOROPHYLLES
1-1 Principe
1-2 Méthodes
1-2-1 Extraction des pigments chlorophylliens
1-2-2 Mesure des D.O
1-2-3 Détermination de la masse de matière sèche
1-2-4 Calculs
2 METHODES D’ETUDE QUALITATIVE DES CHLOROPHYLLES
2-1 Principe
2-2 Méthodes
2-2-1 Extraction des pigments
2-2-2 Mesure des D.O
2-2-3 Détermination des pigments
3 RESULTATS ET INTERPRETATIONS
Troisième partie : DOSAGES DES PROTEINES TOTALES DE Chlorella vulgaris DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PAR LA METHODE DE KJELDAHL
1-Principe
2-Réactifs
3-Méthodes
4-Mode de calcul
5-Résultats et discussion
Quatrième partie : ETUDE DE LA CROISSANCE
A INTRODUCTION
B MATERIELS ET METHODES
B-1 Matériels
B-2 Milieu de culture
B-3 Méthodes
B-3-1 Méthodes de mesure de l’opacité
a Principe
b Méthodes
b -1 Détermination de la matière sèche
b -1-1 Dilutions
b -1-2 Mesure des densités optiques
B-3-2 Méthode de mesure par comptage cellulaire
a Principe
b Méthodes
b -1 Détermination de la matière sèche
b-1-1 Dilution
b-1-2 Observation sur cellules de Mallassez
b-1-3 Les cellules de Chlorella vulgaris
C RESULTATS ET INTERPRETATIONS
Cinquième partie : ESSAI D’OPTIMISATION DE LA CULTURE IN-VITRO DE Chlorella vulgaris
A INTRODUCTION
B MATERIELS ET METHODES
1 Matériels
1-1 Milieu de culture
1-2 Préculture
2 Méthodes
2-1 Analyse physique des milieux
2-1-1 Mesure du pH
a Principe
b- Méthode
2-2 Culture sur le milieu BRISTOL à 3N
a Principe
b Méthodes
c Détermination des paramètres d’état
c-1 Effet de la lumière
a Principe
b Méthode
c-2 Effet de l’agitation
a Principe
b Méthode
c-3 Effet du bullage
a Principe
b Méthode
c-4 Effet de la température
a Principe
b Méthode
c-5 Effet du pH
a Principe
b Méthode
c-6 Effet de la nature de l’eau
a Principe
b Méthode
c-7 Dispositif de la culture
3 Résultats et discussions
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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