DOSAGE RADIO IMMUNOLOGIQUE DE L’HORMONE βHCG DANS LA GROSSESSE MOLAIRE

Facteurs de variation physiologique

     Le rôle physiologique de l’ HCG est d’assurer le maintien de la grossesse ; de ce fait, elle est le marqueur biologique la de grossesse. C’est la première hormone produite en quantité appréciable par le trophoblaste. Elle est fixée à la surface externe des membranes des cellules trophoblastiques très précocement au cours des processus de différentiation. Elle est supposée avoir un rôle immunoprotecteur, évitant le rejet du blastocyte et facilitant la nidation. Elle exerce un contrôle sur la synthèse des hormones placentaire en stimulant la synthèse des œstrogènes. HCG stimule le corps jaune pendant les premières semaines de grossesse pour maintenir la production des hormones stéroïdiennes. Elle empêche la dégénérescence du corps jaune et stimule la production de progestérone par les cellules lutéales [9]. Elle permet un diagnostic précoce de la grossesse, avec un dosage dans le sang en cas de retard de règles. Par contre, elle ne permet pas de dater précisément la grossesse, les taux étant très variables. Les chiffres peuvent être normalement élevés en cas de grossesse multiples [34]. Elle est sécrétée dès le début de la conception, sa concentration augmente très vite jusqu’à la dixième semaine, puis elle redescend jusqu’à un plateau stable pendant toute la grossesse [9].

Utilisations de la radioimmunologie

        Dès leur mise au point, les méthodes radioimmunologiques ont été très largement utilisées pour la mesure des hormones (pancréatiques, hypophysaires, chorioniques, thyroïdiennes, … etc.). Actuellement, ces méthodes s’appliquent également aux dosages de nombreuses autres substances telles que les vitamines, les nucléotides, divers antigènes viraux ou cancéreux, les immunoglobulines. Ces méthodes ont également d’autres avantages.
– nécessitent l’utilisation de très faibles quantités de liquide biologique : les prises d’essai sont en général de l’ordre de quelques microlitres.
– permettent de doser simultanément un grand nombre  d’échantillons: les séries contiennent souvent une centaine de tubes, offrant ainsi la possibilité de doser 2 ou 3 fois un même échantillon.
– sont utilisables en routine, grâce à la rapidité et â la simplicité de la technique. Cet ensemble de conditions d’utilisation, très intéressant, risque néanmoins de devenir la source de nombreuses erreurs difficiles 3 détecter (erreurs de pipettage, erreurs de manipulation…).
Il apparaît alors essentiel, lors de toute série de dosages, de pouvoir contrôler soi-même sa manipulation dans les conditions réelles d’utilisation. De même, il est important de pouvoir vérifier que, lors de tout changement de réactifs ou d’utilisateur, les caractéristiques du dosage effectué sont conformes â celles trouvées habituellement dans le laboratoire.

Reproductibilité inter – essai

      On la détermine en répétant n fois le ou les mêmes dosages dans des conditions opératoires contrôlées mais différentes (techniciens différents, réactifs différents, lots différents, ou dates différentes . . .). Ces deux types de reproductibilité sont étudiés au niveau de la gamme d’étalonnage.

COMMENTAIRES ET DISCUSSION

       Le contrôle interne de qualité dans les laboratoires d’analyses implique une évaluation continue et critique des méthodes analytiques et des modes opératoires propres au laboratoire : il comprend le processus analytique qui commence avec l’introduction dans le laboratoire de l’échantillon à analyser, et finit avec le rapport d’analyse [2, 64] Toute analyse quantitative réalisée par immunodosage doit être régulièrement calibrée. La calibration d’une série d’un dosage nécessite sa validation préalable, basée sur les résultats du dosage d’un matériel de contrôle, analysé dans chaque série par un processus analytique identique à celui utilisé pour les échantillons de patients. [56] Les matériaux de contrôle (MC) ou matériaux de référence (MR) sont des matériaux de valeurs connues simulant le plus possible les échantillons réels de patients. Ils ont des propriétés d’homogénéité et de stabilité spécifiées et, idéalement, sont disponibles en grande quantité. Ils sont soumis, au même processus analytique que ces derniers. Ils permettent de vérifier, tout au long de la série de mesures, la qualité des résultats produits. Ils ne doivent pas être confondus avec les étalons ou les solutions standards qui ne peuvent en aucun cas être utilisés comme matériaux de contrôle. La première étape du CQI a consisté en la validation des séries en se basant sur l’analyse de la représentation graphique des résultats des contrôles (diagramme de Levey-Jennings), qui permet de suivre la variabilité naturelle du processus analytique et d’anticiper sa dégradation. Dans notre laboratoire, la valeur cible du contrôle indiquée par le fournisseur est de 116 mUI/ml avec un écarts-type de 20 mUI/mL et les limites ont été fixées à ± 2 écarts-types comme niveau d’avertissement et ± 3 écarts-types comme niveau de mesure à prendre. Toutes les séries ont été validées, les valeurs du contrôle obtenues pour l’ensemble des séries se situant en deçà de la limite d’alerte : m ± 2ET (116 ± 40) préconisée par les règles de Westgard et Levey Jennings. Une infraction à la règle 10x de Westgard a permis de repérer un biais (différence entre la valeur réelle et la valeur obtenue) systématique dans une zone unique de la courbe de calibration (mois de Mars). Enfreindre une règle d’alarme n’implique pas nécessairement le rejet de la série analytique. En effet, en pratique l’analyse d’une série peut prendre suffisamment de temps pour que de petites erreurs systématiques se produisent. Par exemple, les réactifs peuvent se dégrader, les appareils peuvent dériver, des ajustages mineurs des valeurs instrumentales peuvent être nécessaires, ou la température du laboratoire peut s’élever. Ces infractions sont typiques d’une erreur systématique mineure qui souvent n’est pas cliniquement significative. Il est à noter que les bonnes pratiques de laboratoire exigent d’utiliser pour surveiller le processus analytique des matériaux de contrôle couvrant l’ensemble du domaine de mesure idéalement à trois niveaux de concentration, ou à défaut, un minimum de deux niveaux de concentration usuellement appliqué en pratique [46]. La trousse de β HCG de CisBioassay ne propose qu’un seul niveau de contrôle et pour pallier à cette insuffisance, il faudrait se procurer deux autres matériaux de référence dont le coût pour le laboratoire reste prohibitif, et l’alternative que représentent les materiaux de référence maison (MRM), matériaux de référence fabriqués par le laboratoire à partir d’échantillons de patients ou d’ajout dosé d’étalons dans une matrice biologique pose le problème de leur obtention en quantité suffisante pour assurer un contrôle annuel et de leur stabilité. Apres avoir validé notre série, nous avons sélectionné les paramètres qui nous paraissent être les plus importants dans le cadre du contrôle de qualité, ces paramètres sont les suivants :
• Linéarité et reproductibilité des standards
• Précision, par l’étude de la reproductibilité inter et intra essai et des profils de précision
• Exactitude
La linéarité et reproductibilité des standards : la répétabilité est bonne, les coefficients de variation sont compris entre 1,11 et 4,9%. La précision varie en fonction de la concentration en βHCG, c’est pourquoi, la reproductibilité intra et inter- essai qui a servi à tracer les profils de précision s’est faite à 3 niveaux, bas (4,41 ± 0,49), moyen (96,64 ± 1,88) et élevé (1061,91 ± 17,43). Les coefficients de variation largement inférieurs à 5% aussi bien en intra-essai qu’en inter-essai pour les sérums moyens et élevés. Par contre, ils sont plus importants respectivement 11,16% et 21,8%) en intra et inter-essai pour les sérums bas. La précision du dosage se rapporte à l’erreur aléatoire qui dépend de la concentration à mesurer, l’erreur étant plus grande aux concentrations faibles. Le profil de précision révèle tout son intérêt à plusieurs niveaux. Dans le cadre du contrôle de qualité, de s’assurer de la précision aux niveaux de concentration qui représentent des seuils de décision importants sur le plan clinique, à savoir le diagnostic initial, le suivi après l’expulsion molaire et la guérison ou l’évolution anormale ; en tenant compte de la valeur de négativation fixée à 5mUI/ml [24] il est possible de déterminer sur le profil de précision intra-essai, la zone de travail avec un coefficient de variation acceptable 11% pour des valeurs de 5mUI/ml βHCG, pour atteindre des taux ≤ 3% à partir de 10mUI/mL en βHCG. L’exactitude du dosage : elle a pu être appréciée en comparant les moyennes du contrôle dosé 87 fois avec les valeurs de référence et à l’aide du test de dilution [64]. Pour des faibles valeurs (celle du contrôle), les concordances sont bonnes : Les résultats des moyennes des contrôles obtenus varient entre 113,31 et 124,78 mUI/ml et se trouvent dans les limites des valeurs données par le fournisseur : 96 – 136 mUI/ml et pour le test de dilution, les valeurs des concentrations pour les dilutions au 1/10ème et au 1/100ème sont regroupées sur la droite allant à l’origine. Par contre, il existe des divergences pour des taux élevés de βHCG ≥ 10000 mUI/ml, visualisées par le test de dilution ; ce qui indique dans une certaine mesure la présence d’une erreur systématique, pouvant avoir plusieurs origines :
– Destruction de l’analyte au cours des étapes précédant le dosage (prélèvement, transport, centrifugation, décantation).
– Méthode de mesure ou de calcul
– Comportement des solutions standards (différent de celui de l’échantillon à doser)
Le contrôle de qualité, nécessite une étape pré-analytique concernant la vérification de la conformité des prélèvements et réactifs, de leur conservation, et le contrôle des dates d’expiration des trousses, une étape analytique concernant l’exécution correcte du mode opératoire, et le contrôle proprement dit, et une étape post analytique en rapport avec toutes les étapes qui suivent l’analyse jusqu’à la transmission des résultats au prescripteurs

CONCLUSION

        La présente étude porte sur 87 séries de dosage de la β HCG, réalisées durant l’année 2014, au laboratoire de biophysique médecine nucléaire de l’université Cheikh Anta Diop de Dakar. Elle traite les différents aspects du contrôle de qualité interne du dosage de la β HCG, cette dernière étant utilisée comme marqueur de tumeurs trophoblastiques (môles hydatiformes et des choriocarcinomes). Les MTG regroupent plusieurs entités distinctes dont le dénominateur commun est une hypersécrétion d’HCG : la mole complète, la mole partielle et les choriocarcinomes. Ces pathologies diffèrent par leur origine, leur morphologie, leur évolution et leur traitement. La biologie garde toujours une place importante et primordiale dans le diagnostic et la surveillance de la maladie môlaire Le contrôle de qualité est un outil facilitant et fiabilisant les diagnostics médicaux. Il est exigeant et nécessite la réalisation de plusieurs étapes primordiales afin d’assurer la confiance dans les résultats transmis. Il doit tenir compte de l’ensemble des facteurs influençant la qualité d’un test biologique. Le CQI est une procédure qui a été réalisée en même temps que la mesure de la β HCG dans des échantillons de patients. Il a nécessité l’utilisation d’un matériel de contrôle de référence de valeur connue analysé dans chaque série de dosage réalisée par un processus analytique identique à celui utilisé pour les échantillons de patients. Il s’est basé sur l’application de concepts statistiques pour l’établissement des valeurs cibles et des écarts acceptables. Un dosage régulier du contrôle a permis l’élaboration d’une base de données de CQ utilisée pour la construction du diagramme de Levey-Jennings afin de valider les résultats des séries. Toutes les séries ont été validées, les valeurs du contrôle obtenues pour l’ensemble des séries se situant en deçà de la limite d’alerte : m ± 2ET (116 ± 40) préconisée par les règles de Westgard et Levey Jennings Le CQI a consisté à évaluer les indicateurs de performance suivants
– la linéarité de la courbe d’étalonnage : capacité à donner des résultats directement proportionnels à la concentration de l’analyte dans les échantillons. La répétabilité était excellente, avec des coefficients de variation compris entre 1,11 et 4,9%.
– la précision : qualité de l’accord entre des mesures répétées, effectuées dans des conditions déterminées, dans une zone définie de concentration en intra et inter-essai. Elle a servi à définir la reproductibilité de mesure, exprimée par le coefficient de variation. La précision était bonne pour des valeurs ≥ 10mUI/ml (CV ≤ 3%) et acceptable (CV : 11%) aux faibles concentrations, correspondant au seuil diagnostic de normalisation de 5mUI/ml pour les grossesses molaires
– l’exactitude : étroitesse de l’accord entre une valeur mesurée et une valeur vraie de référence certifiée par le fabricant. Elle a été réalisé par comparaison de la moyenne des contrôles avec la valeur de référence et à l’aide du test de dilution d’échantillons au 1/10 et au 1/100ème .
Les résultats des moyennes des contrôles obtenues ont varié entre 113,31 et 124,78 mUI/ml et se trouvaient dans les limites des valeurs données par le fournisseur : 96 – 136 mUI/ ; pour le test de dilution, les valeurs des concentrations pour les dilutions au 1/10ème et au 1/100ème sont regroupées sur la droite allant à l’origine pour des valeurs inférieures à 10000 mUI/ml. Pour des valeurs supérieures, les divergences obtenues, imposent la préférence de la dilution au 1/10ème. Un contrôle de qualité interne (CQI) rigoureux, permet de s’assurer non seulement de la stabilité de la méthode du dosage, mais aussi de la qualité des résultats obtenus qui sont déterminent dans la prise en charge des malades. Trois défis majeurs restent cependant à relever dans l’application et – la mise en œuvre d’un contrôle de qualité au Sénégal : La disponibilité d’un personnel qualifié en nombre suffisant pour assurer la pratique et le suivi du programme de qualité. La disponibilité en ressources financières pour l’acquisition de matériaux de contrôle fiables, à plusieurs niveaux, généralement non inclus dans les kits commerciaux et assurer la durabilité de ce programme en dépits des coûts de fonctionnement importants qu’il génère Le partenariat au niveau national et international permettant d’intégrer les programmes de contrôle de qualité externe

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
I.HORMONE CHORIONIQUE GONADOTROPE (HCG)
I.1. Structure
I.2. Facteurs de variation
I.2.1. Facteurs de variation physiologique
I.2.2. Facteurs de variation pathologiques
I.2.2.1 Définition de la grossesse molaire
I.2.2.2 Surveillance biologique de la grossesse molaire
II.DOSAGE DE LA βHCG ET CONTROLE QUALITE
II.1. Dosage de la βHCG
II.1.1. Dosage radioimmunologique
II.1.1.1. Définition
II.1.1.2. Principe
II.1.1.3. Différentes méthodes de dosage
II.1.1.4. Utilisation de la radioimmunologique
II.1.2. Autres méthodes : Les méthodes immunoenzymatiques (ELISA)
II.1.2.1. Principe
II.1.2.2 Différents types de méthodes
II.2. Contrôle qualité
II.2.1. Définition
II.2.2. Intérêt
II.2.3. Facteurs Influençant la qualité d’un Test Biologique
II.2.4. Le contrôle de qualité des analyses de biologie médicale
II.2.4.1 Contrôle de qualité interne
II.2.4.1.1 Processus
II.2.4.1.2 Validation résultats
II.2.5. Paramètres du contrôle de qualité
II.2.5.1 Linéarité
II.2.5.2 Précision
II.2.5.3 L’exactitude
II.2.5.4 Sélectivité
II.2.5.5 Sensibilité
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I. CADRE DE L’ETUDE 
I.1. Type d’étude
I.2. Période d’étude
I.3. Objectif de l’étude
II. MATERIEL ET METHODE
II.1. Matériel
II.1.1. Equipement
II.1.2. Echantillons et réactifs
II .1.2.1. Prélèvements
II.1.2.2. Réactifs d’immunodosage
II.1.3. Protocole
II.1.4. Précaution et avertissements
II.2. Méthodologie
II.2.1. Validation des séries
II.2.2. Validation analytique
II.2.2.1. Linéarité et reproductivité des standards
II.2.2.2 Précision
II.2.2.3. Exactitude
III. RESULTATS
III.1. Validation des séries
III.2. Validation analytique
III.2.1. Linéarité et reproductibilité des standards
III.2.2. Précision
III.2.3. Exactitude
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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