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Classification et caractéristiques des lipoprotéines
Il existe différents types de lipoprotéines plasmatiques pouvant être classées en six populations et qui diffèrent par leur taille, leur densité, leur charge (mobilité électrophorétique), mais également la proportion relative de leurs différents constituants ainsi que par leur composition en apolipoprotéines.
C’est ainsi qu’on distingue :
– Les chylomicrons (CM),
– Les lipoprotéines de très basse densité (VLDL : Very Low Density Lipoprotein),
– Les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL : Intermediary Density Lipoprotein),
– Les lipoprotéines de basse densité (LDL : Low Density Lipoprotein),
– Les lipoprotéines de haute densité (HDL : High Density Lipoprotein)
– La Lp (a), composée d’une molécule d’apolipoprotéine (a) reliée par un pont disulfure à une molécule d’apo B100.
Concernant leur composition lipidique, les lipoprotéines les moins denses (chylomicrons et VLDL) contiennent principalement des triglycérides et les lipoprotéines de densité plus élevée (LDL et HDL) transportent quant à elles essentiellement des esters de cholestérol (Tableau I).
Métabolisme des lipoprotéines exogènes
Les entérocytes synthétisent les chylomicrons à partir des lipides alimentaires.
Au niveau de l’enveloppe se trouve des apolipoprotéines synthétisées par l’entérocyte que sont les apo B48, A-I et A-IV. Les chylomicrons rejoignent la circulation sanguine par le canal lymphatique et acquièrent des apo E, CI, CII, et CIII en échangeant leurs apo A-I et A-IV avec les HDL.
Dans les vaisseaux, les chylomicrons sont rapidement délipidées par la LPL qui est activée par leur apo CII. Les TG des CM sont hydrolysés en acides gras libres qui pénètrent dans les tissus adipeux et musculaire.
Il en résulte une modification de leur structure avec libération d’éléments de la couche superficielle constituée de phospholipides, de cholestérol et d’apolipoprotéines qui vont rejoindre les HDL. Cette libération conduira à la formation de CM résiduels encore appelés «remnants».
Ces remnants seront reconnus par plusieurs récepteurs hépatiques dont les récepteurs aux Apo E et la LRP qui assureront leur internalisation et leur dégradation dans le foie (Figure 2).
Métabolisme des lipoprotéines endogènes
Les VLDL sont synthétisés pour 90% des cas au niveau du foie et pour 10% au niveau de l’intestin. Elles transportent les TG endogènes ou hépatiques et assurent le transport de 80% des TG à jeun. L’apo B100 est indispensable à leur formation. La LPL hydrolyse les particules de VLDL et s’en suit une extraction des triglycérides. Les VLDL ainsi appauvries en TG conduisent à la formation d’IDL qui ont deux destinées possibles (i) soit captées par le foie par des récepteurs spécifiques aux apo B100–E ou par le récepteur LRP (ii) soit transformées en LDL sous l’action d’une enzyme hépatique, la lipase hépatique.
Les LDL qui résultent de la dégradation des IDL dans la circulation par la lipase hépatique sont des édifices de petites tailles très appauvris en TG mais enrichis en esters de cholestérol. Les LDL assurent le transport du cholestérol total plasmatique vers les cellules des tissus périphériques et surtout vers le foie. L’épuration des LDL par l’hépatocyte assure l’homéostasie de notre organisme en cholestérol, le foie étant le seul organe capable de les convertir en acides biliaires.
L’élimination des LDL fait intervenir leur fixation sur des récepteurs hépatiques à apo B/E retrouvés sur des zones appelées « coated pits ». Les LDL subissent alors l’action d’une protéase qui les transforme en acides aminés ; le cholestérol estérifié qui est secondairement transformé en cholestérol libre déclenche les mécanismes régulant la concentration des LDL circulantes :
– L’inhibition de l’HMGCoA réductase, enzyme clé de la biosynthèse du cholestérol total,
– Mise en réserve du cholestérol sous forme d’ester par stimulation de l’ACAT,
– Contrôle négatif de la synthèse des récepteurs.
Métabolisme des HDL : transport inverse du cholestérol total
L’origine des HDL est double à la fois tissulaire (foie, intestin) et plasmatique (hydrolyse des CM et VLDL). Les HDL sont secrétées par le foie sous forme de particules discoïdales (HDL naissantes), pauvres en cholestérol. Dans la circulation, les HDL reçoivent des apolipoprotéines (A, C et E) et des phospholipides issus de l’hydrolyse des chylomicrons et des VLDL. Les HDL vont capter du cholestérol libre au niveau des différentes cellules de l’organisme. Le transfert du cholestérol intracellulaire vers les particules HDL fait intervenir un transporteur spécifique ABCA1 (ATP binding cassette transporteur A1).
Les particules HDL en se chargeant en cholestérol vont ainsi progressivement augmenter de taille donnant naissance aux HDL3, puis au HDL2 (HDL de grande taille). Au sein des HDL, la LCAT transforme le cholestérol libre en cholestérol estérifié qui migre au centre de la lipoprotéine. Les HDL2 chargées en cholestérol estérifié vont être captées au niveau du foie par l’intermédiaire d’un récepteur SR-B1 puis métabolisées et leur cholestérol total sera éliminé par voie biliaire. Les HDL2 peuvent être transformées en HDL3 par la lipase hépatique, retourner dans la circulation et jouer à nouveau leur rôle d’accepteur de cholestérol total.
Le métabolisme des lipoprotéines est sous l’influence de protéines de transfert des lipides. Parmi celles-ci, la CETP et la PLTP jouent un rôle important. La CETP facilite le transfert des triglycérides des VLDL vers les LDL et HDL, et celui du cholestérol estérifié des HDL et LDL vers les VLDL. Tandis que la PLTP favorise les transferts de phospholipides mais aussi du cholestérol libre et d’alpha tocophérol entre les lipoprotéines (Figure 2).
Rôle athérogène des LDL
L’athérosclérose se caractérise par l’accumulation dans l’espace sous-endothélial de la paroi vasculaire de cholestérol et de cellules spumeuses correspondant à des macrophages enrichis en cholestérol après captage de lipoprotéines oxydées (Figure 3). La dysfonction endothéliale est actuellement reconnue comme une anomalie précoce jouant un rôle majeur dans l’initiation de la plaque d’athérome. La cellule endothéliale perd ses propriétés anti-athérogènes et facilite au contraire le recrutement de leucocytes par l’expression de molécules d’adhésion, de phénomènes pro-oxydants, pro-inflammatoires, pro-thrombotiques et pro-apoptotiques. Les LDL constituent la principale classe de lipoprotéines pro-athérogènes. Leur passage vers l’espace sous-endothélial est facilité par différents facteurs tels que l’augmentation de la perméabilité endothéliale, une diminution de la perméabilité de la média ou une concentration plasmatique élevée de LDL. Les facteurs hémodynamiques, par exemple la pression ou les forces de cisaillement de la paroi, jouent également un rôle dans le transfert des LDL [9-12].
Leur rétention dans l’espace sous-endothélial est alors facilitée par une interaction électrostatique entre les protéoglycanes de la matrice extracellulaire et les régions basiques de l’apo B100 [11, 13].
La rétention des LDL dans l’intima favorise leur oxydation, étape essentielle du processus athéromateux. L’oxydation des LDL est une réaction en chaîne déclenchée par une forme hautement réactive de l’oxygène que sont les radicaux libres. Ces radicaux libres sont d’origines multiples. Ils sont issus d’ions superoxyde, de peroxyde d’hydrogène, de peroxynitrite, d’acide hypochloreux et de radicaux hydroxyles [14]. L’oxydation des LDL augmente leur électronégativité avec comme conséquence une perte de la reconnaissance par les récepteurs des LDL [15]. Les LDL oxydées sont reconnues par un autre récepteur dit « éboueur » ou « scavenger » situé au niveau de la membrane cytoplasmique des macrophages. Ces macrophages captent préférentiellement les LDL modifiées et se transforment ensuite en cellules spumeuses.
L’accumulation des cellules spumeuses dans l’intima aboutit à la formation de stries lipidiques qui se transforment progressivement en plaque fibreuse par un processus analogue à celui de la cicatrisation. Les macrophages secrètent alors des facteurs de croissance qui attirent les cellules musculaires lisses vers l’intima artérielle favorisant la prolifération des plaques fibreuses [16].
Ces plaques se transforment à leur tour progressivement en lésions fibreuses ou nécrotiques suivant que les macrophages éliminent ou non les cellules spumeuses endommagées. Les lésions évoluent ensuite en plaques instables sujettes aux phénomènes de thrombose, c’est-à-dire la rupture de la plaque d’athérome et la formation d’un caillot de sang [17].
Les différentes méthodes de dosage des lipoprotéines
Les dyslipidémies sont dépistées par l’exploration d’une anomalie lipidique (EAL) qui consiste à doser en routine le cholestérol total, le cholestérol LDL, le cholestérol HDL et les triglycérides.
Méthodes de dosage du cholestérol total
Les techniques de dosage du cholestérol total utilisées actuellement dans les laboratoires de biologie médicale sont toutes des méthodes utilisant une réaction enzymatique entraînant une coloration mesurée par spectrométrie. Les méthodes peuvent cependant être divisées en deux groupes principaux, celles utilisant un chromogène phénolique et celles utilisant un chromogène non phénolique. Dans la majorité des cas, la technique utilisée est la spectrophotométrie avec une réaction indicatrice utilisant une peroxydase (POD) et un chromogène phénolique.
Méthodes utilisant un chromogène phénolique
Ces méthodes reposent sur l’action de deux enzymes : la cholestérol estérase et la cholestérol oxydase. Ces dernières dégradent les esters de cholestérol et le cholestérol libre en cholesténone et le peroxyde d’hydrogène formé réagit alors avec le chromogène phénolique en présence de peroxydase. Le chromogène phénolique utilisé est la 4-aminoantipyrine et entraîne une coloration rouge de la solution, dont l’intensité est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 512 nm, et est directement proportionnelle à la concentration en cholestérol. Cette dernière réaction est appelée réaction de Trinder.
Méthodes utilisant un chromogène non phénolique
Il existe actuellement deux types de méthodes utilisant un chromogène non phénolique, une méthode par spectroréflectométrie et une méthode de spectrophotométrie.
Spectroréflectrométrie utilisant un chromogène non phénolique
Le principe de cette méthode est proche de celui utilisant un chromogène phénolique. Le peroxyde d’hydrogène oxyde un « leuco colorant » en présence de peroxydase, ce qui colore la solution proportionnellement à la concentration en cholestérol présent dans l’échantillon. La détection utilise non pas la spectrophotométrie mais la spectro-reflectométrie à 540 nm qui mesure la quantité de lumière réfléchie. La réflectance sera d’autant plus forte que la concentration en chromogène oxydé est faible (Figure 4).
Actuellement cette méthode est uniquement mise en oeuvre par le système Vitros (Ortho-CD). D’un point de vue pratique, elle utilise un élément analytique multicouche recouvrant un support polyester (Figure 4). Une goutte de l’échantillon est déposée puis étalée de la couche « 2 » vers la couche « 3 ». La couche « 2 » contient les différents réactifs enzymatiques ainsi que le Triton X- 100. Le Triton est un détergent qui permet de dissocier le cholestérol et les esters de cholestérol des lipoprotéines présentes dans l’échantillon afin de faciliter les réactions enzymatiques. La couche « 3 » contient quant à elle les réactifs permettant d’obtenir la coloration de la solution.
Valeurs usuelles
Les valeurs usuelles du cholestérol total sont comprises entre 1.5 et 2 g/L.
Méthodes de dosage du cholestérol HDL
Dans les laboratoires de biologie médicale, les techniques de dosage utilisées pour doser le cholestérol HDL peuvent également être séparées en deux groupes : les techniques par précipitation sélective et les techniques homogènes.
Techniques de précipitation sélective des lipoprotéines
Les techniques de précipitation chimique sélective ont été rapportées pour la première fois dans la littérature par Burstein et Samaille en 1960 [22]. Le principe consiste à précipiter sélectivement les VLDL et LDL dans des échantillons de sérum et de plasma grâce à l’utilisation d’un mélange de polyanions et de cations divalents ou d’autres réactifs.
Le réactif de précipitation utilisé dans notre contexte est le phosphotungstate de magnésium. Ce mélange va agréger sélectivement les lipoprotéines contenant une apo B et les rendre insolubles. Elles seront ensuite sédimentées par une étape de centrifugation et seules les HDL présentes en solution pourront être prélevées et le cholestérol associé dosé.
Les méthodes homogènes
Principes
Les méthodes directes, également appelées « homogènes » ont vu le jour pour la première fois en 1994 [23]. Ces techniques sont entièrement automatisées et peuvent être divisées selon leur principe en 5 sous-groupes.
La méthode la plus utilisée est celle utilisant des enzymes modifiées avec du polyéthylène glycol (PEG). Cette méthode utilise une association d’α- cyclodextrines et d’ions magnésium Mg²+ qui bloquent sélectivement les chylomicrons, VLDL et LDL sans les précipiter. La spécificité des enzymes cholestérol oxydase et cholestérol estérase pour le cholestérol HDL est ensuite renforcée par la liaison covalente du PEG sur ces enzymes les empêchant d’accéder au cholestérol présent au sein des lipoprotéines contenant une apo B.
Le peroxyde d’hydrogène formé réagit ensuite avec la 4-aminoantipyrine et le DSBmT [Disodium de N,N- bis-(4-sulfobutyl)-m-toluidine] en présence de peroxydase (POD) et entraîne la formation d’une coloration.
Dans le deuxième type de méthode homogène, le premier réactif contient un accélérateur de la réaction provoquée par la cholestérol oxydase (CO) qui réagit avec le cholestérol associé aux chylomicrons, VLDL et LDL. Le peroxyde d’hydrogène formé réagit ensuite avec le DSBmT en présence de peroxydase et donne une solution incolore. Dans un deuxième temps, les HDL sont solubilisées par un détergent spécifique leur permettant de réagir avec la cholestérol estérase et la cholestérol oxydase. La présence de peroxydase entraîne la coloration de la solution.
La troisième méthode a pour principe une immuno-inhibition des lipoprotéines contenant une apolipoprotéine B. Pour ce faire, le réactif utilisé contient des anticorps dirigés contre les apolipoprotéines B humaines contenues dans les chylomicrons, VLDL, IDL et LDL. Les complexes antigène-anticorps formés ne réagiront pas avec les enzymes cholestérol estérase et cholestérol oxydase. Seul le cholestérol HDL réagira sélectivement avec ces enzymes et le peroxyde d’hydrogène formé entraînera une coloration de la solution après avoir réagi avec la peroxydase (POD) et le chromogène.
Valeurs usuelles
Les valeurs usuelles des TG sont < 1.5 g/L.
Méthodes de dosage du cholestérol LDL
Plus couramment, la concentration du cholestérol LDL est calculée indirectement par l’utilisation de l’équation de Friedewald mais qui cependant présente des limites et n’est pas applicable pour des concentrations en triglycérides supérieures à 3,4 g/L.
Des techniques de dosage entièrement automatisées également appelées « techniques homogènes » sont aujourd’hui disponibles dans les laboratoires de biologie médicale.
Calcul du cholestérol LDL par l’équation de Friedewald
Ce calcul suppose que le cholestérol total est essentiellement distribué dans trois classes majeures de lipoprotéines : les VLDL, les HDL et les LDL. Il repose sur les mesures des concentrations sériques du cholestérol total, des triglycérides et du cholestérol HDL afin de déterminer la concentration du cholestérol LDL en utilisant les équations suivantes :
Le rapport TG/5 ou TG/2,2 est une estimation de la concentration en VLDL-cholestérol lorsque la concentration est exprimée respectivement en g/L ou en mmol/L. Chez les individus normolipidémiques, le rapport de concentration entre les triglycérides et le cholestérol au sein des VLDL est en moyenne de 5/1 [8].
La concentration du cholestérol LDL estimée par cette équation prend également en compte la contribution du cholestérol associé aux IDL et à la Lp (a) qui sont, avec les LDL, les lipoprotéines les plus athérogènes.
L’utilisation de cette équation possède cependant un certain nombre de limitations. Premièrement, elle cumule les incertitudes de mesure du cholestérol total, des triglycérides et du cholestérol HDL. Deuxièmement, elle ne peut pas être utilisée lorsque la concentration en triglycérides est supérieure à 3.4 g/L ou avec des échantillons dont la concentration en chylomicrons est importante, comme par exemple dans les échantillons de patients non à jeûn.
Ces échantillons ont alors une fraction de VLDL contenant plus de triglycérides que la normale. Dans ce cas, la concentration en VLDL-cholestérol est surestimée, ce qui entraîne une sous-estimation de la concentration du cholestérol LDL.
Cette équation ne peut également pas être utilisée chez les patients atteints d’hyperlipoprotéinémie de type III, qui se traduit par une concentration importante de β-VLDL. Dans ce cas L’utilisation de l’équation de Friedewald sous-estime alors la concentration en cholestérol dans la fraction de VLDL et par conséquent surestime le cholestérol LDL.
Dans la majorité des cas, les échantillons ont une concentration en triglycérides suffisamment basse pour permettre l’utilisation de l’équation de Friedewald.
Cependant les laboratoires de biologie médicale se retrouvent quotidiennement dans l’impossibilité de rendre un résultat du cholestérol LDL calculé par la formule de Friedewald chez un à plusieurs patients en raison d’une triglycéridémie trop élevée.
C’est pourquoi de nouvelles méthodes de dosage du cholestérol LDL dites « directes » ont vu le jour depuis la fin des années 90. Ces méthodes permettent d’obtenir des incertitudes de mesure plus faibles que celles obtenues avec l’équation de Friedewald, qui cumule celles obtenues pour les 3 paramètres pris en compte dans le calcul. Elles évitent également la présence d’interférences liées à des concentrations importantes en triglycérides.
Méthodes dites « directes »
Méthodes de première génération : la précipitation chimique
Il s’agit d’une méthode de précipitation sélective des LDL grâce à l’ajout de différents composés chimiques qui peuvent être de l’héparine à pH 5,12 , du polyvinylsulfate, un polymère amphiphatique non spécifique ou encore du sulfate de dextran.
Après la réaction de précipitation des LDL, le surnageant et le précipité sont séparés par une étape de centrifugation. La concentration du cholestérol LDL peut ensuite être déterminée de deux façons différentes. Elle peut être calculée indirectement en soustrayant la concentration en cholestérol mesurée dans le surnageant après la centrifugation à celle mesurée avant cette étape. Elle peut également être mesurée directement dans le précipité après l’avoir resuspendu.
Cependant, ces dernières présentent un certain nombre d’inconvénients et d’interférences d’où le développement des technique de deuxième génération.
Méthodes de deuxième génération : l’immuno-séparation
Il s’agit de méthodes d’immuno-séparation dont le principe consiste à éliminer toutes les lipoprotéines autres que les LDL par une étape de prétraitement manuel. Le cholestérol LDL est ensuite mesuré directement dans le surnageant à l’aide de kits de dosage enzymatique après une filtration sur membrane [25].
Pour ce faire, cette méthode utilise des anticorps polyclonaux fixés sur des billes de latex. Ces anticorps sont dirigés contre l’apolipoprotéine A-I présente sur les HDL et l’apolipoprotéine E présente sur les chylomicrons, les VLDL et les IDL.
La principale limitation étant l’étape manuelle, des méthodes de troisième génération automatisées ont été développées à partir de 1998.
Méthodes de troisième génération : les analyses homogènes
Il existe actuellement différentes méthodes de troisième génération qui peuvent être séparées en 2 groupes principaux, les méthodes utilisant des détergents et les méthodes à la catalase. Ces différentes méthodes utilisent des réactifs pouvant contenir différents tensioactifs, polymères ioniques ainsi que d’autres composés chimiques qui permettent un blocage spécifique ou une solubilisation des différentes classes de lipoprotéines afin de mesurer spécifiquement le cholestérol associé aux LDL par techniques enzymatiques.
Les méthodes utilisant les détergents
Le principe général de ces méthodes consiste à bloquer les lipoprotéines autres que les LDL. Seul le cholestérol associé aux LDL sera dosé par une réaction enzymatique.
Les méthodes avec catalase
Ces méthodes ont pour principe de dégrader dans un premier temps le cholestérol associé aux lipoprotéines autres que les LDL. L’utilisation d’une catalase permet de dégrader le peroxyde d’hydrogène formé lors de cette réaction.
Dans un second temps, seul le cholestérol LDL subit les différentes réactions enzymatiques permettant un dosage spécifique.
Valeurs usuelles
Les valeurs usuelles du cholestérol LDL sont < 1.6 g/L.
Standardisation du dosage du cholestérol LDL
La β-quantification constitue la méthode de référence quant au dosage du cholestérol LDL. Mais cette dernière requière un processus lourd et fastidieux si bien qu’elle est réservée aux laboratoires de recherche et non de routine.
Le programme américain NCEP (National Cholesterol Education Program) recommande en l’absence de méthode de référence de disposer de méthodes qui répondent aux exigences suivantes : une erreur totale maximum de 12 % obtenue à partir d’un biais et d’un coefficient de variation < 4 % [26].
Il recommande en routine l’utilisation de la formule de Friedewald à condition que les exigences analytiques relatives aux dosages du cholestérol total, du cholestérol HDL et des triglycérides soient respectées de même que les limites de son utilisation.
Le NCEP précise également que la méthode de Friedewald ne doit pas être utilisée comme une méthode de référence [26].
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Table des matières
Première partie : Généralités sur les lipoprotéines
I. Définition
II. Structure
III. Classification et caractéristiques des lipoprotéines
IV. Métabolisme des lipoprotéines
IV.1. Métabolisme des lipoprotéines exogènes
IV.2. Métabolisme des lipoprotéines endogènes
IV.3 Métabolisme des HDL : transport inverse du cholestérol total
V. Rôle athérogène des LDL
VI. Les différentes méthodes de dosage des lipoprotéines
VI.1. Méthodes de dosage du cholestérol total
VI.1.1. Méthodes utilisant un chromogène phénolique
VI.1.2. Méthodes utilisant un chromogène non phénolique
VI.1.2.1. Spectroréflectrométrie utilisant un chromogène non phénolique
VI.1.2.2. Spectrophotométrie utilisant un chromogène non phénolique
VI.1.3. Interférences
VI.1.4. Valeurs usuelles
VI.2. Méthodes de dosage du cholestérol HDL
VI.2.1. Techniques de précipitation sélective des lipoprotéines
VI.2.2. Les méthodes homogènes
VI.2.2.1. Principes
VI.2.2.2. Interférences
VI.2.2.3. Valeurs usuelles
VI.3. Méthodes de dosage des triglycérides
VI.3.1. Principe
VI.3.2. Valeurs usuelles
VI.4. Méthodes de dosage du cholestérol LDL
VI.4.1. Calcul du cholestérol LDL par l’équation de Friedewald
VI.4.2. Méthodes dites « directes »
VI.4.2.1. Méthodes de première génération : la précipitation chimique
VI.4.2.2. Méthodes de deuxième génération : l’immuno-séparation
VI.4.2.3. Méthodes de troisième génération : les analyses homogènes
VI.4.3. Valeurs usuelles
VII. Standardisation du dosage du cholestérol LDL
Deuxième partie : Travail expérimental
I. Méthodologie
I.1. Type et cadre d’étude
I.2. Objectifs
I.3. Population d’étude
I.4. Echantillonnage
I.5. Paramètres étudiés
I.6. Méthodes de dosage
I.6.1. Dosage du cholestérol total
I.6.2 Dosage du cholestérol HDL
I.6.3. Dosage des triglycérides
I.6.4. Détermination de la concentration du cholestérol LDL
I.6.4.1 Calcul par la formule de Friedewald
I.6.4.2 Dosage du cholestérol LDL par méthode directe en phase homogène
I.7. Exploitation statistique
II. Résultats
II.1. Caractéristiques générales de la population d’étude
II.2. Description statistique des concentrations du cholestérol LDL obtenues avec les deux méthodes
II.3. Etude de la corrélation entre les deux méthodes
II.4. Evaluation de la concordance entre les deux méthodes
III. Discussion
Conclusion
Références
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