Soutenance mémoire
Les allergènes
Les allergènes apparaissent sous différentes formes (King et al, 1994). En premier lieu, les trophallergènes d’origine alimentaire (Hefle, 1996), à savoir le lait, l’œuf, l’arachide, la moutarde, les crustacés…qui sont les plus fréquents chez les enfants. Les aéroallergènes (Ledford, 1994) comprenant les pneumoallergènes qui pénètrent essentiellement par la voie respiratoire comme la poussière, les débris de phanères d’animaux, les acariens, mais également ceux qui entrent par la voie cutanée. La réaction allergique peut également être déclenchée par des substances médicales (Andersson, 1992) comme les polymyxines B et E, l’antibiotique kanamycine (Oyama et al, 2001), des substances naturelles ou synthétiques libératrices d’histamine telles la spermine (Purcell et al, 1996), les neuropeptides substances P (Repke et Bienert, 1987) ou substances Y (Gundemar et Häkanson, 1991 ; Cross et al, 1993), le composé 48/80 (Paton, 1951)…
Les mastocytes et les basophiles
Ce sont les cellules déclenchantes des réactions allergiques, qui ont été découvertes par Ehrlich vers 1877 et elles sont porteuses de récepteurs membranaires RFcε pour les IgE. Les basophiles représentent moins de 1% des leucocytes ou globules blancs du sang. Ils ont une taille d’environ 12 à 14µm. Ces cellules provenant de la lignée granulocytaire ont un noyau polylobé et de grosses granulations (Ponvert et Paupe, 1994). Les mastocytes sont des cellules qui ressemblent aux basophiles mais ils restent localisés exclusivement dans les tissus. Ce sont des cellules dérivées de précurseurs médullaires. Leur taille est variable (15 à 25µm). On distingue deux types de mastocytes :
– les mastocytes muqueux, localisés sur les muqueuses et qui sont thymodépendants.
– les mastocytes conjonctifs, rencontrés dans les tissus conjonctifs et nonthymodépendants.
Les basophiles et les mastocytes sont produits dans la moelle osseuse sous l’influence de diverses cytokines, en particulier de l’interleukine 4(IL-4) et leurs propriétés sont sensiblement différentes. L’agrégation des récepteurs liés aux complexes IgE-allergène sur leurs membranes entraîne la dégranulation avec libération des médiateurs préformés contenus dans les granules tels l’histamine, l’héparine, la chondroïtine sulfate, la protéase, la tryptase. Dès la libération de ces substances, les mastocytes et les basophiles synthétisent d’autres médiateurs qui ont pour but de prolonger l’inflammation et d’accentuer la réponse ; ce sont des substances dites néoformées comme les interleukines IL-1, IL-4, IL-5 et IL-6, les leucotriènes et la prostaglandine PGD2 (Berger et al, 1996 ; Ponvert, 1999). D’après de récentes études, les mastocytes peuvent présenter l’antigène aux lymphocytesT et B (Mecheri et al, 1999) et induire ou entretenir la production des IgE (Pawankar et al, 1997).
Les décongestionnants, les combinaisons décongestionnants et antihistaminiques (universaldrugstore)
Les décongestionnants, tels la Pseudoéphedrine, la Naphazoline, la Xylometazoline réduisent les sécrétions superflues des muqueuses lors des manifestations allergiques. Les décongestionnants et antihistaminiques combinés produisent les deux effets attendus. Ces combinaisons peuvent être : Loratadine/Pseudoéphedrine, Naphazoline/Phéniramine.
Dosage d’histamine après l’action du produit Rp9
La suspension mastocytaire purifiée est partagée en aliquots de 100µl. La moitié des aliquots a été additionnée de 10µl d’HEPES et de 17µl d’antigène ovalbumine (2µg/ml, 10µg/ml, 50µg/ml). Les autres tubes ont par contre été additionnés de 10µl d’extrait de Baseonema acuminata Rp9 (30µg/ml) et aussi de 17µl d’antigène ovalbumine (2µg/ml, 10µg/ml, 50µg/ml). Des aliquots témoins ont été préparés : 100µl de suspension mastocytaire additionnés de 27,5µl d’HEPES. Une autre préparation formée de 100µl de suspension de mastocytes avec 10µl d’extrait de Baseonema acuminata et de17µl d’HEPES est également réalisée parallèlement avec cette procédure. Tous les aliquots sont ensuite incubés à 37°C durant 10 minutes et les conditions de dosage de l’histamine relarguée sont identiques à celles du dosage en présence d’OPTA décrit dans le paragraphe §.B.II.1.
Résultats du dosage des solutions d’histamine
Différentes concentrations de solution d’histamine ont été préalablement dosées avec la méthode fluorimétrique utilisant l’OPTA pour vérifier les concentrations optimales dosables. Pour chaque concentration, un doublon a été dosé. Les résultats donnés par le spectrofluorimètre sont rapportés dans le tableau suivant. La moyenne (X) des valeurs lues pour chaque doublon est calculée. La valeur de la vraie fluorescence mesurée (RFU) est obtenue après soustraction de la fluorescence mesurée du témoin blanc (solution HEPES) à la moyenne trouvée.
DISCUSSION, CONCLUSION, PERSPECTIVES
Cependant abandonné ce test du cromoglycate et avons préféré focaliser notre attention sur la suite de l’étude. Cependant dans la littérature, le cromoglycate freine efficacement la libération d’histamine en stabilisant la membrane des mastocytes en inhibant la pénétration de Ca²+ (Allain, 2004).
– La théophylline est utilisée dans le traitement des crises d’asthme. D’après nos résultats, la théophylline est appropriée au traitement d’appoint des crises d’asthme vu son action inhibitrice de la libération d’histamine. Dans le cas de la dégranulation induite par une réation antigène-anticorps, nous avons testé l’extrait d’une plante Baseonema acuminata. Des tests pharmacologiques in vivo et in vitro (trachée isolée), de l’extrait de cette plante ont déjà été réalisés avec des résultats prouvant l’action inhibitrice d’une bronchoconstriction et d’une contraction de la trachée isolée, induits par une réaction immunologique. La propriété anti-dégranulante a été confirmée par le test que nous avons effectué et précisé un site d’action, au niveau des mastocytes, de cet extrait. En conclusion, le stage nous a permis de mettre en place une méthode de dosage simple et rapide de l’histamine des mastocytes par fluorimètrie. Il faut rappeler que cette méthode ne nécessite pas une extraction au préalable de l’histamine du milieu réactionnnel. Les autres méthodes de dosage existantes comme l’HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), le test immunoenzymatique ELISA… ne sont pas rapides ou ne sont pas encore disponibles à Madagascar. De plus, elles demandent un investissement conséquent en équipement et en ressources humaines. Concernant les perspectives de cette étude : Plusieurs aspects peuvent être envisagés pour exploiter les résultats dans ce travail :
– le dosage de l’histamine par fluorimétrie peut être étendu et appliqué dans diverses domaines de l’industrie agro-alimentaire : fabrication du fromage, élevage et commercialisation du poisson et des crevettes…
– la méthodologie développée dans le cadre de ce travail peut être longuement utilisée en matière de screeening ethnobotanique de plantes anti-allergisantes.
– dans le cas des plantes/extraits à propriété anti-allergique, la possibilité de travailler directement sur les mastocytes permet de préciser le site d’action et d’envisager des études de mécanisme d’action de cette inhibition, si elle est effective, en utilisant différentes substances ayant un pouvoir dégranulant des mastocytes selon des mécanismes avérés et propres à chaque substance.
– l’étude du mode d’action de l’extrait Rp.9 à l’échelle moléculaire mérite d’être entreprise et approfondie dans un avenir proche.
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Table des matières
INTRODUCTION
GENERALITES
L’allergie
I. Les allergènes
II. Le mécanime des réactions allergiques
II.1. Les immunoglobulines E ou IgE
II.2. Les mastocytes et les basophiles
II.3. La phase de sensibilisation
II.4. La réaction allergique
II.5. Les autres types d’hypersensibilité
II.6. Les manifestations allergiques
III. L’histamine
III.1. La synthèse de la molécule d’histamine
III.2. La libération de l’histamine
III.3. L’histamine dans la réaction allergique
III.3.1. Les récepteurs histaminiques
III.4. Métabolisme de l’histamine
IV. Le traitement de l’allergie
IV.1. Les antihistaminiques
IV.2. Les décongestionnants, les combinaisons décongestionnants et antihistaminiques
IV.3. Les stabilisateurs de mastocytes
IV.4. Les bêtamimétiques ou sympathicomimétiques, les corticoïdes, l’adrénaline
IV.5. L’immunothérapie ou la désensibilisation
MATERIELS ET METHODES
A] Matériels
I. Matériel biologique
II. Le spectrofluorimètre
II.1. Définitions
II.2. Phénomène quantique mis en jeu
II.3. Appareillage
III. La cellule de Thoma
IV. Les composés chimiques
IV.1. Le composé 48/80
IV.2. L’ovalbumine
IV.3. L‘ortho-phtaldéhyde
IV.4. Le cromoglycate et la théophylline
B] Méthodes
I. Purification des mastocytes de rat
II. Mise au point de la méthode de dosage des amines primaires
II.1. Dosage d’histamine et des acides aminés de contrôle
II.2. Dégranulation mastocytaire non immunologique
II.3. Dosage de l’histamine recueillie
III. Dosage de l’histamine relarguée après action du cromoglycate et de la théophylline
III.1. Dosage de l’histamine après action du cromoglycate
III.2. Dosage de l’histamine après action de la théophylline
IV. Dosage de l’histamine libérée par les mastocytes sensibilisés
IV.1. Sensibilisation active des rats à l’ovalbumine
IV.2. Dosage de l’histamine libérée par les mastocytes sensibilisés
V. Dosage d’histamine après l’action du produit Rp9
RESULTATS
A] Résultats de la mise au point de la technique de dosage de l’histamine
I. Résultats du dosage d’histamine et des acides aminés de contrôles
I.1. Résultats du dosage des solutions d’histamine
I.2. Résultats du dosage des trois acides aminés de contrôle : L-Gln, LLeu, L-Arg
II. Résultats du dosage de l’histamine après la dégranulation mastocytaire non immunologique par le composé 48/80
B] Résultats du dosage de l’histamine après l’action du cromoglycate et de la théophylline
C] Résultats du dosage de l’histamine libérée par les mastocytes sensibilisés
D] Résultats du dosage de l’histamine après l’action du Rp.
DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
Préparation des réactifs et tampons
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