Dopamine: généralité

Dopamine: généralité

Préparation des coupes de tissus

Les rats sont initialement anesthésiés par inhalation d’isofluorane (Baxter Corp., Toronto,DN, Canada) puis guillotinés dans le but d’extraire leurs cerveaux de telle sorte que ces derniers ne subissent pas de nécrose liée à la mort de l’animal. Le cerveau est rapidement retiré et placé dans un tampon froid pour coupe de liquide céphalo-rachidien artificiel (LCR: NaCl126 mM, KC13.5 mM, NaH2P04 1.2 mM, MgCh 2.3 mM, CaCh 1 mM, NaHC03 25 mM, glucose Il mM et saturée avec 95 % O2/5 % CO2 à un pH de 7.4). Les cerveaux sont ensuite coupés en tranche contenant le striatum de 350 !lm d’épaisseur en utilisant le vibratome (Technical products international Inc., St. Louis, MO, É.-U.). Les coupes, par la suite, sont transférées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (LCR: NaCl126 mM, KC13,5 mM, NaH2P04 1.2 mM, MgCh 1.3 mM, CaCh 2 mM, NaHC03 25 mM, glucose Il mM et saturées avec 95 % O2/5 % CO2) dans lequel elles sont pré-incubées à 32 oC pendant 30 min avant les traitements pharmacologiques. Il faut noter que le second tampon LCR contient une concentration plus physiologique en magnésium et en calcium que le premier. Le premier tampon LCR va ainsi bloquer le canal NMDA, et de pair avec une concentration diminuée en calcium, éviter l’apparition d’excitotoxicitié propre à ce récepteur. De plus, les coupes sont faites à 4 oC aussi pour diminuer l’activité intrinsèque des neurones et éviter l’apparition d’excitotoxicité NMDA. Lors des traitements, le second tampon est utilisé et la température des coupes ramenée à 32 oC.

Traitements pharniacologiques

Selon la situation, voici les principaux agents pharmacologiques utilisés. Lorsque deux traitements sont faits sur les mêmes coupes, le traitement au SKF38393, un agoniste des récepteurs Dl, est toujours à la suite du premier traitement. Notons que nos solutions sont dissoutes dans une solution saline contenant de l’acide ascorbique 0.01 % possédant des propriétés anti-oxydantes.
1. NBQX: Les coupes de cerveaux contenant le striatum sont traitées avec 10 ~M de cet antagoniste des récepteurs AMPA (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, É.-U.) pendant 30 min avant le traitement au SKF38393 et continué jusqu’à la fin du traitement au SKF38393.
2. AP5: Les coupes de cerveaux contenant le striatum sont traitées avec 50 ~M de cet antagoniste des récepteurs NMDA (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, É.-U.) pendant 30 min avant le traitement au SKF38393.
3. NVP-AAM077: Les coupes de cerveaux contenant le striatum sont traitées avec 50 ~M de cet antagoniste des récepteurs NMDA sélectif de la sous-unité NR2A, un présent du Dr Yves Auberson (Novartis Phanna AG, Basel, Switzerland), pendant 60 min avant le traitement au SKF38393 .
4. R025-6981: Les coupes de cerveaux contenant le striatum sont traitées avec 1 JlM de cet antagoniste des récepteurs NMDA sélectifs de la sous-unité NR2B (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, É.-U.) pendant 60 min avant le traitement au SKF38393 .
5. SKF38393 : Les coupes de cerveaux contenant le striatum sont traitées avec 10 JlM de SKF38393 (Sigma-Aldrich, Oak:ville, ON, Canada) pendant 30 min ou 60 min.
Après les traitements phannacologiques, les coupes sont lavées plusieurs fois avec du LCR artificiel constamment saturé avec 95 % 02/5 % C02. Le striatum est alors disséqué du reste du cerveau et les coupes de striatum sont homogénéisées dans un tampon RIPA froid servant à la lyse cellulaire (Tris-HCl 50 mM, NaCI 150 mM, Triton X-100 1 %, sodium deoxycholate 0.25 % et EDTA 1 mM supplémenté à un mélange d’inhibiteurs de phosphatases et de protéases comme leupeptin 10 !lM, phenylmethylsulfonyl fluoride 1 Jlg/ml et N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone 1 Jlg/ml).

Fractionnement au sarkosyl

Les coupes de striatum traitées au SKF38393 ou avec de l’acide ascorbique 0.01 % pour contrôle sont homogénéisées dans un tampon RIPA froid comme décrit ci-haut. L ‘homogénat est alors centrifugé à 20000 x g pendant 20 min à 4 oC et le surnageant obtenu est utilisé comme fraction brute de Tau (homogénats non fractionnés). Ensuite, la fraction brute de Tau est chauffée à 100 oC pendant 5 min, puis centrifugée à 20 000 x g pendant 20 min à température ambiante. Le surnageant obtenu est alors utilisé en tant que fraction soluble de Tau stable à la chaleur. Ensuite, la fraction soluble de Tau stable à la chaleur est traitée avec du sarkosyl (concentration fmale de 1 %) pendant 30 min, à température ambiante, et ultra centrifugée à 100 000 x g pendant 1 h à 4 oC. Le précipité obtenu est utilisé pour la fraction de Tau insoluble au sarkosyl. Les échantillons de fractions solubles et insolubles au sarkosyl sont par la suite solubilisés dans un tampon Tris (SDS 2.3 %, 2-mercaptoethanol 5 %, glycerol 10 %, bromophenol bleu 0.01 % et un mélange d’inhibiteurs de phosphatases et de protéases). La concentration de protéines est déterminée à l’aide du réactif de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, É.-u.) et du spectrophotomètre. Par la suite, la quantité de Tau ainsi que sa phosphorylation sont analysées par la technique de Western blot.

Western blot

La concentration des protéines extraites du striatum est mesurée à l’aide de la méthode Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, É.-U.). L’électrophorèse des protéines est faite sur un gel polyacrylamide 10 % (SDS-PAGE; Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis) en déposant 40 ).tg de protéines par puits de migrations sauf pour la sous-unité NR2B pour laquelle nous avons utilisé 80 ).tg de protéines. Les protéines séparées selon leur poids moléculaire sont par la suite transférées sur une membrane de nitrocellulose. Par la suite, pour éviter un marquage non spécifique des anticorps, le blocage de la membrane est fait en l’incubant dans un tampon phosphate salin de pH 7,4 composé de BSA 5 % (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, É.-U.) et de TBS-Tween durant 1 h à température ambiante. Suite au blocage, les membranes sont incubées dans l’anticorps primaire toute la nuit à 4 oC. Ultérieurement à cette période d’incubation, les membranes subissent trois lavages consécutifs dans une solution de TBS-Tween 0.1 % pour enlever l’excédent d’anticorps primaire libres. Les membranes sont ensuite incubées pendant 2 h à température ambiante dans l’anticorps secondaire approprié couplé à horseradish peroxidase (1 :5000, Thermo scientific). Les deux anticorps, primaire et secondaire, sont dilués dans du BSA 1 % et du TBS-Tween avant leur emploi. La mise en évidence des protéines est fait par chimioluminescence (Epi-chemi CDD camera, UVP) avec le réactif Super Signal West Femto (pierce Chemical Co., Rockford, IL, É.-U.) qui possède une activité peroxydase. Les bandes immunoréactives sont dévoilées et quantitativement analysées par le logiciel Vision Works Image Acquisition et Analysis Softwar (UVP Bioimaging, Upland, CA, É.-u.). L’analyse densitométrique de ces bandes est exprimée en densité optique relative.

Anticorps

Dépendamment de la situation, voici la liste des principaux anticorps utilisés :
A. Anticorps primaire
– Rabbit polyclonal antibody against GAPDH (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA, É.-u.),
– Mouse polyclonal antibody against Tau-5 (1: 500; AbCam, Cambridge, MA, É.-U.),
Rabbit polyclonal antibody against p-Tau 199-202 (1:1000, AbCam, Cambridge, MA, É.-u.),
Rabbit polyclonal antibody against p-Tau 214 (1 : 1000, AbCam, Cambridge, MA, É.-U.),
– Rabbit polyclonal antibody against tyrosine hydroxylase (1: 1000; AbCam, Cambridge, MA, É.-U.).
B. Anticorps secondaire
– Anti-rabbit (1 :5000, Thermo scientific, Ottawa, ON, Canada),
– Anti-mouse (1 :5000, Thermo scientific, Ottawa, ON, Canada).

Partie in vivo

Animaux

Dans le cadre de cette étude, 25 souris mâles C57bV6j âgés entre 10 et 12 semaines ont été achetées de Charles River Laboratories (St-Constant, QC, Canada). Les souris pesaient en moyenne 28 g et étaient logées dans des cages séparément à l’intérieur de chambre à température contrôlée. À leurs arrivées, une période d’acclimatation de 5 jours leur fut accordée avant le début de tests. Elles avaient un libre accès à l’eau et à la nourriture. Par la suite, nous avons formé 5 groupes de 5 souris pour les traitements pharmacologiques.

Traitements

• MPTP
Pour induire une déplétion des neurones dopaminergiques, trois groupes de cinq souris ont subi un traitement chronique de MPTP. Ce traitement consiste à administrer une injection sous-cutanée (s.c) de 30 mg/kg de MPTP par jour pendant 5 jours èonsécutifs . Le MPTP est dilué préalablement avec de la saline 0.9 %. Les 10 souris restantes ont reçu une quantité équivalente de saline (Tableau 2.1).
• L-DOPA
Un temps de repos de 10 jours est accordé aux souris après la dernière injection de MPTP. Par la suite, la L-DOPA 25 mg/kg et 12,5 mglkg de benzerazide est injectée en 5 doses IP, 1 fois tous les 12 h. Les groupes de souris contrôles ont reçu une quantité équivalente de saline.
• Traitement de support
Le MPTP induit une phase d’ intoxication chez l’animal sous forme d’hypothermie, d’altération de la tension artérielle, de tremblement et d’une diminution de l’ appétit qui peut s’avérer mortelle [92, 93]. Ainsi, un traitement de support est donné aux souris afin d’améliorer leurs survies. Voici la liste des principaux traitements de supports durant les jours d’injection de MPTP.
Injection de dextrose-saline 1 ml s.e. 2 fois par jour.
Lampe chauffante (24 degrés) pendant 5 h.
Préparation de nourriture molle.
Lors d’une perte de poids importante, un gavage de nourriture molle ou de Jello ainsi qu’une injection de dextrose-saline 1 ml s.c. supplémentaire sont donnés.

Préparation des tissus

Les souris sont sacrifiées 1 h (n = 20) ou 24 h (n = 5) après leur dernière dose de traitements de saline ou de L-DOPA. Les animaux sont euthanasiés dans des cages saturées en C02 puis sont guillotinés afm de retirer leurs striatum. Le striatum extrait est déposé rapidement sur de la glace sèche dans un tube de type eppendorf. Les striatum sont conservés dans un congélateur à -80 oC jusqu’à l’extraction des protéines. L’extraction des protéines, leurs dosages, leurs préparations et leurs analyses par le Western blot sont semblables à celle des rats (voir section 2.1).

 Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été faites à l’aide du logiciel Graph Pad Prism (version 5.0, Graph Pad Software, San Diego, CA, É.-u.). Les données ont été évaluées par le test d’analyse de la variance (one-way ANOVA) suivie du post test de Newman-Keuls. Les résultats présentés représentent la moyenne des animaux pour chaque traitement ± S.E.M. et le seuil de signification statistique a été fixé à p < 0.05.

Table des matières

CHAPITRE 1 TRODUCTION
1.1 Dopamine: généralité
1.1.1 Rôle central et périphérique
1.1.2 Biosynthèse et métabolisme
1.1.3 Voie de projection dopaminergique centrale et Striatum
1. 2 R e’ cep te urs d opam.me.rglq ues: ge, ne, ral 1·t e ‘
1.2.1 Famille des récepteurs DL
1.2.2 Famille des récepteurs D2
1.2.3 Particularité d’adaptation des récepteurs dopaminergiques: exemple de la maladie de Parkinson
1.3 Signalisation dopaminergique : généralité
1.3.1 Mécanismes connus
1.3.1.1 CREB
1.3.1.2 DARPP-32
1.3 .1.3 Canaux ioniques: NMDA, AMP A, GABA
1.3 .2 Nouveaux développements…
1.3.3 Protéines du cytosquelette
1.4 Rationnelle + hypothèse de recherche
1.4.1 Généralité
1.4.2 Est-ce que la stimulation des récepteurs dopaminergiques altère la phosphorylation de Tau de façon continue et est-ce que cette hyperphosphorylation entraîne la formation d’agrégats?
1.4.3 Quel est le rôle de l’activité des récepteurs glutamatergiques dans la phosphorylation de Tau induite par la stimulation dopaminergique?
1.4.4 Comment les différents niveaux dopaminergiques in vivo affectent la phosphorylation de Tau?
CHAPITRE II  MA TERIEL ET METHODES
2.1 Partie ex vivo.
2.1 .1 Animaux
2.1.2 Préparation des coupes de tissus
2.1.3 Traitements pharmacologiques
2.1.4 Fractionnement au sarkosyl
2.1.5 Western blot
2.1.6 Anticorps
2.2 Partie in vivo
2.2.1 Animaux
2.2.2 Traitements
2.2.3 Préparation des tissus
2.3 Analyses statistiques
CHAPITRE III RESULTATS
3.1 SKF38393 ne modifie pas la quantité de Tau total au niveau du striatum
3.2 Tau sérines 199-202 et sérine 214 sont phosphorylés lorsque les tissus sont traités avec SKF38393
3.3 SKF38393 augmente la quantité de protéine Tau ainsi que sa phosphorylation au niveau sérines 199-202 dans sa fraction insoluble au sarkosyl
3.4 SKF38393 phosphoryle Tau au niveau des sérines 199-202 en utilisant la voie NMDA et plus spécifiquement sa sous-unité NR2A
3.5 Le traitement au MPTP induit une déplétion des neurones dopaminergiques dans la voie nigrostriée chez les v
3.6 L’effet des traitements au MPTP et de la L-DOPA ne modifie pas la quantité de Tau total
3.7 L’hyperstimulation des récepteurs Dl avec des traitements à la L-DOPA augmente les niveaux de p-Tau 199-202 et p-Tau 214 transitoirement
CHAPITRE IV DISCUSSION
4.1 Relation entre le MPTP et les protéines de structure
4.2 La phosphorylation de Tau induite par la dopamine sur les coupes de tissus de rats nécessite l’activation des récepteurs NMDA et plus spécifiquement la sous-unité NR2A
4.3 Altération physico-chimique de la protéine Tau lorsqu’elle est hyperphosphorylée
4.4 La dénervation est essentielle pour induire des changements du cytosquelette
4.5 Effet tonique de la DA sur la phosphorylation de Tau dans les neurones du striatum
CHAPITRE V CONCLUSION
5.1 Implication des altérations des propriétés physicochimiques de Tau et les processus de développement des dyskinésie
REFERENCES BIBLIOGRAPIDQUES

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