DONNEES ANTERIEURES SUR LES ALCALOÏDES DE PEAUX D’AMPHIBIENS

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Méthodes d’études des alcaloïdes d’amphibiens

Extraction d’alcaloïdes totaux

Principe

L’extraction des alcaloïdes est fondée, en règle générale, sur le fait qu’ils existent à l’état de sels ou de combinaisons solubles d’une part, sur leur caractère basique d’autre part. Par conséquent, il en résulte la solubilité différentielle des bases et des sels dans l’eau et dans les solvants en fonction du pH. [39]

Méthode

Les composés organiques avec les alcaloïdes sont extraits par un solvant organique. Le mélange ainsi obtenu est alors agité à plusieurs reprises avec une solution aqueuse acide. Les alcaloïdes se solubilisent sous forme de sels dans la phase aqueuse suivant la réaction : R1R2H °°_ NR1NR2+A +AH R3 R3.

Au cours de cette opération, les impuretés restenten solution dans la phase organique.

Les solutions aqueuses de sels d’alcaloïdes sont al calinisées par une base pour régénérer les alcaloïdes. Les alcaloïdes sont extraits de nouveau par un solvant organique. L’épuisement de la phase aqueuse est poursuivi jusqu’à ce que tous les alcaloïdes soient repassés en phase organique.

Chromatographie sur couches minces (ccm)

C’est une chromatographie d’adsorption solide – liq uide. La phase mobile ou « éluant » constituée soit par un solvant unique, soit par un mélange de solvants, progresse par capillarité le long d’une phase stationnaire dite «adsorbant » solide, finement divisée, fixée au préalable sur une plaque de verre, d’aluminium ou de matière plastique. [40, 41]

Chaque constituant de l’échantillon évolue avec savitesse propre derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend des forces électrostatiques retenant le composant sur l’adsorbant d’une part, de sa solubilité dans la phase mobile d’autre part.

Généralement, les constituants de faible polarité sont élués plus rapidement que les composants polaires.

Le comportement d’un constituant particulier dans un système chromatographique déterminé est défini à l’aide de sa référence frontale notéeR f. Distance parcourue par la substance Rf = Distance parcourue par le front de l’éluant

En pratique, la chromatographie sur couches minces permet :

– l’analyse qualitative d’un mélange ;

– l’identification rapide des constituants d’un mélange.

L’observation de la plaque aux rayonnements ultraviolets, généralement aux longueurs d’onde

l = 254nm et = 365nm, suivie de sa révélation à l’aide d’un réactif approprié aide beaucoup à l’interprétation du chromatogramme obtenu.

Chromatographie en phase gazeuse (cpg)

Les principes décrits pour le type de chromatographie précédent restent valables pour le cas de la cpg. Elle est réservée à des constituants volatiles ou dérivés volatiles de composés relativement peu volatiles. C’est une chromatographie gaz – solide.

C’est ainsi qu’elle est fréquemment utilisée dans ’analyse des composés volatiles. Elle permet, en effet, de bien séparer les différents constituants d’un mélange plus ou moins complexe de ce type, de les identifier (analyse qualitative) et d’en connaître la teneur (analyse quantitative). [39, 42, 43, 44, 45]

Lorsque l’échantillon à analyser est injecté, il subit une vaporisation dans la chambre d’injection. Ses constituants sont ensuite entraînés par le gaz vecteur vers la colonne où se produira la séparation. Ils sont plus ou moins longuement retenus par la phase stationnaire suivant leur masse molaire, leur volatilité et/ou leur degré de polarité(affinité). Cette fixation étant temporaire, au bout d’un certain temps les molécules sont entraînées par la phase mobile.

A la sortie de la colonne se trouve un détecteur relié à un enregistreur. Le passage d’un constituant dans le détecteur entraîne une excitation électronique (courant électrique dans le cas d’un Détecteur par Ionisation de Flamme – FID), se traduisant par un pic au niveau de l’enregistreur, dont l’aire est en corrélation avec la teneur massique du constituant considéré. On obtient pour l’ensemble des constituants un chromatogramme. Le nombre de pics recensés correspondra, en principe, au nombre de constituants présents dans l’échantillon dans le cas où la résolution du chromatogramme est bonne.

Le temps de rétention t est la durée de séjour d’un constituant dans la colonne ; il s’agit d’un R paramètre caractéristique de ce constituant dans une phase stationnaire donnée, pour des conditions opératoires parfaitement définies.

Couplage Chromatographie en Phase Gazeuse/ Spectrométrie de Masse (cpg/sm)

Spectrométrie de masse (sm)

La sm est une technique de détermination de structure. Elle donne accès à la masse moléculaire d’un composé et aux divers fragments isus de l’ion moléculaire, lesquels permettent de remonter à la structure moléculaire initiale. Les réactions de fragmentation se produisent à l’état gazeux. [44, 46, 47, 48, 49]
La base de la sm est la production d’ions positifs à partir d’une molécule neutre, détectés par le rapport m/z où m représente la masse de l’ion et z sa charge, généralement égale à +1. Deux principales techniques les plus utilisées en sm sont succinctement décrites:
En ionisation chimique (ic)
A la place d’un faisceau d’électrons, c’est un gaz réactif ionisé préalablement qui va réagir à son tour sur les molécules de l’échantillon provoquant ainsi l’ionisation de ce dernier. En
général, on utilise comme gaz réactif (en anglaiseactantr gas) le méthane, l’isobutane ou l’ammoniac.

Couplage cpg/sm

La cpg et la sm sont deux méthodes compatibles car on opère, pour toutes deux, en phase gazeuse. Les structures des constituants d’un mélange séparés par la cpg sont analysées individuellement à l’aide de la sm.
Le couplage cpg/sm en ic permet d’obtenir un chromatogramme avec les masses moléculaires. A partir de ce résultat, il est possible de faire une identification préliminaire du constituant. Le couplage cpg/sm en ie fournit des données additionnelles, susceptibles de conduire à la structure : on cherche à élucider celle-ci en se basant sur les différentes fragmentations caractéristiques.[46, 47, 49, 50]

Couplage chromatographie en phase gazeuse/ infrarouge en transformée de Fourier (cpg/irtf)

Spectrophotométrie infrarouge (ir)

Introduction
Dans le cas de l’analyse structurale en chimie organique, le spectre électromagnétique qui intéresse se situe entre 2,5 et 15 , soit en nombre d’ondes entre 4 000cm-1 et 600cm-1 . [47,49] Les molécules absorbent l’énergie de ces radiationset leurs énergies de vibration s’en trouvent modifiées. La représentation graphique du pourcentage d’énergie absorbée en fonction de la fréquence exprimée en nombre d’ondespar centimètre (cm-1) ou de la longueur d’onde exprimée en microns (), constitue le spectre infrarouge.
Le spectrophotomètre ir classique utilise un prisme pour disperser la lumière en fonction du nombre d’ondes. Un faible domaine de fréquence est passé à travers l’échantillon jusqu’au détecteur, lui-même relié à l’enregistreur[47,. 49]

Couplage cpg/irtf

Le spectrophotomètre irtf ne donne pas directement un spectre ir ; en effet il n’est pas équipé de prisme dispersif. Les radiations vont interférer après la traversée de « l’interféromètre ».
L’intensité lumineuse dépend de la position du miro tournant à l’intérieur de ce dernier. Les radiations ir passent ensuite sur l’échantillon et atteignent le détecteur. L’intensité du faisceau obtenu en fonction de la position du miroir est appelée «interférogramme».Le spectre d’énergies est obtenu à partir de l’interférogramme par un procédé mathématique appelé « transformée de Fourier», d’où le nom irtf donné ua diagramme ainsi obtenu. [46] L’avantage du irtf est sa grande sensibilité. En effet, il est généralement de deux à trois fois plus sensible que l’ir classique. Cette grande sensibilité est nécessaire si on souhaite obtenir un faible intervalle de temps.
Selon un processus analogue au couplage cpg/sm, le couplage cpg/irtf permet d’avoir le spectre ir d’un composé d’un mélange sans qu’il soit indispensable de l’isoler au préalable[51]. L’analyse en cpg/irtf devient une nécessité lorsque l’échantillon en disposition est de très faible quantité.
C’est généralement le cas des alcaloïdes lipophilesdes peaux d’amphibiens.

Travaux Personnels

Matériels et méthodes

Collecte et travaux sur terrain

Sites de collecte

D’après les travaux antérieurs sur Mantella, les grenouilles sont localisées dans différentes régions de Madagascar. On a subdivisé le pays en sept régions : Nord, Nord-Est, Centre-Est, Centre, Ouest, Sud-Ouest et Sud-Est. Les sites de collecte d’espèces ont été fixés sur la base des expérimentations « sur terrain » mentionnées.
Afin de pouvoir couvrir ces régions, deux équipes multidisciplinaires ont été mises en place. Le groupe A a été chargé d’effectuer la prospectiondans les régions Nord, Nord-Est et Centre- Est. Le groupe B a réalisé ses investigations dans les régions des Centre, Ouest, Sud-Ouest et Sud-Est.
La première mission correspondant à la période d’hibernation a permis la collecte de seulement deux espèces :
– M. betsileo
– M. haraldmeieri
Au cours de la deuxième mission, période de reproduction, on a pu collecter six espèces :
– M. baroni
– M. bernhardi
– M. betsileo
– M. cowani
– M. expectata
– M. haraldmeieri
Lors de la troisième et dernière mission, de post-eproduction, trois espèces ont pu être collectées :
– M. baroni
– M. betsileo
– M. haraldmeieri
Note
A partir de la deuxième mission, pour chaque site de collecte, on a pu procéder au relevé des divers paramètres physiques : coordonnées géographiques à l’aide d’un GPS, pH de l’eau du ruisseau avoisinant, température, humidité et pluviosité.

Technique de collecte

Les grenouilles ont été capturées à main nue et mises dans un sachet en plastique avec un peu d’herbe humidifiée à l’intérieur.
Dépeçage
Les grenouilles ont été endormies au CHCl et dépecées à l’aide de ciseaux et d’une pince.
Conservation des peaux
Les peaux ont été conservées dans du méthanol puransd un eppendorf, petit tube en plastique à fermeture étanche réservé à cet effet.

Extraction des alcaloïdes totaux

Matériels

. de pesée
La pesée a été effectuée à l’aide d’une balance deprécision SARTORIUS-type 2842 de portée maximale 160g, à 10 -4g près.
. d’extraction
L’extraction d’alcaloïdes totaux a été réalisée ensuivant différentes étapes :
. de trituration
– Pinces
– Ciseaux
– Mortier et pilon en porcelaine
. d’extraction liquide/liquide
– Ampoule à décanter de 60ml
– Eprouvette graduée au 0,5ml près de capacité 100ml
. d’évaporation sous vide
L’évaporation à pression réduite a été effectuée l’aideà d’ un évaporateur rotatif IKA type RV06-ML, muni d’un bain thermostaté de marque IKA type TE2.
. de détermination du pH
Elle a été réalisée à l’aide d’un papier pH universel 1-10 (Merck).
. d’autres matériels de laboratoire
Boîte de pétri, bêcher de 100ml, ballon rodé de 100ml, ballon piriforme de 100ml, pipette graduée de 1ml, baguette de verre.

Résultats et discussions

Sites de collecte et description zoologique succincte de chacune des espèces

Espèces collectées et répartition géographique

Les détails portant sur la méthode de collecte ontdéjà été décrits dans le chapitre « Matériels et Méthodes » à la page 35 et 36.
Les aires de distribution géographique ont été indiquées sur la carte de la page 48.
Dans la présente étude, les collectes ont été effectuées pendant les périodes du cycle biologique des espèces, à savoir :
– la période d’hibernation
– la période de reproduction
– la période de post-reproduction
Six espèces sur 15 du genre Mantella ont fait l’objet du présent travail.
Il s’agit de :
– Mantella baroni Boulenger
– Mantella bernhardi Vences, Glaw, Pereyeras, Böhme and Busse
– Mantella betsileo Grandidier
– Mantella cowani Boulenger
– Mantella expectata Busse and Böhme
– Mantella haraldmeieri Busse
Le nombre total de sites visités s’est élevé dixà.
On a figuré dans le tableau 4 de la page 49 les résultats des diverses collectes.

Données biologiques succinctes des différentes espèces et leur répartition géographique

Les détails sur les données géographiques ont déjàété indiqués dans tableau 4 de la page 49.

Mantella baroni Boulenger 1988

Mantella baroni est de 20-30mm de longueur. La tête, le dos et les flancs sont noirs. Les pattes jusqu’aux flancs sont de couleur jaune verdâtre. Le tibia, les tarse s et les pattes sont de couleur orangée avec des bandes et des marques noires irrégulières ; l’iris est complètement noir ; le ventre, la gorge et les membres sont noirs avec des marques jaune verdâtres. Lors de cette étude, on a pu observer une espèce intermédiaire entreMantella baroni et Mantella cowani.
Les collectes ont été effectuées dans les quatre tessi ci-après :
Amparihimazava-Ampasimpotsy (Antoetra)
Le site se trouve à environ 15 km au Sud d’Antoetra . Ce site abrite deux espèces M. baroni et M. cowani. Il est subdivisé en deux parties ayant deux compositions floristiques très différentes. La première, constituée d’une forêt imairepr (forêt I) le long d’un ruisseau et la seconde, séparée de la première par un ruisseau, est une zone de culture, un tavy (culture sur brûlis). M. cowani et M. baroni sont en microsympatrie. Mais ces deux espèces ont chacune un habitat qui lui est propre. En effet, M. cowani occupe principalement la zone de culture constituée de champs de maïs et de haricots, tandis que M. baroni préfère la lisière de la forêt primaire et le long de ruisseau.
Le site est difficile d’accès aux ramasseurs.
Menavava Rivière (Ranomafana)
Le site se trouve à la limite du Parc National de R anomafana. Il s’agit d’une forêt primaire (forêt I) semi-ouverte avec de la litière de 2 ou cm3 d’épaisseur. La forêt est traversée par un ruisseau à vitesse lente et un tracé linéaire. Tout le long du ruisseau, M. baroni et M. bernhardi vivent ensemble en microsympatrie.
Ainsi, les espèces ont été capturées sous la litière formée de branches d’arbres et de feuilles mortes en décomposition. Parfois, elles se cachent sous les racines des arbres ou dans les colonies d’ Aframomum sp (Zinziberacea).
Forêt Vohiparara ( Ranomafana)
Comme pour le site de Menavava Rivière, il s’agit d’une forêt primaire (forêt I) semi-ouverte avec une litière de 2 à 3cm d’épaisseur. La forêt ste également traversée de petits ruisseaux à vitesse lente, M. baroni se trouve un refuge tout le long de ruisseau.
L’animal peut également se trouver sous les arbres ou les feuilles mortes pourries, ou encore sous les racines des arbres.
Du fait de son accès relativement facile, M. baroni subit une forte pression anthropique.
Korokoto (Andringitra)
On est en présence d’une forêt primaire (forêt I),semi-ouverte avec de la litière de 2 à 3cm d’épaisseur, traversée par un ruisseau.
M. baroni se trouve soit sous cette litière, soit sous les feuilles et bois morts en bordure du ruisseau.

Mantella bernhardi Vences, Glaw, Pereyeras, Böhme et Busse 1994 [8]

M. bernhardi est de 19-22mm de longueur , de coloration dorsale gris foncée qui se prolonge jusqu’à la tête. Une petite surface jaunâtre est observée au niveau de l’insertion des membres. La partie supérieure du fémur est jaune et les tibias et tarses marron-orangés. La partie ventrale est noire avec des taches bleuâtres.
On a effectué les collectes sur deux sites :
Menavava Rivière (cf. M. baroni)
Forêt de « Kirenabe » ( Tolongoina)
Le site se trouve à 18 km de la commune rurale de T olongoina. C’est une parcelle restante de la forêt, dont la strate inférieure est occupée quasi totalement par la végétation d’Aframomum sp ( Zingiberacea).
Dans le voisinage se trouve une vaste plaine de culture de riz. Une zone marécageuse sépare la forêt de cette riziculture. La forêt est de type secondaire (forêt II). Des arbres très espacés de 10 à 20cm de diamètre et de 10 à 15m de hauteur y poussent.
L’habitat du genre Mantella a été très perturbé à cause de la présence de ramasseurs, qui ont collecté ces espèces sur le site de suivi de la population.
M. bernhardi s’abrite sous les feuilles mortes et sous les racines des arbres, mais surtout sous les pieds d’ Aframomum sp (Zingiberacea) en bordure du marécage durant la saison chaude et pluvieuse. Il s’enfouit dans le sol en période hivernale.
Les villageois ont signalé la présence deM. bernhardi dans trois autres parcelles de forêts, chacune située à environ 100m de la forêt de « Kirenabe ».
La végétation rencontrée dans les trois autres sites est similaire à celle décrite ci-dessus étant donné que tous les quatre faisaient partie auparavant de la même forêt primaire, la forte pression anthropique sur celle-ci les a réparti ences 4 parcelles.

Mantella betsileo Grandidier 1872

M. betsileo est de 20-28mm de longueur. Le dos est de couleur jaune orangée en contraste avec les côtés. Le côté supérieur est noir avec destaches bleues sur la gorge et des taches bleues en forme d’anneau semi-circulaire sous la lèvre supérieure. Les pattes sont grises avec des marques brunâtres.
C’est l’espèce la plus abondante du point de vue de la répartition et de la distribution. On peut la rencontrer dans les forêts secondaires sèches de l’Ouest et du Sudde l’Île, dans les forêts secondaires de la région Est, ou même dans les champs de plantations. [51]
On a effectué les collectes sur deux sites :
Kirindy (Morondava)
Ce site, inclus dans la Réserve Spéciale de Kirindy, se trouve à environ 3km du Gîte d’étape. C’ est un lit asséché de la rivière Kirindy, principalement constitué de cailloux et de blocs de rochers. La forêt est de type sèche. La rivière estquasiment à sec pendant la saison sèche, mais on observe quelques points d’eau en certains endroits. Les grenouilles Mantella sont attirées par ces points d’eau. Elles s’abritent sous les rochers humides et les feuilles mortes pourries, qui constituent leurs principaux refuges.
En saison de pluie, les grenouilles migrent jusqu’aux environs du Gîte d’étape de la réserve spéciale de Kirindy.
Note importante : Coccinelle Kirindy
A Kirindy, au cours de la deuxième mission, on a pu collecter une espèce de coccinelle, exactement sur le site de celui de M. betsileo. L’identification de l’espèce est en cours. Figure 30

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela chatpfe.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

INTRODUCTION
1. TRAVAUX BIBLIOGRAPHIQUES ANTERIEURS
1.1. DONNEES ZOOLOGIQUES ANTERIEURES SUR MANTELLA
1.2. DONNEES ANTERIEURES SUR LES ALCALOÏDES DE PEAUX D’AMPHIBIENS
1.2. DONNEES ANTERIEURES SUR LES ALCALOÏDES DE PEAUX D’AMPHIBIENS
1.2.1. Différentes classes d’alcaloïdes lipophiles des amphibiens
Etude stéréochimique
1.2.1.1. Alcaloïdes monocycliques
1.2.1.2. Alcaloïdes bicycliques
1.2.1.3. Alcaloïdes tricycliques
1.2.1.4. Alcaloïdes stéroidiques
1.2.1.5. Alcaloïdes pyridiniques
1.2.1.6. Alcaloïdes indoliques
1.2.2. Méthodes d’études des alcaloïdes d’amphibiens
1.2.2.1. Extraction d’alcaloïdes totaux
1.2.2.2. Chromatographie sur couches minces (ccm)
1.2.2.3. Chromatographie en phase gazeuse (cpg)
1.2.2.4. Couplage Chromatographie en Phase Gazeuse/ Spectrométrie de Masse (cpg/sm)
a. Spectrométrie de masse (sm)
b. Couplage cpg/sm
1.2.2.5. Couplage chromatographie en phase gazeuse/ infrarouge en transformée de
Fourier (cpg/irtf)
a) Spectrophotométrie infrarouge (ir)
b) Couplage cpg/irtf
1.2.2.6. Fragmentations caractéristiques des divers types d’alcaloïdes
1.2.2.6. Fragmentations caractéristiques des divers types d’alcaloïdes Izidines Pyrrolizidines 3,5-disubstituées (3,5-P) Homopumiliotoxines (hPTX)
1.3. TEST D’ACTIVITE BIOLOGIQUE PRELIMINAIRE
2. TRAVAUX PERSONNELS
2.1. MATERIELS ET METHODES
2.1.1. Collecte et travaux sur terrain
2.1.1.1. Sites de collecte
2.1.1.2. Technique de collecte
Méthode de capture
Dépeçage
Conservation des peaux
2.1.2. Extraction des alcaloïdes totaux
2.1.2.1. Matériels
Préparation des solutions
2.1.2.2. Méthode
2.1.3. Techniques analytiques
2.1.3.1. Analyse en ccm
Matériels
Méthode
2.1.3.2. Analyse en cpg
Appareillage
Conditions opératoires
2.1.3.3. Analyse en cpg /sm
Appareillage
Conditions opératoires
2.1.3.4. Analyse en cpg/irtf
Appareillage
Conditions opératoires
2.1.4. Méthodologie « Brine Shrimp » [53, 54]
3. RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1. SITES DE COLLECTE ET DESCRIPTION ZOOLOGIQUE SUCCINCTE DE CHACUNE DES ESPECES
3.1.1. Espèces collectées et répartition géographique
3.1.2. Données biologiques succinctes des différentes espèces et leur répartition géographique
3.1.2.1. Mantella baroni Boulenger 1988 [5, 59]
3.1.2.2. Mantella bernhardi Vences, Glaw, Pereyeras, Böhme et Busse 1994 [8]
3.1.2.3. Mantella betsileo Grandidier 1872 [9]
Note importante : Coccinelle Kirindy
3.1.2.4. Mantella cowani Boulenger 1882 [17]
3.1.2.5. Mantella expectata Busse et Böhme 1992
3.1.2.6. Mantella haraldmeieri Busse 1981
3.1.3. Discussions
3.1.4. Menaces pour les Mantellas
3.1.4.1. Disparition des habitats naturels
3.1.4.2. Collecte sauvage des espèces
3.2. ENQUETE ETHNOBIOLOGIQUE
3.3. EXTRACTION DES ALCALOÏDES TOTAUX
3.3.1. Cas de M. betsileo Kirindy 2ème mission
3.3.2. Résultats des diverses extractions
3.3.3. Discussion relative à l’extraction des alcaloïdes
3.4. ANALYSES CHROMATOGRAPHIQUES
3.4.1. Résultats des analyses en ccm
3.4.1.1. Mantella betsileo Andrehitogna 2ème mission
3.4.1.2. Mantella betsileo Kirindy 2ème mission
3.4.1.3.Coccinelle Kirindy 2ème mission
3.4.1.4. Mantella expectata Isalo 2ème mission
3.4.1.5. Mantella baroni Vohiparara 3ème mission
3.4.1.6. Mantella baroni Andringitra 3ème mission
3.4.1.7. Discussions
3.4.2. Résultats des analyses en cpg sur OV1
3.4.2.1. Mantella betsileo Andrehitogna 2ème mission
3.4.2.2. Mantella betsileo Kirindy 2ème mission
3.4.2.3. Mantella expectata Isalo 2ème mission
3.4.2.4.Mantella baroni Forêt Vohiparara 3ème mission
3.4.2.5 Mantella baroni Korokoto 3ème mission
3.4.3. Corrélation entre les résultats en ccm et cpg sur colonne OV1
3.4.4. Conclusion partielle
3.4.5. Résultats des analyses en cpg/sm
3.4.5.1. Etude comparative des données en cpg/sm-ic et en cpg/sm-ie
3.4.5.2. Résultats des études comparatives effectuées sur M. baroni Korokoto
3.4.5.3. Application à l’analyse des sm-ie des Tricycliques 193L et 277F
Interprétation des fragments des Tri 193L et 277F
Interprétation des fragments des Tri 193L et 277F
3.4.6. Résultats des analyses en cpg/irtf
3.4.6.1. Etude approfondie en irtf 277F
3.4.6.2. Etude de la position de OH dans 277F
3.4.7. Etude particulière des AT de M. betsileo Kirindy et de «coccinelle»
3.4.7.1. Etude sur OV1
M. betsileo Kirindy
Coccinelles
3.4.7.2. Résultats en cpg/sm-ie
Mantella betsileo Kirindy 2ème mission novembre 2003
3.4.7.3. Conclusion : preuve de l’origine de 261C
3.4.7.4.Conclusion partielle
3.5. TEST DE TOXICITE AU « BRINE SHRIMP »
Calcul de ED 50
CONCLUSION
PERSPECTIVE
REFERENCES