Dommages à l’ADN et systèmes de réparation

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Réparation par excision de nucléotides

A la différence du BER, la réparation par excision de nucléotides, appelée NER (Nucleotide Excision Repair), prend en charge la réparation de lésions volumineuses entraînant une distorsion majeure de la double-hélice et affectant un seul des deux brins (Bernstein et al., 2002). Cela inclut par exemple les dimères cyclobutane de pyrimidines, les photoproduits (6-4) engendrés par l’exposition aux UV, ou encore les adduits générés par les agents génotoxiques thérapeutiques tels que le cisplatine ou l’oxyde 4-nitroquinoline. Le NER est constitué de quatre grandes étapes : la reconnaissance des dommages accompagnée d’une activité hélicase, le désenroulement local, l’excision du nucléotide endommagé et enfin la synthèse et ligation (Fousteri and Mullenders, 2008). Cette voie de réparation est divisée en deux sous-voies : le « global-genome » (GG) NER et le « transcription-coupled » (TC) NER (Bernstein et al., 2002). La seconde est spécialisée sur la réparation des lésions situées dans des zones du génome en cours de transcription et bloquant celle-ci, tandis que la première agit sur l’ensemble du génome et plus particulièrement en l’absence de transcription des régions concernées.
La différence entre les deux mécanismes réside dans la première étape, c’est-à-dire l’identification de la lésion, ainsi que l’activité hélicase (Kamileri et al., 2012; Scharer, 2013). Dans le GG-NER, cette étape est réalisée par le complexe constitué des protéines XPC, hHR23B et CETN2, avec parfois l’aide de XPE (DDB1/2) pour la détection des dimères cyclobutane de pyrimidines. Dans la majorité des cas, la lésion est principalement détectée par XPC, via son affinité pour les régions à l’appariement distordu (Petruseva et al., 2014) et hHR23B (ou hHR23A) sert à stabiliser XPC (Kamileri et al., 2012; Scharer, 2013). Dans le TC-NER en revanche, la polymérase bloquée RNAPII reste associée au brin d’ADN endommagé et recrute CSA (complexe contenant notamment DDB1) et CSB (qui est stabilisée par la protéine UVSSA). CSA/B recrutent ensuite HMGN1 et XAB2 (XPA binding protein 2), ainsi que le facteur de transcription TFIIS. La suite du mécanisme de réparation est commune aux deux sous-voies.
Le désenroulement de l’ADN autour de la lésion est réalisé par le facteur de transcription TFIIH, associé dans un complexe contenant XPD/B (protéines dotées respectivement d’une activité 5’->3’ et 3’->5’ hélicase), CAK (qui se dissocie rapidement des autres protéines) et XPG (Bernstein et al., 2002; Kamileri et al., 2012). L’activité ATPase de XPB permet la formation d’une bulle de 27 nucléotides autour de la lésion. XPA, RPA, XPB et XPD stabilisent l’ADN endommagé en vue de son incision. RPA active ensuite XPG et ERCC1-XPF, afin que ceux-ci clivent les extrémités 3’ et 5’ du fragment de 24-32 nucléotides contenant la lésion. Le trou simple-brin ainsi généré est comblé par l’action d’une polymérase (δ, ɛ ou κ), dont l’activité est stimulée et contrôlée par PCNA (protéine ayant été recrutée par RFC/A). La ligation finale est réalisée par le complexe LIG3-XRCC1 ou FEN1-LIG1 (Iyama and Wilson, 2013). Il a été montré que LIG1 et POLɛ n’interviennent que dans le cas de cellules non-quiescentes (Scharer, 2013).

Systèmes de réparation des cassures doubles-brinss

Les cassures doubles-brins peuvent être d’origine exogène ou endogène (Hoeijmakers, 2001). Elles peuvent résulter de l’exposition à des radiations ionisantes, agents génotoxiques chimiques ou encore stress oxydant en général. Mais elles peuvent également être le résultat de processus endogènes comme la réplication de cassures simples-brins ou de bases oxydées non-réparées ou encore des phénomènes de recombinaison destinés à générer de la diversité génétique, comme par exemple dans le cadre de la création d’anticorps ou de gamètes (Iyama and Wilson, 2013), cas particuliers que nous laisserons ici de côté.
La réparation des cassures doubles-brins est répartie en deux voies, en fonction de la phase du cycle cellulaire : la recombinaison homologue appelée HR (Homologous Recombination) et la suture non-homologue nommée NHEJ (Non-Homologous End Joining) (Iyama and Wilson, 2013). Le HR est la voie la plus fidèle. En effet elle intervient majoritairement en phases S et G2 du cycle cellulaire, c’est-à-dire lorsque chaque chromosome est doté de deux chromatides. La réparation d’une des chromatides peut ainsi mettre à profit l’autre chromatide comme modèle et éviter par là-même les erreurs du type insertion ou délétion de nucléotides. Le NHEJ quant à lui intervient plutôt en phase G1 du cycle, phase pendant laquelle les chromosomes ne possèdent qu’une seule chromatide. La réparation ne peut donc pas s’appuyer sur la chromatide sœur, ni même sur le chromosome homologue. En effet ce dernier peut être géographiquement éloigné du premier à l’échelle des complexes de réparation et par ailleurs la copie de celui-ci pourrait engendrer des problèmes d’homozygotie. La réparation doit donc être réalisée sans modèle, ce qui génère intrinsèquement plus d’erreurs. Le NHEJ peut également être mis en place en phases S/G2, mais dans ce cas la voie privilégiée est tout de même généralement plutôt le HR.
Quelle que soit la voie de réparation utilisée, la signalisation de la réparation des cassures doubles-brins passe en grande partie par les kinases de la famille PIKK, à savoir ATM, DNAPKcs-Ku et ATR, ainsi que par PARP1 et PARP2 (Deriano and Roth, 2013). DNA-PKcs-Ku et ATM sont recrutées sur le lieu des cassures, tandis qu’ATR se localise sur les fourches de réplication bloquées. Ces protéines, en plus de contrôler le recrutement des protéines réparatrices, veillent à l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire, afin d’arrêter celui-ci le temps de la réparation ou de déclencher la mort cellulaire en cas de dommages trop importants (Shiloh and Ziv, 2013). Toutefois l’influence d’ATM en particulier ne s’arrête pas là. Elle dénombre en effet parmi ses centaines de substrats des protéines impliquées dans de nombreuses autres fonctions cellulaires, comme l’organisation intracellulaire, chromatinienne, télomérique, etc. En réponse à l’apparition de cassures doubles-brins, ATM est recruté immédiatement au niveau de ces lésions et peut y rester jusqu’à plusieurs heures. Cependant une partie des protéines ATM disponibles demeure dans le nucléoplasme, afin de pouvoir mieux contrôler les réponses cellulaires annexes à la réparation. Par ailleurs, parmi les réponses cellulaires intervenant immédiatement après l’apparition de cassures doubles-brins, on retrouve également des modifications de la chromatine au niveau de ces lésions, sur des distances de l’ordre de la mégabase autour de celle-ci (Amunugama and Fishel, 2012) et en particulier la phosphorylation de l’histone H2AX (qui devient alors γ-H2AX) (Shiloh and Ziv, 2013). Cet événement est d’ailleurs largement utilisé en toxicologie génétique pour la détection par immunofluorescence des cassures doubles-brins (Magdolenova et al., 2014).
Les cassures doubles-brins sont identifiées grâce au complexe MRN, constitué des protéines MRE11, Rad50 et NBS1 (Iyama and Wilson, 2013). MRN recrute ATM sur le lieu de la cassure (grâce en particulier à sa sous-unité NBS1, ainsi qu’à l’action de 53BP1 et BRCA1), ce qui déclenche en retour la phosphorylation de MRN et l’envoi des nombreux signaux décrits ci-dessus (Shiloh and Ziv, 2013). ATM interagit également fortement avec l’histone γ-H2AX, associée à la protéine MDC1. Cette interaction passe notamment par la phosphorylation de γ-H2AX et MDC1 par ATM, qui contribue par une boucle de rétroaction positive à auto-entretenir la formation du complexe protéique entourant la lésion. L’histone H2AX est également phosphorylée par la kinase WSTF sur Y142 et déphosphorylée sur ce même résidu par les phosphatases EYA1/EYA3 (Amunugama and Fishel, 2012). L’interaction MDC1-γH2AX dépend de la déphosphorylation de ce site, qui agit par conséquent comme un interrupteur entre la réparation de la cassure ou le recrutement de facteurs pro-apoptotiques.

Recombinaison homologue

Dans le cadre du HR, bien que MRE11 possède une activité nucléase 3’->5’ intrinsèque (Amunugama and Fishel, 2012), le complexe MRN recrute CtIP, dont le rôle est de débuter la section des extrémités 5’-3’ et de générer les extrémités 3’ nécessaires au croisement des brins des deux chromatides (Iyama and Wilson, 2013). Ce nettoyage est nécessaire particulièrement dans le cas des cassures doubles-brins générées par des agents chimiques génotoxiques ou des radiations ionisantes, car ces facteurs engendrent souvent des extrémités modifiées ou liées à des protéines (Amunugama and Fishel, 2012). La phosphorylation de CtIP par des kinases dépendantes des cyclines semble être à l’origine de la discrimination entre le HR et le NHEJ. CtIP est par ailleurs ubiquitiné par BRCA1 au cours des phases S et G2 du cycle, ce qui favorise sa fixation aux cassures doubles-brins.
La suite du découpage des extrémités 5’-3’ est prise en charge par des exonucléases (EXO1, DNA2, etc.), éventuellement associées à des hélicases (le complexe BLM-TOP3α-RMI1-RMI2, à l’activité 3’->5’ hélicase, agit en association avec DNA2 et permet à la différence d’EXO1 de contourner les barrières nucléosomales) et l’ADN simple-brin qui en découle est stabilisé par la protéine RPA, afin d’empêcher la formation de structures secondaires inhibitrices pour la suite de la réparation (Amunugama and Fishel, 2012; Daley et al., 2013; Iyama and Wilson, 2013). RPA active ensuite ATR via ATRIP, ce qui à l’image de l’activation d’ATM, génère de nombreux signaux, dirigés en particulier vers les points de contrôle du cycle cellulaire (Iyama and Wilson, 2013). BRCA2 remplace ensuite RPA par la recombinase RAD51 (éventuellement associée ou remplacée par DMC1 dans le cas des cellules germinales), qui a pour fonction de permettre la formation de filaments nucléoprotéiques constitués de multiples copies de cette même protéine (Amunugama and Fishel, 2012; Daley et al., 2013). Ces filaments sont appelés « filaments présynaptiques » (Daley et al., 2013). Ils possèdent une structure en hélice droite comprenant environ 18 nucléotides et 6 protomères de recombinase par répétition. Au sein de chaque filament présynaptique, l’ADN est étiré de manière à obtenir un allongement de l’axe de l’hélice d’environ 5,4 Å entre chaque nucléotide adjacent, ce qui augmente le pas de l’hélice de 50% environ par rapport à la forme B classique de l’ADN (Amunugama and Fishel, 2012; Daley et al., 2013).
Au sein des filaments présynaptiques, une molécule d’ATP se lie entre chaque monomère de recombinase (Amunugama and Fishel, 2012). Cette fixation d’ATP permet d’étirer la conformation des filaments, ce qui la rend nécessaire à la recherche d’homologie de séquence et au croisement des brins. Cette recherche d’homologie se traduit par des collisions aléatoires avec le brin sondé jusqu’à l’appariement avec la séquence homologue. Une fois cette recherche achevée, l’alignement obtenu est appelé « complexe synaptique » (Amunugama and Fishel, 2012; Daley et al., 2013). L’invasion de ce complexe par les filaments présynaptiques constitue la « boucle de déplacement » ou « boucle en D ». L’assemblage du complexe synaptique est facilité par l’action de plusieurs facteurs, en particulier RAD51AP1, PALB2 et DMC1. RAD51AP1 et PALB2 possèdent tous deux la capacité de se lier à l’ADN et d’interagir avec le filament présynaptique pour capturer le duplex d’ADN homologue et ainsi former le complexe synaptique. RAD51AP1 agit ainsi en synergie avec PALB2 (via la formation d’un complexe entre ces deux protéines) d’une part et DMC1 d’autre part. L’appariement avec l’ADN homologue est par ailleurs favorisé par l’action de RAD54. Cette ATP hydrolase spécifique de l’ADN double-brin interagit avec RAD51 et DMC1 et est capable de translocation sur l’ADN double-brin, qui a pour effet de désenrouler celui-ci localement, ce qui facilite l’accès des filaments présynaptiques et leur appariement aux brins homologues. Le rôle de RAD54 aboutit également à l’éviction de RAD51 et DMC1, qui peut également être facilitée par HEL308 et RFS-1 pendant la méiose.
A partir de cette étape, le mécanisme du HR se divise en plusieurs sous-voies (Figure 14). Dans le premier cas, appelé SDSA (Synthesis-Dependant Strand Annealing), l’hélicase FANCM dissocie le brin invasif de la boucle en D, ce qui permet d’éviter la formation de crossing overs (définis comme l’échange réciproque de séquences adjacentes (Guirouilh-Barbat et al., 2014)), qui peuvent avoir des conséquences dommageables pour la cellule (translocations chromosomiques, pertes d’hétérozygotie, etc.) (Daley et al., 2013). La deuxième voie possible est nommée dissolution de jonctions doubles de Holliday (dHJ). Elle est médiée par l’hélicase BLM, qui agit de concert avec la topoisomérase TOPO IIIα. RPA, ainsi que le complexe RMI1-RMI2, favorisent cette réaction de dissolution. Cette voie aboutit également à l’évitement du crossing over. La structure ainsi formée est appelée le « dHJ dissolvasome ». Quelle que soit la voie, la réparation finale de la cassure est assurée par des polymérases (POLδ ou POLη) (Amunugama and Fishel, 2012). Enfin si par hasard la réparation échoue, les hélicases BLM ou RECQ5 (stimulée par RPA) sont capables de former un complexe avec RAD51 aboutissant au démantèlement des filaments présynaptiques (Amunugama and Fishel, 2012; Daley et al., 2013). Ce démantèlement est dans ce cas facilité par l’activité ATPase de RAD51.
Enfin dans des cas très particuliers, le HR se résout par « résolution » des dHJ. Celle-ci implique l’action de résolvases comme SLX1-SLX4, MUS81-EME1, etc. et le processus aboutit à un échange génétique entre l’ADN modèle et l’ADN lésé, qu’il s’apparente ou non à un crossing over. Dans ce cas, même s’il y a crossing over, celui-ci n’engendre normalement pas de conséquence délétère, dans la mesure où la recombinaison est effectuée avec la chromatique sœur, dont la séquence est rigoureusement identique à celle de la chromatide lésée (Guirouilh-Barbat et al., 2014).

Single-Strand Annealing (SSA)

Pour finir, il semblerait qu’il existe une dernière voie de réparation des cassures doubles-brins, principalement étudiée chez la levure (Iyama and Wilson, 2013). Cette voie, appelée SSA (Single-Strand Annealing), est parfois classée dans le HR. Néanmoins elle n’implique l’utilisation d’aucun modèle (ni chromatide sœur, ni chromosome homologue). Elle intervient dans le cas de cassures doubles-brins situées entre deux zones à hautes répétitions de séquences, comme par exemple des loci d’ADNr. Le SSA est activé par le recrutement de RPA à l’extrémité 3’ (déjà nettoyée par une nucléase, comme MRE11 par exemple (Karran, 2000)) et par l’interaction du complexe RPA-ADN simple-brin avec l’équivalent de BRCA2. Les séquences complémentaires en amont et en aval de la cassure sont ensuite appariées, générant par la même occasion des queues simple-brin non-appariées, qui sont probablement excisées par le complexe ERCC1-XPF (avec l’aide de MSH2-MSH3 dans certains cas (Karran, 2000)). Les extrémités sont encore nettoyées et rallongées au besoin par des nucléases et des polymérases avant leur ligation. Cette voie de réparation entraîne par conséquent des pertes nucléotidiquesd. etRéparationdoncuncertaindesmésappariementsdegréd’instabilité génomique.
La réparation des mésappariements, appelée MMR (Mismatch Repair) et/ou des boucles d’insertion/suppression (BIS) de nucléotides est un processus essentiel, qui intervient principalement au cours de la réplication de l’ADN (Bak et al., 2014). Lorsque ces erreurs ne sont pas réparées, la fréquence de mutation de la réplication, qui est en temps normal d’environ 1/100 000 à 1/10 000 (Jiricny, 2013), augmente de 2 à 3 ordres de grandeur (Bak et al., 2014). Les polymérases possèdent intrinsèquement la capacité d’exciser le dernier nucléotide inséré en 3’, ce qui constitue un premier niveau de contrôle et de correction, qui permet déjà d’augmenter la fidélité de 2 ordres de grandeur (Jiricny, 2013). Le MMR prend en charge les mésappariements ayant échappé à cette première vérification.
Les mésappariements ou BIS sont repérés par le complexe hétérodimérique MutS (Bak et al., 2014). Celui-ci existe sous deux formes : MutSα (MSH2-6) ou MutSβ (MSH2-3). MutSα se charge des mésappariements d’une seule base et des BIS de 1-2 nucléotides maximum, tandis que MutSβ est spécialisé dans les BIS de plus grande envergure, allant jusqu’à 16 nucléotides (Kunkel and Erie, 2005). Le repérage du mésappariement par MutS induit chez lui un changement conformationnel, lié à un échange ADP-ATP, qui lui permet de coulisser le long de l’ADN. MutS recrute ensuite un autre complexe hétérodimérique appelé MutL. A l’image de MutS, MutL existe sous plusieurs formes : MutLα (MLH1-PMS2), qui est la forme prédominante, MutLβ (MLH1-PMS1), dont la fonction dans le MMR reste inconnue et MutLϒ (MLH1-3), qui intervient principalement dans le cadre de la recombinaison méiotique. Le complexe MutS-MutL est capable de transloquer de manière bidirectionnelle le long de l’ADN à la recherche d’une discontinuité (telle un trou entre fragments d’Okazaki) lui permettant de distinguer le brin nouvellement répliqué du brin matrice. Plusieurs hypothèses circulent concernant le mécanisme précis permettant à MutS-MutL de réaliser cette distinction (Kunkel and Erie, 2005). Une de ces hypothèses, qui semble être la plus probable à l’heure actuelle, est que MutS-MutL coulisse le long de l’ADN jusqu’à rencontrer une unité PCNA ayant été chargée à une extrémité 3’ par RFC (Peña-Diaz and Jiricny, 2012). PCNA étant toujours orienté de la même manière sur l’ADN, son orientation indiquerait l’identité du brin nouvellement formé.
L’étape suivante consiste à dégrader le brin neuf jusqu’au mésappariement et au-delà, afin que celui-ci puisse être à nouveau synthétisé, potentiellement sans erreur. Cette dégradation est prise en charge par l’exonucléase EXO1 (Peña-Diaz and Jiricny, 2012). Cependant EXO1 ne possède qu’une activité exonucléase 5’->3’, incompatible avec une dégradation à partir des extrémités 3’. Ce problème est résolu par la sous-unité PMS2 de MutLα, qui possède une activité endonucléase lui permettant d’inciser le brin à dégrader de part et d’autre du mésappariement. Ainsi EXO1 trouve toujours une extrémité 5’ à laquelle se lier pour effectuer la dégradation. L’action d’EXO1 génère un trou simple-brin se prolongeant d’environ 150 nucléotides après le mésappariement (Peña-Diaz and Jiricny, 2012), lequel est stabilisé par RPA (Bak et al., 2014). L’étape de resynthèse implique ensuite PCNA, POLδ et la ligation est effectuée par LIG1 (Peña-Diaz and Jiricny, 2012).
Certaines études ont montré que le MMR pouvait également être activé en dehors de la phase S du cycle cellulaire (Bak et al., 2014). Dans ce cas, le MMR pourrait profiter du fait que PCNA demeure lié à l’ADN longtemps après sa réplication et conserve son orientation unique indiquant l’identité du brin le plus neuf (Peña-Diaz and Jiricny, 2012). PMS2 serait ainsi encore capable d’inciser le brin mésapparié malgré la disparition des discontinuités liées aux fragments d’Okazaki. Il se pourrait également que le MMR se serve de l’activité du BER ou de la réparation par excision de ribonucléotides (RER) pour distinguer le brin neuf du brin matrice (Peña-Diaz and Jiricny, 2012). En effet ces voies de réparation créent des cassures simples-brins, qui indiqueraient l’identité du brin le plus neuf.

Toxicité pulmonaire des nanoparticules de TiO2

Modèles et méthodes d’étude de la toxicité pulmonaire

La toxicité pulmonaire humaine d’une substance peut s’évaluer de différentes manières. Les études ayant le plus grand pouvoir de preuve sont celles menées chez l’homme : études épidémiologiques d’observation ou d’intervention. En toxicologie environnementale, les études d’intervention chez l’homme sont peu éthiques dans la mesure où elles impliquent d’exposer volontairement des individus à de potentiels produits toxiques. Les études d’observation, qui étudient la santé de personnes exposées aux produits concernés dans leur vie quotidienne ou professionnelle, sont plus acceptables. Cependant l’interprétation des données est alors plus délicate, car les niveaux exacts d’exposition des sujets sont souvent moins bien connus. Une autre approche consiste à utiliser des études expérimentales in vivo sur animaux ou in vitro sur des modèles cellulaires. Pour exposer des animaux à des aérosols, trois méthodes principales existent : l’instillation intra-trachéale, l’exposition intranasale et l’inhalation (Shi et al., 2013). L’instillation intra-trachéale permet de bien contrôler la dose d’aérosol reçue par les zones profondes du tractus respiratoire, car elle contourne la majeure partie des mécanismes de clairance des particules. En revanche le corolaire est qu’elle ne permet pas de modéliser ces mécanismes de clairance, ni de modéliser une éventuelle translocation des particules depuis la cavité nasale vers les nerfs sensoriels et le système nerveux en général. L’exposition intranasale se rapproche plus d’une exposition réelle par inhalation. Cependant de plus en plus de laboratoires utilisent désormais directement l’inhalation, qui constitue la modélisation la plus réaliste.
Ces méthodes d’étude in vivo sur animaux permettent l’étude de la biodistribution des particules inhalées et en particulier leur éventuelle translocation vers d’autres organes. En revanche les règles de bioéthique régissant les études expérimentales sur animaux interdisent le recours systématique à ces modèles, en particulier lorsqu’il s’agit de réaliser des études de criblage de grande ampleur, qui nécessiteraient un nombre d’animaux trop important. Des modèles cellulaires in vitro peuvent alors être utilisés. Ils ne remplacent pas parfaitement les modèles in vivo, dans la mesure où ils ne fournissent pas d’information systémique à l’échelle de l’organisme (biocinétique, etc.). En revanche ils sont particulièrement indiqués lorsqu’il s’agit d’étudier les mécanismes d’impact sur des types cellulaires spécifiques et/ou des études de criblage à haut débit. Leur emploi est enfin bien moins coûteux que l’utilisation d’animaux de laboratoire.
Il existe plusieurs manières d’exposer in vitro des cellules pulmonaires à des (nano)particules (Paur et al., 2011). La méthode classique consiste à immerger les cellules dans du milieu de culture contenant une suspension des particules en question. Cette technique présente l’avantage d’être facile à mettre en place. En revanche les effets biologiques des particules peuvent être modifiés par l’adsorption à leur surface de composants du milieu de culture, ainsi que par l’agglomération fréquente des particules. Par ailleurs ces modèles sont intrinsèquement éloignés de la réalité, dans la mesure où dans l’organisme les cellules épithéliales pulmonaires sont exposées aux aérosols à l’interface air-liquide et non en conditions submergées. De plus en réalité les épithélia sont constitués de plusieurs types cellulaires, ce qui est rarement le cas in vitro. D’où le développement de dispositifs permettant de cultiver des cellules pulmonaires à l’interface air-liquide. Ces derniers sont basés sur des membranes semi-perméables permettant aux cellules d’être exposées à des aérosols au niveau de leur pôle apical et nourries par du milieu de culture liquide au niveau de leur pôle basal. Ces dispositifs constituent actuellement les modèles d’exposition in vitro les plus réalistes. Cependant ils nécessitent de pouvoir disposer d’un générateur d’aérosol et d’une chambre d’incubation adaptée, ce qui n’est pas le cas de la plupart des équipes de recherche. Par ailleurs rares sont les personnes ayant réussi à maintenir des cellules en bon état à l’interface air-liquide pendant plus de quelques heures. En effet au-delà de cette durée on constate une augmentation de la mortalité et un développement anormal des tapis cellulaires (en multicouches), ce qui limite donc l’utilisation de ces modèles à des expositions courtes/aigues, alors que les modèles in vitro classiques immergés sont aussi bien adaptés aux expositions aigues que chroniques. Les deux approches sont donc complémentaires.

Dosimétrie

Dosimétrie lors d’expositions en conditions réelles

D’après les quelques valeurs disponibles dans la littérature, il semblerait que les concentrations en aérosols de TiO2 (toutes tailles de particules confondues) usuellement mesurées en milieu professionnel se situent entre 0,1 – 6 mg/m3 et entre 11 000 – 140 000 particules/cm3 (Figure 22) (Baan, 2007; Fryzek et al., 2003; Gangwal et al., 2011; Garabrant et al., 1987; Hext et al., 2005; Koivisto et al., 2012; Lee et al., 2011). Les concentrations maximales pouvant être atteintes sont estimées à 6-15 mg/m3 environ (Boffetta et al., 2001, 2004; Rode et al., 1981).
Par extrapolation à partir des premières données de toxicité, plusieurs instances réglementaires américaines ont établi des concentrations maximales recommandées en aérosols de TiO2 (Figure 22). Ces valeurs limites sont supérieures aux concentrations usuellement mesurées dans le cas des seuils fixés par l’ACGIH (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) et l’OSHA (Occupational Safety & Health Administration, USA), qui sont respectivement de 10 et 15 mg/m3 pour 8 h de travail/jour, 5 jours/semaine (Shi et al., 2013). En revanche le seuil de 2,4 mg/m3 fixé par le NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health, USA) (NIOSH, 2011) est quant à lui compris dans la gamme de concentrations usuellement mesurées en milieu professionnel.

Dosimétrie dans le cadre des études expérimentales

Comme relevé au paragraphe précédent, rares sont les études mentionnant des valeurs d’exposition humaine aux aérosols de TiO2 nanométrique. D’où la difficulté de définir des seuils d’exposition réalistes pour les études expérimentales in vivo ou in vitro, à laquelle s’ajoute la nécessité de transposer ces valeurs en fonction des modèles et des méthodes expérimentales, ce qui suppose d’effectuer un certain nombre d’hypothèses sur le dépôt des NP dans le tractus respiratoire. Pour cela des modèles informatiques ont été développés (Geiser and Kreyling, 2010). Les premiers algorithmes se sont focalisés sur la modélisation de l’appareil respiratoire et des mécanismes de clairance, dans le but de caractériser les fractions de particules déposées dans les différentes zones de ce tractus. Les principaux modèles ainsi élaborés sont le HRTM (Human Respiratory Tract Model) de l’ICRP (International Commission of Radiological Protection) et le MPPD (Multipath Model of Particle Deposition). Le premier est destiné à la modélisation du tractus respiratoire humain (des hommes, femmes ou enfants) selon différents niveaux d’activité physique et donc différents débits d’air inhalé, tandis que le second permet en plus de modéliser l’appareil respiratoire des rats. Le modèle MPPD est donc particulièrement adapté à la transposition des doses d’exposition in vivo chez les rongeurs en doses d’exposition humaines réalistes et inversement. On note une bonne adéquation entre les prédictions de cet algorithme et les données expérimentales disponibles chez le rat.
Comme mentionné précédemment (Tableau 3), ces modèles nous enseignent que le dépôt de particules dans le tractus respiratoire dépend des mécanismes physiques mis en jeu (sédimentation, impaction ou diffusion), qui eux-mêmes dépendent de la taille des particules inhalées (Geiser and Kreyling, 2010). Lorsque cette taille est comprise entre 5 et 100 nm, la région la plus concernée est la zone alvéolaire, dans laquelle le principal mécanisme de clairance, via les macrophages, est inefficace pour les NP (Figure 24). D’où une rétention importante des nanomatériaux au niveau des alvéoles.

Inflammation

Les revues de la littérature portant sur la toxicité des NP de TiO2 mentionnent toutes le fait que l’inflammation fait partie des principaux effets rapportés (Boland et al., 2014; Chang et al., 2013; Johnston et al., 2009; Landsiedel et al., 2014; Shi et al., 2013; Skocaj et al., 2011). Nous nous focaliserons dans ce paragraphe sur les principales preuves de l’induction de phénomènes inflammatoires dans le cadre de modèles pulmonaires (animaux exposés aux NP de TiO2 par inhalation ou cellules pulmonaires exposées in vitro).
D’une manière générale, les expositions pulmonaires in vivo sur animaux montrent l’apparition de fibroses, emphysèmes et de phénomènes inflammatoires se traduisant par une augmentation du nombre de macrophages (souvent chargés de particules) et de neutrophiles polymorphonucléaires dans les lavages broncho-alvéolaires (Johnston et al., 2009; Landsiedel et al., 2014). Cependant ces effets semblent réversibles et ce parfois dès 2-3 semaines post-exposition, sauf dans le cas des expositions les plus longues (13 semaines – 2 ans) où certains effets persistent encore 1 an après la fin de l’exposition (Landsiedel et al., 2014).
Les NP de TiO2 paraissent induire une plus grande inflammation in vivo que les particules micrométriques et ce aussi bien en conditions aigues que subchroniques (13 semaines à 10-250 mg/m3 de NP de TiO2 dans l’air inhalé) (Landsiedel et al., 2014). Cela peut être dû au fait que les NP possèdent une plus grande surface spécifique, sont bien moins efficacement phagocytées et éliminées par les macrophages alvéolaires que les particules micrométriques (Geiser et al., 2008) et pénètrent ainsi en plus grande proportion dans les cellules épithéliales, dans l’interstitium et la circulation lymphatique (Johnston et al., 2009; Skocaj et al., 2011). Par ailleurs l’anatase semble induire plus d’effets inflammatoires que le rutile (Skocaj et al., 2011). On note enfin des différences de sensibilité aux effets des NP de TiO2 entre les différentes espèces animales, le rat apparaissant plus sensible que les souris, elles-mêmes plus sensibles que les hamsters (Johnston et al., 2009). De nombreuses études in vitro mais également in vivo ont de plus relevé une augmentation de la sécrétion de cytokines inflammatoires comme IL-1α, IL-1β, IL-8, IL-6, TNF-α et M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) (Armand et al., 2013; Johnston et al., 2009; Landsiedel et al., 2014; Shi et al., 2013; Val et al., 2009). Des études in vitro ont montré que les NP de TiO2 pouvaient engendrer la maturation de cellules dendritiques (Boland et al., 2014). Cependant certains travaux rapportent une orientation vers un phénotype Th1, tandis que d’autres mentionnent un phénotype Th2. Enfin de nombreuses études in vivo ou in vitro indiquent des modulations de l’expression de gènes ou de protéines impliqués dans des phénomènes inflammatoires (Halappanavar et al., 2015; Husain et al., 2013; Lamoureux et al., 2010; Li et al., 2013; Park et al., 2009; Skocaj et al., 2011; Thai et al., 2015; Tilton et al., 2014; Tuomela et al., 2013; Ze et al., 2014). Des études sur des animaux exposés une seule fois par instillation intratrachéale à des aérosols de NP de TiO2 (0,1-50 mg/kg) ont en particulier rapporté des modulations de gènes impliqués dans la synthèse de chimiokines, la chimiotaxie des cellules immunitaires et la présentation des antigènes, notamment par le système du complément (Skocaj et al., 2011). Parmi les gènes induits, on note entre autres des gènes associés à la mise en place d’emphysèmes pulmonaires et à l’apoptose des cellules alvéolaires épithéliales.

Stress oxydant

Le stress oxydant fait partie des principaux effets toxiques des NP de TiO2 rapportés dans la littérature (Johnston et al., 2009; Shi et al., 2013; Skocaj et al., 2011). Les revues portant sur le sujet le lient intimement avec les dommages oxydatifs à l’ADN (Kermanizadeh et al., 2014; Petersen and Nelson, 2010; Skocaj et al., 2011). Cependant nous traiterons ici la question de ces dommages dans le paragraphe suivant. De même des études mentionnent un lien entre le stress oxydant généré par les NP de TiO2 et l’initiation de réponses inflammatoires via des cascades de signalisation cellulaires croisées (Johnston et al., 2009; Skocaj et al., 2011). Toutefois ces effets ayant déjà été abordés dans le paragraphe précédent, nous les laisserons ici de côté.
Les preuves du déclenchement d’un stress oxydant par les NP de TiO2 se traduisent principalement par une production accrue d’espèces réactives de l’oxygène (ROS – Reactive Oxygen Species), une diminution des réserves cellulaires en antioxydants (glutathion, etc.), une oxydation des molécules biologiques (peroxydation des lipides en particulier) et le fait que le prétraitement avec des antioxydants diminue l’amplitude de ces effets (Johnston et al., 2009; Kermanizadeh et al., 2014). Ces phénomènes ont été observés dans de nombreux modèles cellulaires in vitro, de cellules épithéliales pulmonaires notamment, mais également après exposition in vivo (pulmonaire ou autre) (Johnston et al., 2009; Shi et al., 2013).
Une des difficultés inhérentes à l’étude du pouvoir oxydant des NP de TiO2 réside dans la maitrise de leur photoactivation (Petersen and Nelson, 2010). En effet lorsque les paires électrons/trous (e-/h+) ne se recombinent pas et diffusent à la surface des particules, plusieurs réactions d’oxydo-réduction peuvent avoir lieu. Les trous h+ chargés positivement peuvent oxyder l’eau ou les ions hydroxyles situés à proximité pour produire des radicaux •OH. Les électrons e- chargés négativement peuvent également réduire le dioxygène pour produire des radicaux O2•-, qui peuvent ensuite se dismuter en H2O2 et diffuser librement dans la cellule. Au contraire les radicaux, qui sont hautement réactifs, ont une durée de vie faible et sont ainsi moins susceptibles de se déplacer sur de longues distances sans réagir avec d’autres molécules. Or H2O2 est un précurseur du cycle réactionnel de Haber-Weiss, qui utilise les ions cellulaires Cu+ et Fe2+ pour catalyser la production de radicaux •OH, via la réaction de Fenton. Par ailleurs les e- ou O2•- peuvent réduire les ions Cu2+ en Cu+, qui peuvent réagir avec H2O2 ou •OH pour produire des peroxydes de cuivre. Eux-mêmes peuvent à l’image de H2O2 diffuser à travers les membranes cellulaires et attaquer diverses cibles moléculaires et l’ADN en particulier. Il a également été montré que le TiO2 pouvait générer des radicaux CO2•-, qui comme les e- de surface peuvent réagir avec le dioxygène pour produire d’autres radicaux O2•- et ainsi alimenter de plus belle les cycles d’oxydo-réduction.
Il semblerait que le rutile conduise principalement à la génération de •OH, tandis que l’anatase produirait plutôt des espèces O2•-, H2O2 et radicaux peroxyles (Petersen and Nelson, 2010). Par ailleurs de nombreuses études ont confirmé que l’anatase possédait un pouvoir photocatalytique et donc oxydant supérieur à celui du rutile (Johnston et al., 2009; Skocaj et al., 2011). Cette plus grande réactivité de l’anatase pourrait être due à une énergie d’activation supérieure et une mobilité plus élevée des porteurs de charges (Skocaj et al., 2011).
Les études in vitro ont montré que les NP de TiO2 étaient capables d’induire un stress oxydant significatif aussi bien en présence qu’en l’absence d’irradiation aux UV ou à la lumière naturelle (Petersen and Nelson, 2010; Skocaj et al., 2011). Cependant des études sur des cellules hépatiques humaines ou des cellules séminales de truites ont permis d’observer que l’effet de l’irradiation semblait masquer celui de la taille des particules et de leur cristallinité (Petersen and Nelson, 2010; Skocaj et al., 2011). En l’absence d’irradiation, ce qui parait être la situation la plus réaliste dans le cadre d’un modèle d’exposition pulmonaire, on constate (sur des macrophages ou des cellules hépatiques) un effet prédominant des particules les plus petites (possédant donc les surfaces spécifiques les plus élevées) (Johnston et al., 2009; Skocaj et al., 2011). Par ailleurs le stress oxydant induit semble être proportionnel à la dose de NP de TiO2 appliquée (Johnston et al., 2009).
Une étude a observé que la production accrue de ROS dans les cellules exposées s’accompagnait d’une diminution de l’activité d’enzymes antioxydantes comme la catalase dans des cellules alvéolaires pulmonaires A549, ainsi que de la baisse des réserves cellulaires de glutathion réduit (GSH) (Srivastava et al., 2013). Cependant une autre étude ayant utilisé le même modèle cellulaire rapporte très peu d’effets sur les taux de glutathion (réduits ou totaux) et aucune altération de l’activité de la glutathion réductase (GR) ni de la glutathion peroxydase (GPx), alors même que la production de ROS est quant à elle significativement augmentée (Jugan et al., 2012). Ces divergences de résultats peuvent être dues à des différences expérimentales, comme par exemple l’utilisation de sérum dans le milieu d’exposition de la première étude et son absence dans la seconde.
Des études ont également montré que les NP de TiO2 pouvaient induire un stress nitreux avec la production de NO dans les cellules exposées (Kermanizadeh et al., 2014) et la nitration de protéines (pouvant être contrecarrée par l’ajout d’antioxydants dans le milieu) (Johnston et al., 2009).
Enfin de nombreux travaux rapportent que les NP de TiO2 induisent une modulation de l’expression de gènes et de protéines impliqués dans la réponse antioxydante et ce aussi bien après des expositions in vitro que in vivo, dans des modèles d’exposition pulmonaires (Ge et al., 2011; Li et al., 2013; Shi et al., 2013; Thai et al., 2015; Ze et al., 2014) ou autres (Gui et al., 2013a; Sheng et al., 2014; Shi et al., 2013). Plusieurs études en particulier relèvent un impact sur la voie de signalisation contrôlée par NRF2, un important régulateur de la réponse cellulaire antioxydante (Ge et al., 2011; Shi et al., 2013).

Génotoxicité

La génotoxicité, prélude d’une potentielle carcinogenèse, est sans doute l’effet toxique des nanomatériaux le plus étudié à l’heure actuelle, mais c’est également un des plus controversés (Golbamaki Bakhtyari et al., 2015; Magdolenova et al., 2014). Dans le cas des NP de TiO2, tous modèles d’exposition confondus, le nombre d’études rapportant des effets positifs dépasse celui des études rapportant des effets négatifs (i.e. absence de génotoxicité), qui reste cependant non-négligeable (Chen et al., 2014a; Golbamaki Bakhtyari et al., 2015; Shi et al., 2013). En outre d’une manière générale les études in vitro génèrent plus de résultats de génotoxicité positifs que les études in vivo, ce qui révèle peut-être un biais dans les méthodes d’étude (Chen et al., 2014a). Les résultats de génotoxicité et de mutagénicité obtenus à la suite d’expositions in vitro ou in vivo sur des modèles pulmonaires sont ici répertoriés. L’étude a été restreinte aux NP de TiO2 pures non-irradiées. On dénombre 21 études in vitro (Tableau 13) et 6 études in vivo (Tableau 14). La majorité d’entre elles rapporte des cassures à l’ADN, cependant rares sont les études ayant caractérisé de manière précise la nature de ces cassures (simple/double-brin ou sites alkali-labiles). Sur les trois études in vitro ayant recherché la présence de cassures doubles-brins, on relève 2 résultats positifs (Kansara et al., 2014; Toyooka et al., 2012) et 1 négatif (Jugan et al., 2012). Parmi les travaux ayant étudié la présence de lésions oxydatives (hors cassures), on dénombre 8 résultats positifs (Bhattacharya et al., 2009; Cowie et al., 2015; Gurr et al., 2005; Jugan et al., 2012; Kansara et al., 2014; Numano et al., 2014; Ursini et al., 2014; Zhang et al., 1998) et 4 négatifs (Karlsson et al., 2008, 2009; Rehn et al., 2003; Vales et al., 2014). Cette présence de lésions oxydatives rejoint le fait qu’un grand nombre d’études parmi celles examinées ici rapportent également une induction de ROS (7 résultats positifs (Bhattacharya et al., 2009; Gurr et al., 2005; Hamzeh and Sunahara, 2013; Jugan et al., 2012; Kansara et al., 2014; Srivastava et al., 2013; Toyooka et al., 2012) contre 2 négatifs (Vales et al., 2014; Wan et al., 2012)), ce qui suggère le rôle du stress oxydant dans l’apparition des dommages à l’ADN. 5 études (dont 4 in vivo) ont en outre relevé des effets de type inflammatoire (Driscoll et al., 1997; Lindberg et al., 2012; Naya et al., 2012; Numano et al., 2014; Ursini et al., 2014), seule une étude (in vivo) rapporte leur absence (Rehn et al., 2003). En ce qui concerne les dommages chromosomiques, 7 études en observent (Falck et al., 2009; Gurr et al., 2005; Lan et al., 2014; Prasad et al., 2013; Srivastava et al., 2011, 2013; Wang et al., 2015a) et 3 n’en observent pas (Jugan et al., 2012; Lindberg et al., 2012; Prasad et al., 2014). Enfin seules 2 équipes ont étudié et rapporté des preuves de mutagénicité (Chen et al., 2014b; Driscoll et al., 1997).

Table des matières

Introduction générale :
Etat de l’art :
I. Les nanomatériaux
A. Définitions, origine et applications
B. Propriétés physico-chimiques des nanoparticules
C. Le dioxyde de titane (TiO2)
II. Le tractus respiratoire humain
A. Structure générale du tractus respiratoire humain
B. Mécanismes de clairance
C. L’épithélium alvéolaire
III. De l’ADN aux protéines
A. Expression des gènes et production des protéines
B. Régulation de l’expression génique
C. Régulation de l’activité des protéines par phosphorylation
D. Dégradation des protéines
IV. Dommages à l’ADN et systèmes de réparation
A. Des agents génotoxiques aux lésions de l’ADN
B. Réponses aux dommages à l’ADN et systèmes de réparation
V. Toxicité pulmonaire des nanoparticules de TiO2
A. Modèles et méthodes d’étude de la toxicité pulmonaire
B. Dosimétrie
C. Etudes épidémiologiques
D. Effets toxiques et mécanismes
E. Biodistribution et translocation vers d’autres organes
F. Conclusion sur les mécanismes de toxicité et lien avec la couronne protéique
Objectif, hypothèses et stratégie :
Matériels et méthodes :
I. Dispersion par sonication et caractérisation des suspensions de nanoparticules par DLS
A. Dispersion par sonication
B. Mesure du diamètre hydrodynamique par DLS
II. Modèles cellulaires, culture et exposition des cellules aux nanoparticules
A. Modèles cellulaires
B. Culture et exposition des cellules aux nanoparticules
III. Etude de l’expression des gènes par RT-qPCR
A. Principe de la méthode
B. Détails expérimentaux
IV. Etude de l’expression des protéines par Western-Blot
A. Principe de la méthode
B. Détails expérimentaux
V. Etude du profil de méthylation des promoteurs des gènes
VI. Etude de l’activité du protéasome
VII. Etude du phosphoprotéome
A. Stratégie expérimentale globale
B. Traitement des échantillons pour l’analyse phosphoprotéomique
C. Traitement des données de l’analyse phosphoprotéomique
D. Etude du niveau de phosphorylation global par des techniques de coloration en gel
VIII. Etude du cycle cellulaire
IX. Etude de la prolifération cellulaire
A. Principe de la méthode
B. Détails expérimentaux
X. Test de cytotoxicité (MTT)
A. Principe de la méthode
B. Détails expérimentaux
XI. Tests de génotoxicité
A. Test des comètes alcalines
B. Quantification des lésions 8oxodG par LC-MS/MS
XII. Statistiques
Résultats :
Article 1: TiO2 nanoparticles globally down-regulate the expression of DNA repair genes and
proteins in A549 cells
Keywords:
Abstract:
Introduction:
Methods:
Results:
Discussion:
Conclusion:
Acknowledgments:
Declaration of interest:
References:
Supplementary materials:
Supplementary methods:
Supplementary references:
Discussion complémentaire à l’article 1
Article 2: TiO2 nanoparticles alter the cellular phosphoproteome in A549 cells
Abstract:
Introduction:
Results:
Discussion:
Experimental:
Conclusions:
Acknowledgements:
References:
Supplementary information:
Résultats complémentaires à l’article 2
A. Analyse phosphoprotéomique descriptive et comparaison des résultats d’ontologie protéique obtenus avec différents logiciels et plateformes
B. Confirmation de l’absence de modification du niveau de phosphorylation global des protéines après exposition aux NP de TiO2
C. La quantité de protéines intracellulaires évolue inversement à leur niveau de phosphorylation
D. La prolifération cellulaire n’est pas modifiée après exposition aux NP de TiO2
Discussion complémentaire à l’article 2
Conclusion sur les résultats complémentaires à l’article 2
Article 3: TiO2 nanoparticles induce genotoxicity and down-regulate DNA repair genes in bronchial BEAS-2B cells
Keywords:
Abstract:
Introduction:
Methods:
Results:
Discussion and conclusion:
Acknowledgments:
Declaration of interest:
References:

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