Soutenance mémoire
Historique de la découverte des salmonelles
Le bacille connu sous le nom de Salmonella a été décrit pour la première fois en 1879 par l’allemand Karl Joseph Eberth dans la rate et les ganglions lymphatiques de patients atteints de la fièvre typhoïde (Marineli et al., 2013). En 1884 le bacille responsable du choléra porcin est isolé, depuis l’intestin d’un cochon mort, par Théobald Smith, assistant de recherche sous la supervision de Daniel E Salmon, vétérinaire responsable des recherches de l’USDA aux Etats Unis. Le bactériologiste français Liengières donne le nom au genre « Salmonella » en hommage à Daniel E. Salmon en 1900 (Evangelopoulou et al., 2018). En 1934, a lieu le premier comité de nomenclature de Salmonella dirigé par le danois F. Kauffman qui fixe les première tentatives de nomenclature pour ce pathogène (Evangelopoulou et al., 2018). A l’origine les salmonelles sont différenciées par la pathologie dont elles sont la cause, expliquant la distinction entre les salmonelles typhoïdiques et les salmonelles non-typhoïdiques, distinction encore utilisée de nos jours (Kirk et al., 2015; Evangelopoulou et al., 2018).
Transmission et facteur de risques
Les Salmonella sont des agents pathogènes intestinaux capables de survivre dans l’eau et le sol pendant plusieurs mois à la suite d’une contamination fécale (Andino and Hanning, 2015). Leur résistance à des conditions environnementales extrêmes et leurs faibles besoins nutritifs expliquent leur caractère ubiquitaire (D’Aoust, 1994). La grande majorité (95 %) des infections à Salmonella chez l’humain sont dues à la consommation d’aliments contaminés, tels que la viande, les œufs, le lait ou les produits de la mer (Foley and Lynne, 2008), mais de nombreux exemples démontrent la capacité de Salmonella à :
– survivre et croître dans les plantes et les produits végétaux (Brandl, 2006) ;
– contaminer l’humain par la consommation d’eau contaminée (Palmera-Suarez et al., 2007) ;
– infecter l’humain par contact avec des animaux porteurs de la bactérie (Swanson et al., 2007; Harris et al., 2009).
Les cas de contamination interhumaine sont un facteur de risque important (D’Aoust, 1991) ; certaines Salmonella pouvant rester présentes chez un hôte humain plus d’un an après la contamination initiale. Le cas le plus célèbre étant celui de Marie Malone une cuisinière new yorkaise, première porteuse saine de Salmonella Typhi identifiée, soupçonnée d’avoir provoqué des centaines de cas de fièvre typhoïde à New York, qui a dû être placée en quarantaine toute la fin de sa vie (Marineli et al., 2013).
Fièvre typhoïde
La fièvre typhoïde est causée par un nombre limité de serovars (S. Typhi, Paratyphi A, B et C et Sendai) hautement adaptés à l’humain. La divergence de Salmonella Typhi vis-à-vis de S. Typhimurium est estimée avoir eu lieu il y a 15 000 à 150 000 ans, soit après l’apparition de l’homme moderne et sa diversification d’avec les autres hominidés (Kidgell et al., 2002). Ces sérovars sont exclusivement adaptés à l’humain et la transmission est assurée essentiellement par des contacts avec des malades ou des porteurs chroniques et par la consommation d’eau ou d’aliments contaminés par les fèces de personnes infectées. Présente dès l’Antiquité, la fièvre typhoïde est une maladie endémique pendant tout le Moyen Age. Très présente en Amérique du nord au 19éme siècle, la fièvre typhoïde est connue pour avoir provoqué plus de 80 000 cas durant la guerre de sécession américaine causant plus de 27 000 morts (Bollet, 2002; Reilly, 2016). Elle ne reculera qu’avec l’apparition des mesures sanitaires modernes notamment la chloration de l’eau et la vaccination dès 1911 (Crump and Mintz, 2010). De nos jours, on recense 21 millions de cas de fièvre typhoïde par an causant plus de 220 000 décès (CDC, 2016). Il s’agit d’une maladie endémique en Asie, en Afrique et en Amérique du Sud (Pasteur I, 2012) touchant principalement les zones à forte densité de population où la fièvre typhoïde cause des épidémies de grande ampleur (Crump and Mintz, 2010). La plupart des cas reportés dans les pays riches sont associés à des voyages dans des régions du monde où la fièvre typhoïde est très présente.
Sécurité des aliments et Salmonella
Les Salmonelles ubiquistes sont universellement répandues et peuvent induire un portage asymptomatique dans le tube digestif des animaux. Le portage sain de Salmonella dans le système digestif des animaux peut donc être considéré comme fréquent chez le porc et la volaille ce qui rend leur détection ardue au niveau des élevages et des abattoirs (Denis et al.,2013). Des symptômes proches de ceux reportés chez l’humain sont retrouvés chez le bovin après une infection à Salmonella (Millemann, 2008). La capacité de survie de la bactérie dans des environnements divers pose de sérieux problèmes pour contrôler les infections alimentaires liées à Salmonella. Pour limiter la prévalence de Salmonella dans les aliments il est nécessaire d’identifier les principales sources de contamination par cet agent pathogène via l’alimentation : c’est l’objet des études de source-attribution qui visent à établir la source d’origine des TIACs. De nombreuses études ont cherché à évaluer le poids des différentes filières alimentaires dans le nombre total de cas cliniques humains provoquées par Salmonella. Le tableau 3 résume l’attribution des cas de salmonellose humaine dans le monde (Pires et al., 2014)
Structure du dispositif français pour la surveillance de Salmonella isolée de la chaîne agro-alimentaire
Le système de surveillance français actuel est basé sur un système national dont les fondements remontent à 1947 pour les cas humains et à la fin des années 80 pour les réservoirs animaux principaux. Ce système a évolué sous l’effet combiné de la réglementation européenne et des évolutions des niveaux de prévalence des salmonelles observées dans les différentes sources. La réglementation européenne constitue un support majeur pour la construction d’un système de surveillance institutionnel harmonisé au niveau élevage et facilite l’intégration des données recueillies tout au long de la chaîne agro-alimentaire (David et al., 2011). La surveillance française pour les cas humains est assurée par le Centre National de Référence des Salmonelles (CNR-salm), de l’Institut Pasteur de Paris. Le CNR-salm analyse les souches envoyées par des laboratoires d’analyses de biologie médicale et des laboratoires hospitaliers et il collecte les informations sur les souches dont le sérovar a déjà été déterminé par ces laboratoires. Ces données permettent de suivre l’évolution du nombre de souches de Salmonella isolées chez l’homme, et de détecter des cas groupés. Santé publique France (SpF) anciennement nommé Institut de veille sanitaire (InVS) centralise les déclarations obligatoires des TIAC notifiées aux autorités sanitaires départementales, les DDPP (Direction départementale de la protection des populations), ainsi qu’aux Agences Régionales de Santé (ARS). Le Laboratoire de Référence des Salmonelles et des salmonelloses aviaires de l’ANSES à Ploufragan/Plouzané assure la collecte et les analyses des souches de Salmonella issues des filières règlementées (volaille). Dans le cadre de sa mission, il fournit un appui scientifique et technique pour les filières professionnelles et le monde vétérinaire (analyse de prélèvements, fourniture de réactifs de référence, suivi de la qualité des analyses des laboratoires de diagnostic…). Ces deux systèmes constituent les acteurs de la surveillance active. Cependant, l’existence concomitante de réseaux de surveillance passifs dans les domaines agro-alimentaires et vétérinaires permet d’obtenir des informations complémentaires sur des secteurs ou points de recueil de données non couverts par la surveillance institutionnelle (dite active). Le Réseau Salmonella, géré par le Laboratoire de Santé des Aliment de l’ANSES de MaisonsAlfort, assure une surveillance dite passive (événementielle) très utile pour la détection d’événements émergents ou inhabituels et pour les alertes précoces de foyers épidémiques. Le Réseau Salmonella collecte et analyse les souches de Salmonella issues des réservoirs animaux règlementés ou non (porc, volaille autre que Gallus gallus et Meleagris gallipavo, bovin, caprin, équin, reptilien, etc…). Il est constitué de 150 laboratoires répartis sur l’ensemble du territoire national qui ciblent la surveillance des salmonelles d’origine non humaine. Le réseau Salmonelle offre aux laboratoires des prestations de typage pour la détermination et la confirmation des différents sérovars. Le réseau est composé de laboratoires vétérinaires, privés et publics, qui adressent sur la base du volontariat au Laboratoire de sécurité des aliments, soit leurs souches de salmonelles pour caractérisation, soit les récapitulatifs de leurs propres résultats de caractérisation par sérotypage. Le Réseau Salmonella, collecte et centralise donc les informations épidémiologiques (date d’isolement, filière, matrice, contexte d’isolement, etc…) sur environ 12 000 isolats de Salmonella chaque année. Ce réseau produit donc des séries temporelles de cas ou de nombres de souches permettant d’évaluer l’impact des interventions et fournit un appui aux services de SpF pour la recherche des origines de TIAC. La qualité et la représentativité des données de surveillance active en font des éléments-clés pour appliquer des outils d’analyse de risque comme l’analyse quantitative de risque ou l’attribution des sources. Ainsi, malgré la dispersion des données entre différents acteurs, le système se révèle efficace et apte à remplir ses objectifs de santé publique. A part le Réseau Salmonella, s’ajoute le réseau de l’observatoire épidémiologique pour l’élevage des volailles -créé et géré par le laboratoire ANSES de Ploufragan- (David et al., 2011) et le réseau français pour la surveillance de la résistance aux antibiotiques chez les agents pathogènes vétérinaires gérés par le laboratoire ANSES de Lyon (David et al., 2011).
CRISPR
La méthode CRISPR se base sur la détection des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (en anglais : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Ces régions du génome des Archées et de la plupart des bactéries consistent en des séquences courtes répétées de 24 à 47 pb encadrant des séquences d’espacement plus communément appelées « spacers » de taille similaire (21 à 72 pb). Ces « spacers » correspondent à des séquences d’ADN phagique étranger à la cellule. Ces loci CRISPR sont souvent adjacents à des gènes cas codant pour les CRISPR associated protein : des protéines impliquées dans la reconnaissance et la destruction d’ADN étranger à la cellule (van der Oost et al., 2014). Il a été démontré que les loci CRISPR jouent un rôle dans la protection des bactéries contre les phages, leur conférant un système de reconnaissance de séquences spécifiques du génome de phages précédemment rencontrées par la bactérie (Barrangou et al., 2007; Shariat and Dudley, 2014). Chez Salmonella deux loci CRISPR sont présents chez l’ensemble des souches (figure 9) de Salmonella enterica et bongori. Des études ont démontré un lien entre le polymorphisme des spacers CRISPR et le sérovar ou le profil MLST d’une souche de Salmonella (Weill. et al., 2007; Liu et al., 2011; Fabre et al., 2012). Les micro-variations dans le contenu des spacers permet de sous-typer les souches appartennant au même sérovar (Fabre et al., 2012).
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Table des matières
REMERCIEMENTS
ABREVIATIONS
INTRODUCTION
1 DU PORTAGE SAIN A LA FIEVRE TYPHOÏDE : SALMONELLA, UNE ENTEROBACTERIE UBIQUITAIRE
1.1 Description et nomenclature de Salmonella
1.1.1 Historique de la découverte des salmonelles
1.1.2 Nomenclature
Figure 1 Taxonomie des espèces et sous espèces de Salmonella. (MacKenzie et al., 2017)
1.1.3 Caractéristiques biochimiques
Tableau 1. Caractéristiques métaboliques de Salmonella
Tableau 2 : caractéristiques biochimiques des différentes espèces et sous-espèces du genre Salmonella (Grimont and Weill, 2007)
1.2 Epidémiologie de Salmonella – problématique de sécurité des aliments
Figure 2 : Mécanisme d’invasion cellulaire de Salmonella enterica (Winter and Baumler, 2011)
1.2.1 Transmission et facteur de risques
1.2.2 Fièvre typhoïde
Figure 3. Mécanisme d’infection de Salmonella Typhi (Kaur and Jain, 2012)
1.2.3 Salmonella non typhiques (SNT)
Figure 4. Nombre de cas confirmés reportés et taux de notification des zoonoses humaines dans l’Union Européenne en 2016 (EFSA, 2017)
1.2.4 Résistances aux antibiotiques
1.2.5 Sécurité des aliments et Salmonella
Tableau 3 : Tableau résumant les études de « source-attribution » des infections à Salmonella dans le monde (Pires et al., 2014)
1.2.6 Structure du dispositif français pour la surveillance de Salmonella isolée de la chaîne agro-alimentaire
1.3 Méthode de caractérisation – problématique de source-attribution
1.3.1 Sérotypage
1.3.2 Electrophorèse sur gel à champs pulsé – PFGE
1.3.3 Analyse Multi-Locus des Variants en tandem – MLVA
1.3.4 Typage de Séquence Multi-Locus – MLST
1.3.5 CRISPR
Figure 9 : Structure des locus CRISPR/cas chez Salmonella (Shariat and Dudley, 2014)
1.3.6 Séquençage du génome complet – WGS (Whole Genome Sequencing)
Figure 10 : Principe du séquençage Illumina (Brown, 2016)
1.4 Les facteurs moléculaires permettant l’infection entérique et systémique par Salmonella
1.4.1 Colonisation de la lumière intestinale
Figure 11 : Stratégies employées par Salmonella pour entrer en compétition avec le microbiote intestinal (Khan, 2014)
Figure 12 : Principaux effecteurs du T3SS-1 de Salmonella impliqués dans l’induction de l’inflammation chez l’hôte (Ramos-Morales, 2012)
Figure 13 : Activation et interaction des systèmes de régulation à deux composants PhoQP et PmrAB (Gunn, 2008)
Figure 14 : Représentation du T6SS encodé par le SPI-6 (Sana et al., 2016)
1.4.2 Adhésion cellulaire
Figure 15 : Organisation génétique des opérons et des gènes susceptibles d’encoder pour des adhésines chez S. Typhimurium (Hansmeier et al., 2017)
1.4.2.1 Fimbriae
Figure 16 : Structure des fimbriae de type 1 (anonymous, 2018)
1.4.2.2 Facteurs d’adhésion non fimbriale
1.4.3 Invasion cellulaire
1.4.3.1 Rôle du SPI-1
Figure 17. Détail des gènes portés par le SPI-1 et de leurs fonctions (Kosarewicz et al., 2012)
Figure 18. Structure et mécanisme d’action du T3SS-1 (Costa et al., 2015)
Figure 19 : Mécanisme d’invasion cellulaire provoqué par le SPI-1 (Srikanth et al., 2011)
1.4.3.2 Mécanisme zipper
Figure 20 : Différence entre les mécanisme trigger et zipper chez Salmonella (Velge et al., 2012a)
1.4.3.3 Invasine PagN
1.4.4 Survie et multiplication dans la cellule hôte
Figure 21 : Structure génétique du SPI-2 et organisation du T3SS-2 (Kuhle and Hensel, 2004)
Figure 22. Formation et évolution de la Vacuole Contenant les Salmonella (Ramos-Morales, 2012)
1.4.5 Induction de la mort cellulaire
Figure 23. Mécanismes d’apoptose et de pyroptose induits par Salmonella (Fink and Cookson, 2007)
1.5 Spécificité à l’hôte
1.5.1 Spéciation de Salmonella
Figure 24 : Modèle pour l’évolution de la virulence du genre Salmonella (Baumler et al., 1998)
Figure 25 : Spécialisation chez Salmonella (Feasey et al., 2012)
1.5.2 Facteurs de spécificité à l’hôte
2 SALMONELLA DERBY, UN SEROVAR EMERGENT ENCORE MECONNU
2.1 Découverte et épidémies notables
2.2 Salmonella Derby dans les filières alimentaires
2.2.1 Description des filières alimentaires critiques en France
2.2.1.1 Secteur porcin
Figure 26: Répartition de la production porcine en France (CGAAER, 2012)
Figure 27 : Chiffres clés de la filière Porc en France (IFIP, 2014)
2.2.1.2 Secteur volailles
Figure 28 : Chiffres clés pour la filière volailles de chair (ITAVI, 2015)
Figure 29: Répartition de la production avicole française (ITAVI, 2013)
2.3 Impact sur la santé publique et prévalence
2.4 Etudes de typage du sérovar Derby
Figure 30 : Dendrogramme UPGMA des profils PFGE de 82 souches de S. Derby isolée en Allemagne entre 2006 et 2008 (Hauser et al., 2011)
Figure 31 : Dendrogramme représentant les 42 profils PFGE obtenus sur 170 souches de S. Derby isolées en France entre 2006 et 2007 (Kerouanton et al., 2013)
PROBLEMATIQUE DIVERSITE GENETIQUE DE S. DERBY DE LA FOURCHE A LA FOURCHETTE ET ETUDE DE SA PATHOGENICITE
RESULTATS
1 SELECTION DE LA COLLECTION
1.1 Sélection des souches alimentaires
1.1.1 Souches du secteur porcin
Figure 32: Répartition des souches de S. Derby collectées par le réseau Salmonella pour le secteur porcin en 2014-2015
Tableau 5 : Plan de sélection pour les souches issue du secteur porcin
1.1.2 Souches du secteur avicole
Figure 33: Correspondance entre les souches de S. Derby sélectionnées et les chiffres de production du secteur avicole en France en 2014-2015 (TEC = tonne équivalent carcasse) (ITAVI, 2016)
Figure 34 : Répartition des souches de S. Derby collectées par le réseau Salmonella pour le secteur avicole
Tableau 6: Plan de sélection pour les souches du secteur volaille
1.2 Souches humaines
Figure 35 : Répartition des cas cliniques recensés par le CNR de S. Derby par région (période 2014-2015) au regard de la densité de population française
2 PUBLICATION I : POLYPHYLETIC NATURE OF SALMONELLA ENTERICA SEROTYPE DERBY AND LINEAGE-SPECIFIC HOST-ASSOCIATION REVEALED BY GENOME-WIDE ANALYSIS
2.1 Résumé
Tableau 8. Liste des sérovars utilisés pour l’analyse MLST et nombre des génomes correspondants
Figure 36 : Comparaison des profils MLST des 25 sérovars les plus fréquemment isolés en Europe
2.2 Publication
2.2.1 Supplementary material
Supplementary table 1: Strains information: Epidata, sample ID, NCBI accession number, genome deep coverage, and breadth
Supplementary figure 1 : Geographical selection plan for the strains isolated from the pork and poultry sectors
Supplementary table 2: List of the genomes from different serotypes of Salmonella enterica subsp. enterica used for the FimH sequence analysis. Epidata and sample ID
Supplementary table 3: List of strains presenting antimicrobial resistance genes
Supplementary figure 2: Results of the in silico PCR for the SPI-23 into S. Derby collection
3 PUBLICATION II : COMPLETE GENOME FOR SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROTYPE DERBY ASSOCIATED WITH THE PORK SECTOR IN FRANCE
3.1 Résumé
3.2 Publication
4 PUBLICATION III : PHYLOGENOMIC ANALYSIS OF SALMONELLA ENTERICA SUBSP.ENTERICA SEROVAR DERBY CIRCULATING IN EUROPE, ASIA AND THE UNITED STATES AND ASSOCIATED WITH THE POULTRY SECTOR
4.1 Résumé
4.2 Publication
Figure 1. Phylogenetic reconstruction based on SNPs including strains of the ST71 profile and their geographic distributions and origins
Figure 2. AMR and phage profiles according to the phylogeny
4.2.1 Supplementary material
Supplementary Table 1. S. Derby genomes information analyzed in this study
Supplementary table 2. S. Derby antimicrobial resistance genes
Supplementary table 3. S. Derby’s phages
5 PUBLICATION IV : SOURCE-ATTRIBUTION STUDY OF S. DERBY SPORADIC CASES IN FRANCE (EN PREPARATION)
5.1 Résumé
5.2 Publication
5.2.1 Introduction
5.2.2 Material and methods
5.2.3 Results
Figure 1: Phylogenetic tree of the French Salmonella Derby human and non-human isolates
5.2.4 Discussion
6 PUBLICATION V: INVESTIGATION OF THE HOST SPECIFICITY OF S. DERBY. (EN PRÉPARATION)
6.1 Résumé
6.2 Publication
6.2.1 Introduction
6.2.2 Material and Methods
6.2.3 Results
Figure 1: Differences in adhesion, invasion and multiplication capacity of the ST40, ST71 and ST682 lineages of S. Derby on human (HT 29), Gallus gallus (LMH) and pig (IPEC-1) epithelial cells
Table 1: Presence of known SPI in the different S. Derby lineages
Table 2: Presence of known virulence factors in the different S. Derby lineages
Table 3: Identity Variation between the lineages of S. Derby in several virulence related gene
Figure 2: general function of lineages specifics genes
6.2.4 Discussion
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
SALMONELLA DERBY : UN SEROVAR POLYPHYLETIQUE
Figure 37. Exemple de source-attribution sur un cluster du clade 1 du ST40
FICHE ASSURANCE QUALITE
REFERENCES
ANNEXES
Annexe 1 : Donnée épidémiologiques des souches de la collection
Annexe 2 : Collection de génomes pour la publication : “ Source attributionstudy of S. Derby in France” (en préparation)
Annexe 3 : Collection pour l’analyse pan-génome des souches françaises de S. Derby
Annexe 4 : références utilisée pour les différents SPI
Annexe 5 : résultats de l’invasion cellulaire sur les souches du ST71
Annexe 6: Classement fonctionnel des génes unique aux différentes lignées de S. Derby
Annexe 7 : Différences observées au locus correspondant au SPI-8
Annexe 8: réparation géographique des souches de la collection
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