DIVERSITE DES ELEMENTS TRANSPOSABLES A L’ECHELLE DE LA FAMILLE DES NOTOTHENIIDAE

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Microdissection et élaboration de la sonde de peinture

Pour la microdissection, le contrôle de la qualité des étalements a été effectué au microscope (Zeiss, axioplan) en contraste de phase, afin d’évaluer la quantité de métaphases correctement étalées. Les lames sélectionnées ont été colorées au Giemsa 4 % durant 12mn.

Constitution des lots de paires de chromosomes homologues microdisséqués

La microdissection de la plus grande paire de T. pennellii a été réalisée à l’aide d’un microscope inversé (Axiovert 25, Zeiss) équipé d’un « joystick » : micromanipulateur (Narishige). L’isolement des chromosomes a été obtenu à l’aide d’aiguilles de verre fabriquées au moyen d’un étireur (Narishige). Un exemple illustrant une métaphase sous l’objectif du microscope inversé et une microdissection à l’aide de l’aiguille en verre est présenté Figure II.6.A et II.6.B. Des protocoles publiés nous ont guidés dans notre démarche (Seifertova et al. 2013; Laudicina and Mühlmann 2015; Vicari et al. 2015). Une quantité minimum d’ADN est requise pour l’amplification par WGA4 du matériel microdisséqué. Cette amplification (kit WGA4 « single cell », Sigma Aldrich) est en effet optimisée pour une cellule humaine unique (3,5 pg). Nous avons déterminé par calcul un nombre minimum de 30 chromosomes homologues de cette plus grande paire de chromosomes de T. pennellii à microdisséquer pour la constitution des lots en prenant pour référence de taille de génome 1,15 pg (valeur C).

Elaboration d’ADN compétiteur

Afin de saturer les séquences hautement et moyennement répétées présentes dans la sonde de peinture de la grande paire de T. pennellii ou dans les inserts des BACs, de l’ADN génomique compétiteur a été préparé à partir de tissu musculaire respectivement de Trematomus hansoni ou de N. coriiceps. Pour les BACs, l’ADN du cerf Cervus elaphus a été choisi pour saturer les sites aspécifiques. Les protocoles qui ont été suivis sont ceux d’une extraction d’ADN : lyse tissulaire avec Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) et protéinase K, récupération d’ADN après traitement au chloroforme Alcool Isoamylique (CIA) et précipitation à l’isopropanol, rinçage à l’éthanol 70 %. L’ADN est fragmenté par autoclavage et choc thermique, précipité et resuspendu dans du tampon d’hybridation (50 % formamide / 2x SSC / 10 % dextran sulfate) à une concentration finale de 8 g/l pour les extraits de T. hansoni et N. coriiceps, et de 10 g/l pour les extraits de Cervus elaphus.

Aspects techniques mis au point et perspectives d’amélioration du signal de peinture

La peinture préparée à partir de la microdissection de la plus grande paire de T. pennellii a bien produit des signaux spécifiques de cette plus grande paire, mais aussi des signaux annexes détectés sur les autres paires chromosomiques. Même si les métaphases étaient en nombre suffisant sur les préparations chromosomiques et les chromosomes relativement bien étalés au sein d’une métaphase pour permettre leurs prélèvements, il existe toujours des risques de contamination intrinsèque des lots en prélevant des fragments d’autres chromosomes avec l’aiguille (Laudicina and Mühlmann 2015; Vicari et al. 2015). Ce risque est accentué par les multiples prélèvements (30) du chromosome cible sur les différentes métaphases pour constituer les lots (Weimer et al. 1999). De plus, ce risque est d’autant plus marqué que la présence de résidus de cytoplasme agit comme une matrice liant entre eux les chromosomes, ce qui peut entraîner le décrochage synchrone de plusieurs chromosomes différents .
Une des solutions pour minimiser ce risque et maximiser le nombre d’HCI détectables potentielles consiste à préparer des sondes de peinture à partir de la microdissection d’un petit nombre (<5) ou bien d’un unique chromosome (Guan et al. 1993; Viersbach et al. 1994; Christian et al. 1999; Griffin et al. 1999; Trifonov et al. 2002). Nous avons réalisé avec succès une amplification de sonde préparée à partir de 15 chromosomes de la plus grande paire de T. pennellii ou de T. hansoni. Ce résultat montre qu’il est a priori possible de réduire le nombre de chromosomes pour la constitution de peintures, et donc potentiellement d’éliminer une partie de la contamination intrinsèque. Dans tous ces cas, y compris celui d’une préparation de peinture à partir d’un seul chromosome, il est toutefois nécessaire de pouvoir distinguer clairement ce chromosome dans un souci de répétabilité de l’expérience. Une taille suffisante des chromosomes, et surtout, l’identification fiable de ces paires est alors strictement requise.
Or, si pour T. pennellii et N. coriiceps, certaines paires sont identifiables sur la base de la taille, de la morphologie et/ou du marquage DAPI (Figure3 et 4c), il n’est pas possible de reconnaître la plupart des paires de manière non équivoque (surtout les petites paires acrocentriques présentes chez T. pennellii, T. hansoni et D. mawsoni, Figures 4A et 4B). Leur similarité en taille et en forme limite également leur isolement par électrophorèse en champ pulsé comme cela est fait pour d’autres espèces. Cela limite donc le nombre de paires candidates possibles pour la microdissection chromosomique et donc pour la détection d’HCI par peinture dans cette famille. La technique de « Whole Genome Amplification 4 » employée, de type « single cell » repose sur l’amplification aspécifique de produit récolté au moyen d’hexamères dégénérés jouant le rôle d’amorces (Vicari et al. 2015). Elles sont optimisées pour l’amplification de l’équivalent du contenu ADN d’une cellule humaine unique (7 pg) (Arneson et al. 2008; Hockner et al. 2009). C’est donc une méthode particulièrement adaptée à l’amplification de lots de chromosomes microdisséqués (estimés à 4 pg pour les lots numéros 1 et 2 et à 6 pg pour le lot numéro 3). Cependant, les risques de contamination des échantillons microdisséqués par de l’ADN exogène sont très importants car l’étape d’amplification WGA est extrêmement sensible (Laudicina and Mühlmann 2015). Des contaminations imputables à l’utilisation du WGA des lots numéro 1 et 2 ont été détectées lors de l’élaboration de la sonde de peinture : des témoins négatifs constitués d’eau stérile amplifiés avec le kit WGA4 produisent une faible amplification lors des dépôts sur gel d’agarose et la détection d’une quantité résiduelle d’ADN contaminant lors des quantifications. Après avoir pris les précautions nécessaires pour le lot numéro 3 (stérilisation des outils par exposition aux UVs, pas de confinement sous hotte lors de l’incorporation des produits, ouverture des tubes en dehors de la zone de manipulation…), nous n’avons plus détecté de contamination lors des dépôts sur gel. Cependant, le séquençage de certains de ces produits a révélé une haute proportion de séquences contaminantes, principalement d’origine humaine. Etant donné la distance génétique entre l’homme et les téléostéens antarctiques, ces séquences n’ont pas pu empêcher ou biaiser l’hybridation de la peinture préparée sur les chromosomes de Nototheniidae. Par contre, la quantité réelle de sonde Nototheniidae-spécifique a été largement sur-estimée lors des dosages des produits d’amplifications.

La plus grande paire chromosomique de T. pennellii, produit de deux fusions chromosomiques (Robertsonienne = centrique et en tandem)

Chez les Nototheniidae, l’utilisation des sondes de peinture devrait permettre de rechercher des homologies chromosomiques interspécifiques afin de reconstituer les nombreux remaniements survenus au cours de leur diversification (Pisano and Ozouf-Costaz 2000). Avec des signaux d’hybridation abondamment détectés sur les chromosomes de T. hansoni, D. mawsoni et N. coriiceps, les résultats de peinture obtenus chez les différentes espèces de cette famille laissent supposer une bonne conservation des séquences présentes dans la plus grande paire de T. pennellii entre les différentes espèces examinées.
La plus grande paire de chromosomes de T. pennellii semble être homologue à trois paires peintes de chromosomes acrocentriques présentes chez T. hansoni et D. mawsoni. Les résultats obtenus par peinture suggèrent donc que cette grande paire de chromosomes de T. pennellii résulterait d’une double fusion (une centrique et une en tandem), à partir de trois chromosomes hérités du dernier ancêtre commun des Nototheniidae (Figure II.14). Ce résultat est cohérent avec les données caryotypiques de Trematomus pennellii de 2n = 32, inférieur au caryotype ancestral inféré (2n = 48). Certaines des paires chromosomiques de T. pennellii sont en effet le produit de fusions à nombre constant d’unités structurales (telles que définies chez I. cyanobrancha) (Figure II.5).

Caractérisation des unités structurales chez les « Trematomus »

Les BACs sélectionnés à l’issue de la première étape de tri chez N. coriiceps ont hybridé avec succès sur les chromosomes de « Trematomus » (Figure II.12). Toutes les combinaisons de BACs ayant marqué un même bras chromosomique de N. coriiceps ont été retrouvées dans une même unité structurale chez T. newnesi. L’hypothèse de cette correspondance a donc été vérifiée, nous permettant d’identifier ces unités structurales et d’établir leurs correspondances entre espèces de « Trematomus ». Au cours de cette étape, nous avons choisi dans un premier temps de caractériser par deux ou trois BACs les unités structurales, de manière à pouvoir suivre leur orientation et leur distance relative entre les espèces (T. bernacchii, T. eulepidotus, T. newnesi, T. pennellii, T. hansoni, T. nicolaï, T. borchgrevinki, I. cyanobrancha). Compte tenu de cette correspondance systématique entre N. coriiceps et T. newnesi, nous avons rapidement choisi de définir des combinaisons de BACs directement chez N. coriiceps.
De façon globale, la position relative des BACs dans les bras observés chez N. coriiceps a été retrouvée sur les unités structurales des espèces de « Trematomus » examinées (position centromériques, péricentromériques, milieu du bras, télomérique). Ainsi, les BACs 28D21, C4 et M11 sont toujours retrouvés en position péricentromérique des unités structurales sur lesquels ils ont été localisés, comme 85H3 en position télomérique (Figure II.13). Une exception a été remarquée pour le BAC 44M14 qui semble situé en milieu de bras chez T. pennellii, alors qu’il est localisé en position péricentromérique d’un bras chez T. newnesi, T. eulepidotus et T. bernacchii (Figure II.13). Cela montre l’avantage de s’intéresser aux unités structurales plutôt qu’aux bras chromosomiques.
Une synténie systématique semble exister entre les unités structurales des « Trematomus ». Cette conservation se caractérise par l’ordre et la distance des BACs sur les unités structurales identifiées chez les différentes espèces. Par exemple, le couple de BACs C4-F15 est retrouvé sur une même unité structurale, et orienté dans le même sens par rapport au centromère chez toutes les espèces examinées: C4 en position péricentromérique et F15 en position médiane, légèrement décalé vers le télomère (Figure II.12 et II.13). De la même façon, on retrouve cette synténie entre N. coriiceps et les « Trematomus », montrant non seulement la correspondance mais aussi la conservation de l’ordre des marqueurs entre bras chromosomiques chez N. coriiceps et les unités structurales chez les « Trematomus ». C’est par exemple le cas avec le segment borné par le couple de BACs F5-E21, situés aux deux extrémités de l’unité structurale, avec F5 en position péricentromérique et E21 en position subtélomérique (Figure II.11, II.12 et II.13). Etant donné cette synténie observée, nous avons considéré dans un second temps qu’un seul BAC serait désormais suffisant pour assurer le marquage d’une unité structurale chez les « Trematomus ».

Conservation interspécifique des séquences d’ADNg présentes dans les BACs de N. coriiceps

Nous avons observé une proportion beaucoup plus importante des BACs localisés sur les plus grandes paires de chromosomes de N. coriiceps, au détriment des quatre plus petites paires chromosomiques. Ces dernières ayant un contenu en ADN moins important, la probabilité d’y identifier un BAC tiré aléatoirement est théoriquement plus faible. D’autre part, les deux plaques reçues dans le cadre de la collaboration contiennent peut être préférentiellement des BACs localisés dans les sept plus grandes paires chromosomiques de N. coriiceps. Ce biais de localisation a constitué un avantage dans l’étape d’exploration car il a permis de localiser plus facilement deux marqueurs présents sur un même bras. Par contre, les bras présents dans les plus petites paires n’ont pas pu être représentés dans nos recherches d’identifications. La plus petite paire chromosomique métacentrique (probable produit d’une inversion péricentrique (Pisano et al. 1995; Pisano and Ozouf-Costaz 2000; Mazzei et al. 2006; Mazzei et al. 2008) présente chez l’ensemble des « Trematomus » étudiés (à l’exception probable de T. eulepidotus) n’a donc pas pu être caractérisée avec ce matériel.
Le succès de l’hybridation de ces BACs à large échelle taxinomique au sein de la famille de Nototheniidae suggère une forte conservation des séquences génomiques présentes dans les BACs entre les différentes espèces examinée. Nous avons également montré que ces BACs hybrident au-delà des Nototheniidae, sur une espèce de Notothenioidei (Eleginops maclovinus, divergence avec les Nototheniidae estimée entre 37 et 42 Ma, Near et al. (2012), Colombo et al. (2015) (Figure II.15), mais pas chez une espèce plus éloignée du sous-ordre (échec chez Bovichtus diacanthus, dont la divergence avec les Nototheniidae est estimée supérieure à 60Ma, Near et al. (2012), Colombo et al. (2015)). Cela confirme une divergence relativement récente de la famille des Nototheniidae (22,4 Ma, Near et al. (2012), 13,35 Ma, Colombo et al. (2015)), et a fortiori de la radiation des « Trematomus » (9,1 Ma Near et al. (2012), 4,26 Ma, Colombo et al. (2015)). L’étude des contenus très similaires, voire quasiment identiques en GC, en séquences répétées, en simple-sequence repeats (SSRs), et en ADN satellites entre les génomes du Nototheniinae N. coriiceps et du Channichtyinae C. aceratus (Detrich et al. 2010; Detrich and Amemiya 2010) confirme ce haut degré d’identité de séquences au sein de la famille.

Jeux de données et paramètres d’analyse

L’approche de phylogénomique ddRAD-seq couplée au séquençage Illumina nous a permis de générer un jeu de données important et de qualité. La qualité des séquences obtenues, ainsi que l’homogénéité des longueurs des lectures et des couvertures de chaque banque sont autant de critères optimaux pour l’utilisation des outils d’analyse et des reconstructions phylogénétiques associées.
Nous avons utilisé les « pipelines » de reconstruction de locus les plus couramment employés dans la littérature : PyRAD (Eaton and Ree 2013; Eaton 2014) et Stacks (Catchen et al. 2011). Ces deux outils ne fonctionnent pas exactement de la même manière. Par exemple, PyRAD aligne les lectures alors que Stacks constitue des locus par simple empilement des lectures. De cette manière, PyRAD peut gérer les insertions/délétions, contrairement à Stacks. De plus, les étapes de constitutions des locus par individus puis des locus partagés s’enchaînent directement avec PyRAD, alors qu’elles sont entrecoupées par des étapes de constitution d’un catalogue général des locus identifiés par individus suivi d’un enrichissement par comparaison des lectures de chaque individu à ce catalogue avec Stacks. Cependant, dans la mesure du possible, nous avons choisi des paramètres communs comme critères pour former des locus, tels que le seuil minimum d’identité entre lectures (85 %) ou bien le nombre minimum de lectures requises (4) pour former un locus, ou encore le nombre d’individus minimum (20) requis pour former un locus partagé. En partant d’un jeu de données similaires en lectures filtrées et en réglant ces paramètres communs, les topologies obtenues à partir des jeux de données issus de ces deux approches sont les plus comparables possibles.

Influence des données manquantes

On retrouve une cohérence dans les résultats des analyses en fonction du paramètre p. Plus le nombre d’individus requis pour former un locus partagé est élevé (p20 vs p16), plus le nombre de locus reconstruits est faible (perte de 77 % des locus en moyenne dans les deux « pipelines », Tableau III.2), mais les données manquantes moindres (réduction de plus de la moitié en proportions, Figure III.4).
L’importance de l’influence des données manquantes lors de l’emploi d’approches NGS de type RAD-seq a été beaucoup discutée (Rubin et al. 2012; Eaton and Ree 2013; Anderson et al. 2017). Lorsqu’elle sont importantes en proportion dans le jeu de données, ces données manquantes peuvent influencer considérablement la résolution et le soutien des noeuds au sein d’une analyse phylogénétique, a fortiori dans le cadre d’une radiation (Hejnol et al. 2009; Wagner et al. 2013). Cependant, leur influence varie entre études suivant leurs proportions par rapport à l’échantillonnage, leurs distributions, la taille du jeu de données ou encore la rétention de polymorphisme ancestral (Xi et al. 2016). Elles peuvent être dues à plusieurs facteurs inhérents à ce type d’approche, comme par exemple les mutations dans les sites de restriction, la qualité des séquences, la variabilité permise pour un site donné au sein d’un locus, ou encore la couverture minimale paramétrée pour former un locus (MinCov/m) (Huang and Knowles 2016). Cette influence a été testée ici par comparaison entre les résultats obtenus avec les paramètres MinDepth/p de 16 ou 20 (21 ou 9 % de données manquantes, Figure III.4) (Tableau III.3). Les topologies reconstruites avec le paramètre p16 sont présentées en annexe 3.

Résolution des relations phylogénétiques chez les « Trematomus »

Le pourcentage de noeuds retrouvés d’une analyse à l’autre (supérieur à 75 %) est bien supérieur à celui des noeuds où il subsiste une ambiguïté en prenant en compte tous les types d’analyses confondues (Figures III.5, III.6 et annexe 3). Les noeuds terminaux qui regroupent deux individus de la même espèce sont quasiment tous résolus avec 100 % de valeur de bootstrap (excepté pour le regroupement des deux T. newnesi pour l’analyse Stacks, concaténation, p16, annexe 3). On note toutefois une exception récurrente avec la non-monophylie des T. nicolaï examinés. La position de cette espèce dans l’arbre est impossible à établir à partir de la littérature étant donné les multiples topologies contradictoires publiées. T. nicolaï est tantôt positionné groupe frère de T. eulepidotus (Bargelloni et al. 1994), de T. pennellii (Kuhn and Near 2009), de T. borchgrevinki (Sanchez et al. 2007), ou encore de T. bernacchii (COI, Lautrédou et al. (2010)), et parfois même retrouvé au sein d’une polytomie (Ritchie et al. 1996; Near 2004; Near and Cheng 2008). En prenant en compte un nombre plus faible d’individus pour former un locus comme p6 ou p12, T. nicolaï CE5778 se retrouve parfois groupe frère du groupe un (T. nicolaï CE5684, T. newnesi REVO002/T. newnesi TRNE6), alors que la position de l’individu T. nicolaï CE5684 ne bouge pas (topologies non montrées). Ces deux spécimens font partie des banques ayant des couvertures hautes (supérieures à 650 000 lectures filtrées, Tableau III.1), mais la banque représentant l’individu T. newnesi CE5684 est environ un tiers plus couverte, contrairement au deuxième individu T. nicolaï CE5778. La possibilité d’un hybride entre T. pennellii et T. nicolaï n’est pas à exclure pour ce dernier. La vérification de l’identification des individus a été refaite par une amplification du cytochrome oxidase I (COI) des individus T. nicolaï CE5684 et CE5778, T. newnesi TRNE6 et REVO002, et T. pennellii CE3317 et si98 (mêmes extraits que ceux ayant servi pour la constitution des banques de ddRAD-seq) et puis la comparaison des séquences par BLAST avec la base de donnée existante chez les « Trematomus » dans la base de données « Barcode of Life » ou « National Center for Biotechnology Information » (ncbi) (Lautrédou et al. 2010). Afin de pouvoir faire des hypothèses argumentées sur les positions phylogénétiques des deux individus T. nicolaï, il faudrait analyser plus précisément l’histoire racontée par chaque locus. Cela permettrait d’estimer le pourcentage de locus positionnant T. nicolaï en groupe frère de T. newnesi et celui positionnant T. nicolaï en groupe frère de T. pennellii.
Grâce à cette approche de ddRAD-seq, nous avons identifié, pour la première fois dans les reconstructions des relations phylogénétiques de cette radiation des liens de parentés robustes et fiables (peu d’influence des paramètres variables sur la présence et la résolution des noeuds définissant les liens phylogénétiques au sein et entre les groupes définis, valeurs de bootstrap des noeuds supérieures à 75 % dans la majorité des cas, Tableau III.3, Figure III.5, III.6 et annexe 3). I. cyanobrancha et T. scotti semblent bien à la base du groupe « Trematomus », ce qui va tout à fait dans le sens des études précédemment publiées. Cependant, I. cyanobrancha est parfois retrouvé avant ou avec le deuxième groupe externe L. squamifrons. Dans ces cas, le support des noeuds est plus faible. Un échantillonnage des groupes externes plus dense pourrait aider à lever cette ambiguïté concernant sa position ou non au sein du groupe « Trematomus ». La distribution subantarctique de cette espèce, contrairement à la répartition des autres « Trematomus » en grande majorité inféodés au plateau continental antarctique pourrait expliquer le faible nombre d’études phylogénétiques l’incluant dans l’échantillonnage. Emergent ensuite T. borchgrevinki ainsi que le clade des T. newnesi et du T. nicolaï CE5684 (groupe un). Un grand clade regroupe les espèces restantes, distribuées dans les groupes deux, trois et quatre. Au sein du groupe deux, les T. eulepidotus sont systématiquement groupes frères du clade formé par les T. loennbergii et les T. lepidorhinus. Dans le groupe trois, T. tokarevi est groupe frère du clade formé par T. nicolaï CE5778 et les T. pennellii. Enfin, dans le groupe quatre, les T. bernacchii sont associés aux T. hansoni. Nous retrouvons donc bien les rares regroupements consensus publiés : T. scotti et I. cyanobrancha en position basale dans l’arbre des « Trematomus » (Bargelloni et al. 1994; Ritchie et al. 1996; Ritchie et al. 1997; Bargelloni et al. 2000; Stankovic et al. 2002; Near 2004; Sanchez et al. 2007; Dettai et al. 2012), positionnement en groupes frères des espèces T. loennbergii et T. lepidorhinus (Ritchie et al. 1997; Sanchez et al. 2007; Near and Cheng 2008; Lautrédou et al. 2010; Janko et al. 2011; Dettai et al. 2012; Lautrédou et al. 2012; Murphy 2015), ainsi que T. bernacchii et T. hansoni (Ritchie et al., 1996; Near et al., 2004; Sanchez et al., 2007; Kuhn et Near, 2009 : 16S/ND2, Janko et al., 2011; Lautrédou et al., 2012 : COI/HECW/Pkd1/Rhodopsine; Colombo et al., 2015). Les noeuds des groupes un à quatre sont soutenus (Figure III.3) et retrouvés dans la grande majorité des topologies reconstruites.

Chromosomal location of nototheniid retrotransposon families

Fluorescent In Situ hybridization (FISH) is a powerful technology for imaging the distribution of repetitive gene families on the condensed chromosomes of metaphase spreads. To assess the potential role of nototheniid TEs in mediating chromosomal rearrangements in Trematomus and other High Antarctic species, we used FISH to map the locations of two families of DIRS1, two families of Gypsy, and one family of Copia (Hydra) on chromosome preparations from five nototheniid species that represent the diversity of nototheniid karyotypes (2n = 22 metacentrics to 2n = 48 acrocentrics): T. eulepidotus, T. hansoni, T. pennellii, N. coriiceps, and D. mawsoni. For comparison, we chose chromosome preparations from three cool temperate/temperate outgroup species: the Sub-Antarctic notothenioids B. diancanthus and E. maclovinus, and the Eurasian perch P. fluviatilis, all of which feature 48 acrocentric chromosomes. The TE families were chosen for their cloned sequence sizes (>1 kb) and their ubiquity in the genomes of nototheniid species (Additional files IV.2 and IV.6). Figure IV.6 shows the two major types of TE distribution patterns: (1) dense accumulation (“hot spots”) mainly in centromeric and/or pericentromeric regions and sometimes in intercalary or telomeric positions; and (2) scattered, punctuate staining along chromosome arms. Combinations of these two patterns were also evident. The distributions (1) and/or (2) clearly depended upon the TE super-family, but within a super-family, different TE families produced comparable results (e.g., the nearly identical patterns observed between YNotoJ and YNotoR of the DIRS1 superfamily as shown with the double FISH-mapping (Additional file IV.7 and IV.8), and between GyNotoA and GyNotoE of the Gypsy superfamily) (Figure IV.6 and Additional file IV.7). For a given TE family, there were small variations of signal intensity or distribution along chromosomes between species, but generally, the same location pattern was observed.

diversité des éléments transposables chez les « Trematomus »

Afin d’avoir une idée moins restrictive du contenu en ETs dans les génomes de Nototheniidae, nous avons recherché des éléments transposables dans les lectures de ddRAD-seq obtenues en vue de clarifier la phylogénie des « Trematomus » (chapitre III). Les ETs ont été identifiés par le filtre « éléments transposables » permettant d’éliminer les locus « ETs » partagés. Pour cette recherche, afin de maximiser le nombre de locus « ETs » obtenus, nous avons diminué le paramètre p en choisissant non plus 16 ou 20, mais seulement 6 individus pour former un locus partagé. Nous avons ainsi identifié 181 locus « ETs » (soit un total de 0,8 % des locus totaux polymorphes ou non) avec le logiciel PyRAD (Eaton and Ree 2013; Eaton 2014). La distribution de ces locus dans ces génomes a été classée par individu et par super-famille (Tableau IV.6).
Le nombre de locus « ETs » identifiés dans cette analyse pour chaque super-famille d’éléments dépend de certains paramètres, comme la taille de l’élément (transposons et LINEs plus courts que les autres types de rétrotransposons), la fréquence de sites de restriction EcoR1 et MspI présents sur les séquences, ou encore le paramètre p6 choisi. Cependant, nous avons choisi un seuil de détection non stringent (e-value de 10-10) afin de pouvoir identifier un maximum de locus « ETs », sans risquer pour autant d’identifier des faux positifs. Si la composition et le nombre de locus « ETs » retrouvés ne reflètent donc pas de manière tout à fait exhaustive le répertoire d’ETs existant réellement dans les génomes de Nototheniidae, cette distribution permet de donner un aperçu du paysage global en ETs (à la fois pour les éléments étudiés précédemment, mais aussi pour d’autres super-familles d’éléments de classes I et II).

Table des matières

I) INTRODUCTION GENERALE
II) CHAPITRE 1 : CARACTERISATION DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES AU SEIN DU GROUPE « TREMATOMUS »
II.1 : NATURE DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES
II.1.A : HISTOIRE DES DIVERSIFICATIONS CHROMOSOMIQUES CHEZ LES NOTOTHENIIDAE
II.1.B : CONSERVATION DE LA TAILLE DES GENOMES CHEZ LES NOTOTHENIIDAE
II.1.B.1 : Introduction
I.1.B.2 : Matériels et Méthodes
I.1.B.3 : Résultats
I.1.B.4 : Discussion
II.2 : RECHERCHE ET IDENTIFICATION DES HOMOLOGIES CHROMOSOMIQUES INTERSPECIFIQUES
II.2.A : LES HOMOLOGIES CHROMOSOMIQUES INTERSPECIFIQUES
II.2.A.1 : Homologies interspécifiques entre chromosomes entiers
II.2.A.2 : Homologies entre unités structurales au sein des « Trematomus »
II.2.B : METHODES
II.2.C : RECHERCHE D’HCI PAR PEINTURE DE LA GRANDE PAIRE DE T. PENNELLII MICRODISSEQUEE
II.2.C.1 : Résultats
II.2.C.2 : Discussion :
II.2.D : RECHERCHE DES HOMOLOGIES DES UNITES STRUCTURALES INTERSPECIFIQUES PAR BAC-FISH
II.2.D.1 : Résultats
II.2.D.2 : Discussion
II.2.E : DISCUSSION
III) CHAPITRE 2 : PHYLOGENIE DES « TREMATOMUS »
III.A : INTRODUCTION
III.A.1 : COMPOSITION DU GROUPE « TREMATOMUS »
III.A.2 : PHYLOGENIE DU GROUPE « TREMATOMUS »
III.A.3 : ANALYSE PHYLOGENOMIQUE
III.B : MATERIELS ET METHODES
III.C : RESULTATS
III.C.1 : GENERATION DU JEU DE DONNEES POUR FORMER LES LOCUS
III.C.2 : RECONSTRUCTIONS PHYLOGENETIQUES
III.D : DISCUSSION
III.D.1 : JEUX DE DONNEES ET PARAMETRES D’ANALYSE
III.D.2 : INFLUENCE DES DONNEES MANQUANTES
III.D.3 : RESOLUTION DES RELATIONS PHYLOGENETIQUES CHEZ LES « TREMATOMUS »
IV) CHAPITRE 3 : LES ELEMENTS TRANSPOSABLES, FACILITATEURS DE CES REMANIEMENTS AU COURS DE L’EVOLUTION?
IV.1 : INTRODUCTION
IV.2 : DIVERSITE, QUANTIFICATION, LOCALISATION CHROMOSOMIQUES DES RETROTRANSPOSONS A LTR GYPSY ET COPIA ET RETROTRANSPOSONS A YR DIRS1 CHEZ LES « TREMATOMUS »
IV.2.A : RESUME DES PRINCIPAUX RESULTATS
IV.2.B : MOBILIZATION OF RETROTRANSPOSONS AS A CAUSE OF CHROMOSOMAL DIVERSIFICATION AND RAPID SPECIATION: THE CASE FOR THE ANTARCTIC TELEOST GENUS TREMATOMUS (ARTICLE)
IV.3 : DIVERSITE DES ELEMENTS TRANSPOSABLES A L’ECHELLE DE LA FAMILLE DES NOTOTHENIIDAE
IV.3.A : RECHERCHE DES FAMILLES DES TROIS RETROTRANSPOSONS CHEZ LES NOTOTHENIIDAE
IV.3.B : DIVERSITE DES ELEMENTS TRANSPOSABLES CHEZ LES « TREMATOMUS »
V) DISCUSSION GENERALE : HISTOIRE EVOLUTIVE DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES DES « TREMATOMUS »
V.1 : LES FUSIONS CHROMOSOMIQUES, REMANIEMENTS MAJORITAIRES SURVENUS LORS DE LA DIVERSIFICATION DES « TREMATOMUS »
V.2 : SPECIATIONS CHROMOSOMIQUES MULTIPLES CHEZ LES « TREMATOMUS »
V.3 : VERS UNE RECONSTRUCTION DES SCENARIOS EVOLUTIFS DES DIVERSIFICATIONS CHROMOSOMIQUES
VI) CONCLUSION ET PERSPECTIVES
VII) BIBLIOGRAPHIE :

Télécharger le rapport complet