Soutenance mémoire
Symbiose ectomycorhizienne
Diversité des champignons ectomycorhiziens
La symbiose ectomycorhizienne concerne 3 à 5% des plantes vasculaires et se rencontre principalement chez les dicotylédones. Cette symbiose ectomycorhizienne entraîne d’importantes modifications dans la morphologie des racines : les poils absorbants disparaissent et un manteau d’hyphes ou manteau fongique entoure les racines nourricières. De ce manteau partent des hyphes qui s’insèrent entre les cellules corticales de la racine pour former le réseau de Hartig. Vers l’extérieur, des hyphes prolifèrent à partir du manteau fongique et colonisent le milieu environnant en formant le réseau extramatriciel (Smith & Read, 2008). Les champignons ectomycorhiziens sont présents dans le sol sous forme de propagules de conservation et de dissémination (spores, fragments de mycorhizes, cordons mycéliens) (Bâ et al., 2012).
C’est sous ces différentes formes que les champignons se maintiennent dans le sol à l’état de vie ralentie en période sèche notamment. Quand les conditions sont favorables, les propagules produisent des hyphes qui poussent et se ramifient pour donner un mycélium. Ce dernier est ainsi capable de coloniser le système racinaire de la plante pour former des ECMs. La germination des propagules marque le début du cycle de développement des Basidiomycota auxquels appartient la plupart des champignons ectomycorhiziens. Ce cycle se résume en deux phases principales : une phase végétative comprenant la formation et le développement du mycélium ou thalle à partir de la germination des spores, et une phase fructifère marquée par l’apparition de sporophores épigés ou hypogés, et la production de spores. Chez les champignons ectomycorhiziens, le sporophore est la partie visible de l’organisme que l’on appelle couramment « champignon ». Il est constitué de filaments ou d’hyphes groupés en amas ou mycélium. La présence de sporophores est associée automatiquement à la présence de mycélium à la base du pied, mais l’absence de sporophores ne signifie pas nécessairement l’absence de mycélium dans le sol. Le sporophore, constitué d’un chapeau et d’un pied, est un organe éphémère où se déroule la reproduction sexuée. Les champignons ectomycorhiziens sont des symbiotes obligatoires qui bouclent leur cycle de développement en fructifiant notamment grâce aux ECMs qu’ils contractent avec la plante hôte. La formation de sporophores requiert la présence d’ECMs. A l’inverse on peut observer des ECMs sans sporophores correspondants. En effet, des champignons comme Thelephora et Cenoccocum forment des ECMs avec peu ou pas de fructifications et sont souvent dominants sur les racines de leurs plantes hôtes (Henkel et al., 2002 ; Diédhiou et al., 2004). La fructification des champignons est un processus complexe et coûteux en énergie pour la plante, qui dépend de l’espèce de champignon, de facteurs climatiques, de l’âge des peuplements et de traitements sylvicoles (fertilisation). La formation de sporophores, difficile à obtenir en conditions contrôlées, dépend du champignon impliqué, de la qualité du substrat, des conditions de culture (humidité, lumière, température) et de la production de métabolites par la plante hôte. Hebeloma cylindrosporum en symbiose avec Pinus pinaster, fructifie in vitro sur un milieu de culture approprié et dans des conditions de lumière et de température bien définies (Débaud & Gay, 1987). Dans les régions boréales et tempérées, de nombreuses communautés de champignons ectomycorhiziens ont été décrites sur la base d’inventaires de sporophores (Ferris et al., 2000). On estime la diversité des champignons ectomycorhiziens entre 10000 et 15000 espèces (Smith & Read, 2008). Ce chiffre n’est pas exhaustif car il ne prend pas en compte la diversité encore peu connue des champignons des régions tropicales. Les champignons sont le plus souvent des Basidiomycota (Amanites, Bolets, Lactaires, Girolles, Russules) et plus rarement des Ascomycota (Cenoccocum, Truffes). Certains d’entre eux sont comestibles et à forte valeur ajoutée (ex. Matsutake, Truffes).
Diversité des ectomycorhizes
L’inventaire des ECMs est aussi une approche qui permet d’accéder à la composition des communautés fongiques (Agerer, 1991). L’identification des ECMs reste cependant très aléatoire du fait qu’elle est basée sur des caractères morphologiques, anatomiques et histologiques. Elle repose notamment sur la couleur et la texture du manteau fongique et sur la présence ou non de cordon mycélien. La couleur du manteau peut changer en fonction de l’environnement ou de l’âge de la plante hôte (Thoen & Bâ, 1989 ; Diédhiou et al., 2004). Les clés d’identification des ECMs proposées jusqu’ici se sont avérées dans l’ensemble insuffisantes pour identifier un champignon à partir d’une ECM à l’exception des ECMs typiques du genre Cenococcum (Agerer, 1991).
Les caractères macroscopiques et microscopiques des ECMs s’avèrent peu concluants pour remonter aux sporophores. Des champignons différents peuvent former des ECMs similaires sur le plan morphologique. De plus, un champignon peut former des ECMs dont la morphologie change selon l’hôte ou quelquefois en fonction de l’âge de l’hôte. L’abondance des sporophores ne donne pas assez d’informations sur la fréquence des ECMs. En effet, des champignons comme Suillus fructifient abondamment et forment peu d’ECMs. À l’inverse, les Thelephora forment jusqu’à 40 % des ECMs en fructifiant peu ou pas (Diédhiou et al., 2010). Il est rarement possible d’observer des connexions entre le mycélium à la base du pied des sporophores et celui des ECMs (Thoen & Bâ, 1989 ; Rivière et al., 2007). L’identification de la composante fongique doit être complétée par des méthodes de biologie moléculaire.
Caractérisation moléculaire de la diversité fongique
Les méthodes moléculaires permettant l’identification de la composante fongique de l’ECM, sont basées sur l’existence d’une variabilité génétique de l’ADNr au sein des espèces de champignons ectomycorhiziens. Différentes techniques de biologie moléculaire (PCR-RFLP, séquençage), basées sur l’analyse de l’ADNr, ont été développées ces dernières années pour étudier la diversité génétique des sporophores, identifier la composante fongique des ECMs et suivre la persistance des souches fongiques introduites en pépinière et en plantation (Gardes et al., 1991 ; Rivière et al., 2007 ; Sanon et al., 2009). La technique PCR (Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaine par Polymérase) est utilisée pour amplifier différentes parties du génome en ayant pour cibles l’ADN total, l’ADNr nucléaire ou l’ADNr mitochondrial. L’ADN total est analysé par des techniques comme l’AFLP (« Amplified Fragment Length Polymorphism »), l’ISSR (« Inter Simple Sequence Repeat »), la RAPD (« Random Amplified Polymorphism DNA ») ou les microsatellites pour accéder au polymorphisme de larges portions d’ADN (Redecker et al., 2001 ; Zhou et al., 2001). L’ADNr mitochondrial possède des entités qui sont en plusieurs copies indépendantes du génome nucléaire et utilisées pour des études sur la structuration des communautés de champignons. Le gène de la grande sous unité de l’ARNr mitochondrial (« mtLSU rRNA ») en particulier le fragment d’environ 450 pb amplifié par les amorces ML5/ML6, est souvent utilisé en phylogénie des champignons ectomycorhiziens (Bruns et al., 1998 ; Rivière et al., 2007). Bien que cette région soit peu évolutive au niveau de l’espèce, elle permet néanmoins de différencier sans ambiguïté les familles voire les genres (p.ex. Russula, Amanita, Cantharellus, Thelephora, Tricholoma). De plus, il existe sur cette région une base de données de plus d’une centaine de séquences référencées dans NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi). L’ADNr nucléaire existe en plusieurs copies (50 à 100 copies par cellule) et se trouve donc déjà préamplifié dans les extraits d’ADN. Il comprend des régions codantes pour les ARNr (18S, 5.8S, 25S et 5S) très conservées au niveau spécifique et des espaceurs intergéniques, soit transcrit (ITS, « Internal Transcribed Spacer »), soit non transcrit (IGS, « Intergenic Spacer »), moins conservés évolutivement. L’espaceur transcrit ITS (ITS1 et ITS2) conjointement amplifié avec le gène 5.8S, est un bon marqueur spécifique, mais très rarement au sein de l’espèce. L’espaceur ITS, d’environ 600 à 1000 pb, est amplifié par des amorces universelles (ITS1/ITS4), spécifiques aux champignons (p.ex. ITS1f/ITS4) ou spécifiques au Basidiomycota (p.ex. ITS1f/ITS4b) (White et al., 1990 ; Gardes et al., 1991). L’amplification de l’ITS est souvent couplée à l’étude du polymorphisme de longueurs des fragments de restriction (RFLP) et son utilisation en identification repose sur le séquençage nucléotidique. Il existe une importante base de données sur les séquences des ITS des champignons dans NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) et UNITE (http://unite.ut.ee/).
Actuellement, la plupart des études d’écologie et de taxonomie moléculaires sur les champignons ectomycorhiziens sont basées sur l’analyse des régions ITS (Tedersoo et al., 2007 ; Sanon et al., 2009).
Introduction des plantes et de leurs symbiotes fongiques
L’introduction de plantes exotiques remonte à l’antiquité avec les déplacements de l’homme pour des activités de chasse et de cueillette. L’introduction de nouvelles espèces végétales s’est énormément accentuée avec l’amélioration des moyens de transport (Jauzen, 1998). Ces introductions ont été soit involontaires ou fortuites (principalement liés au trafic international de marchandises) soit volontaires (du fait de leur valeur ornemental ou utilitaire : alimentaires, médicinales, fourragères etc.) (Di Castri, 1989).
L’introduction d’espèces végétales a été motivée par des finalités utilitaires. C’est ainsi que plusieurs espèces ont été introduites un peu partout dans le monde. En Afrique de l’Ouest et du centre, des espèces de pins (ex. P. caribaea) et d’Eucalyptus ont été introduites pour leur bois (ex. fabrication de patte à papier, bois de chauffe). D’autres ont été également utilisées pour la restauration des sols dégradées ; on peut citer par exemple Acacia mangium, une des essences exotiques les plus plantées en Afrique de l’Ouest particulièrement en Côte d’Ivoire et en Guinée (Galiana et al., 1996). Ces espèces d’intérêt à croissance rapide sont plantées depuis plusieurs années sur des milliers d’hectares par les services forestiers africains pour répondre à la demande en bois et préserver ainsi les forêts naturelles de la pression anthropique. Au Sénégal, les espèces comme E. camaldulensis, C. equisetifolia et C. uvifera sont plantées le long du littoral pour la fixation des dunes mobiles et comme plante d’ornement. Si les plantes exotiques sont souvent les bienvenues, certaines d’entre elles ne sont pas bénéfiques (perte de biodiversité, modification des écosystèmes…) (Lockwood et al., 2007). L’introduction d’espèces dans un milieu entraîne un déséquilibre de l’écosystème naturel ; ainsi celles qui parviennent à s’adapter aux facteurs environnementaux de leurs nouveaux habitats et à se multiplier, peuvent devenir invasives. Selon l’évaluation des écosystèmes pour le millénaire (Millenium Ecosystem Assessment) publiée par les Nations Unies en 2005, les invasions biologiques sont considérées comme la deuxième cause d’érosion de la biodiversité à l’échelle mondiale, après la destruction et la dégradation des habitats naturels. C’est le cas du Mimosa d’hiver (Acacia dealbata) qui est originaire du sud-est de l’Australie et de Tasmanie ; il a été introduit en Angleterre en 1792 pour ses qualités ornementales (Casal et al., 1985) et est cultivé depuis 1841 au Jardin des Plantes de Montpellier.
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Table des matières
INTRODUCTION
Chapitre 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Symbiose mycorhizienne
2. Symbiose ectomycorhizienne
2.1 Diversité des champignons ectomycorhiziens
2.2 Diversité des ectomycorhizes
2.3 Caractérisation moléculaire de la diversité fongique
3. Introduction des plantes et de leurs symbiotes fongiques
4. Coccoloba uvifera (L.)
4.1 Classification et description botanique
4.2 Origine et répartition géographique
4.3 Quelques usages de Coccoloba uvifera
4.4. Les champignons associés à Coccoloba uvifera
Chapitre 2 : MATERIELS ET METHODES
1. Sites d’échantillonnage des graines et sols
2. Graines de C. uvifera
2.1 Observation des spores en microscopie électronique à balayage (MEB)
2.2 Observation de spores en microscopie optique (MO)
2.3 Viabilité des spores de S. bermudense
3. Diversité des champignons ectomycorhiziens des sols d’origine versus sols d’introduction
3.1 Diversité des champignons ectomycorhiziens des sols d’origine
3.2 Diversité et spécificité d’hôtes des champignons ectomycorhiziens des sols d’introduction
4. Morphotypage et conservation des ECMs
5. Caractérisation moléculaire des champignons ectomycorhiziens
5.1 Extraction de l’ADN total
5.2 Amplification de l’ITS par la réaction de polymérase en chaine (PCR)
5.3 Contrôle de l’amplification
5.4 Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l’ITS
5.5 Purification des produits d’amplification de l’ITS pour le séquençage
5.6 Analyse des séquences
6. Analyse statistique
Chapitre 3 : RESULTATS ET DISCUSSION
1. Graines de C. uvifera
1.1. Observation des spores sur les graines
1.2. Viabilité des spores
2. Diversité des champignons ectomycorhiziens des sols d’origine versus sols d’introduction
3. Etude de la spécificité d’hôte de S. bermudense
4. Génotypage des morphotypes
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE
