Diversité bactérienne dans les écosystèmes de la filière viande bovine

Etats physiologiques des bactéries des surfaces

L’état physiologique des micro-organismes est fortement lié aux facteurs physico-chimiques de l’environnement qui peuvent induire des perturbations et créer des lésions membranaires et cellulaires. Ainsi, nous pouvons observer au sein des communautés bactériennes en proportions variables, des bactéries mortes, des bactéries viables cultivables et entre ces deux états physiologiques, des bactéries dites viables non cultivables (VNC). L’état VNC chez les bactéries a été mis en évidence pour la première fois par l’équipe de Rita Colwell en 1981 (Byrd et al., 1991) au cours de travaux visant à évaluer la qualité des eaux côtières de l’état de Maryland. Ceux-ci avaient remarqué des disproportions importantes entre les dénombrements bactériens réalisés par culture sur milieu solide et les dénombrements effectués par observation microscopique.
Actuellement il est admis qu’une cellule ne pouvant être dénombrée sur milieu gélosé classique mais possédant une activité physiologique ou métabolique témoin de sa viabilité est considérée viable non cultivable (Oliver, 2005).
Dans les industries agro-alimentaires, les micro-organismes sont soumis à de multiples agressions (choc chimique, privation nutritionnelle, stress hydrique, pH, basses températures). Ces différents facteurs sont susceptibles d’induire l’entrée en état VNC des cellules. Brightwell et al. (2006) ont pu identifier, à partir de prélèvements de surfaces sur un tapis convoyeur en Intralox®, des Sphingomonas non détectés par des méthodes culture-dépendantes. Peneau et al. (2007) observent lors d’une persistance expérimentale d’un P. fluorescens à 10°C, sur des coupons en céramique soumis à des encrassements répétés et des opérations d’hygiène quotidiennes douces (pas d’action mécanique, dose diminuée de moitié par rapport à celle préconisée dans les industries), qu’il existe de fortes différences entre le nombre d’UFC et le nombre de cellules montrant une activité respiratoire par la réduction du 5-cyano-2,3-ditolyl tétrazolium (CTC). Les travaux d’Alliot (1999) réalisés dans un atelier fromager ont montré que les UFC représentaient de 0,005% à 0,04% du nombre total de bactéries évalué par comptage dans une cellule de Thoma. De plus, de nombreux pathogènes tels que Salmonella enterica ou Listeria monocytogenes sont susceptibles de développer un état VNC. Marouani-Gadri et al. (2010) montrent l’existence d’une proportion de VNC, variable au cours de l’expérience, sur des biofilms d’E. coli O157:H7 soumis quotidiennement à des opérations de nettoyage-désinfection douces dans des conditions environnementales proches de celles présentes dans les ateliers de viande.

Les opérations d’hygiène dans les industries agro-alimentaires

Le nettoyage

En industrie agro-alimentaire, le nettoyage a pour objectif de détacher d’une surface les souillures visibles ou invisibles, formées de molécules organiques, minérales et de particules (notamment de micro-organismes) pouvant s’y trouver. Les surfaces ouvertes (sols des ateliers, tapis convoyeurs…) sont accessibles aux interventions humaines, notamment par l’application d’une action mécanique telle que le brossage, le raclage ou de jets (basse, moyenne ou haute pression). Les surfaces fermées, quant à elles, ne sont pas accessibles et doivent subir un Nettoyage En Place (N.E.P). Il s’agit d’un système automatique de nettoyage des installations : les tuyaux, les vannes, les pompes et cuves sont nettoyés par la circulation d’eau, de détergents et éventuellement de désinfectants. L’action mécanique est dans ce cas due aux forces de cisaillement engendrées par les liquides en mouvement (Benezech et al., 1999). Le détergent idéal devrait présenter les propriétés suivantes (Jaudon, 2000; Moreau, 1993) :
propriété de mouillage des surfaces et des souillures : les tensioactifs entrent en contact avec les souillures et les décollent,
propriété dissolvante : dispersion des particules dans l’eau en les maintenant en suspension, propriété de solubilité : dilution et solubilisation des souillures, propriété émulsifiante : élimination de souillures grasses insolubles par la création d’une émulsion avec l’eau de la solution de nettoyage, propriété de rinçage et de drainage, propriété de non corrosion, propriété de sécurité à la manipulation.
Aucun détergent ne réunit toutes ces propriétés. Le choix d’un détergent efficace paraît donc difficile. Pour s’assurer d’un nettoyage optimal, ce choix doit tenir compte des souillures rencontrées dans les industries .

La désinfection

La directive communautaire n° 98/8/CE met en place un régime d’autorisation de mise sur le marché des produits biocides, famille à laquelle appartiennent les désinfectants, sur le territoire européen. Seuls les produits dont l’efficacité est prouvée et qui ne présentent pas de risques inacceptables pour l’homme, pour les animaux, et pour l’environnement pourront être vendus à l’avenir. Les mesures visent notamment à prévenir les effets cancérogènes et toxiques à long terme. Dans un premier temps, ce sont les substances actives qui sont concernées. On entend par substance active toute substance, micro-organismes, virus ou champignon, exerçant une action générale ou spécifique sur ou contre les organismes nuisibles. La procédure d’évaluation des substances actives se fait au niveau communautaire et conduit à l’inscription ou non de ces substances actives sur des annexes de la Directive 98/8/CE dites « listes positives ». Dans un second temps, seuls les produits biocides contenant des substances actives inscrites sur ces «listes positives» pourront obtenir une autorisation de mise sur le marché au niveau national.
La désinfection a pour objectif de détruire ou d’inactiver tous germes encore présents sur une surface inerte à la suite d’une étape de nettoyage. L’intérêt de l’étape de nettoyage est d’augmenter l’efficacité des produits désinfectants qui peuvent être partiellement neutralisés par la matière organique. Les critères d’un désinfectant idéal sont les suivants (Jaudon, 2000) :
large spectre d’activité, utilisable à faible concentration, action durable,sans danger pour l’utilisateur, ne laisse aucun résidu.
Les principaux produits de désinfection utilisables en industries agro-alimentaires sont : Les halogènes :les composés chlorés: le plus connu est l’hypochlorite de sodium (eau de javel), mais il en existe d’autres (chloramines, acides chlorocyanuriques, …). Les générateurs d’acide hypochloreux sont de très bons bactéricides et virucides. Ces composés sont efficaces sur les spores mais leur activité fongicide est peu marquée (Criquelion et al., 1999). Par contre, ils sont très instables à la chaleur et à la lumière et leur efficacité diminue en présence de matières organiques. Ils sont corrosifs et les émanations gazeuses sont dangereuses pour les muqueuses respiratoires de l’opérateur.
les produits iodés : Ils sont très actifs à faible dose et exhibent un large spectre d’activité (bactéricide, virucide, fongicide et sporicide) et une faible toxicité. Leur emploi est préconisé en milieu acide (pH 3-5) en combinaison avec de l’eau froide (température < 40°C). Les produits iodés ont une utilisation limitée dans les industries. Ils sont instables à la chaleur, se rincent difficilement et laissent des traces de coloration jaunâtre sur les surfaces.
Les oxydes et peroxydes : Ce sont des molécules oxydantes dont la plus fréquente en désinfection est l’acide peracétique qui possède un large spectre d’action à faible concentration. Il agit sur les micro-organismes en modifiant la perméabilité de la membrane cellulaire. La vapeur de l’acide peracétique est caractérisée par sa faible stabilité avec une demi-vie d’environ 20 minutes, donc peu de risque de bioaccumulation. Ce composé est de plus en plus utilisé en entreprises car il est compatible avec beaucoup de matériaux (acier inoxydable, Polychlorure de vinyle PVC, polyéthylène) et a l’avantage d’être peu toxique.
Les ammoniums quaternaires : Stables et non-corrosifs, ce sont des molécules amphiphiles qui agissent comme détergents cationiques. Ils sont largement utilisés pour la désinfection des surfaces ouvertes, notamment lorsque ces dernières ne sont pas adaptés aux désinfectants oxydants. Leur aptitude à mousser les rend intéressants pour leur application sur les surfaces. Les ammoniums quaternaires présentent cependant plusieurs désavantages : ils sont bactéricides mais leur activité virucide et sporicide est faible voire nulle. Pour compenser ce manque, leur association synergique avec des aldéhydes et/ou des phénols est souvent pratiquée. Les souillures protéiques ainsi que la dureté de l’eau réduisent fortement l’efficacité de ces composés.
Les aldéhydes (formaldéhydes et glutaraldéhydes) : Ils provoquent une dénaturation des acides nucléiques et des protéines des micro-organismes. Leur activité diminue en présence d’une solution alcaline. Le formaldéhyde n’est actuellement plus utilisé dans les industries car il est suspecté cancérigène. Le glutaraldéhyde présente un spectre d’activité large. En industries, il est utilisé en association avec des ammoniums quaternaires.

«Résistance» des bactéries aux produits d’hygiène

La « résistance » est un terme fréquemment employé dont la définition fait l’objet de nombreuses discussions, en fonction des domaines d’études impliqués. Selon Cerf et al. (2010), une souche bactérienne est « résistante » à un désinfectant, si la relation temps-concentration nécessaire pour obtenir un certain nombre de réductions décimales est plus importante que celle évaluée dans une population de référence par la même méthode. Ces mêmes auteurs emploient le terme «tolérance» pour désigner la capacité d’un micro-organisme à croître à des concentrations normalement inhibitrices du désinfectant. L’étude des micro-organismes adhérents sur les surfaces a mis en évidence qu’une proportion de ces cellules présentaient une meilleure résistance aux agents antimicrobiens que les cellules en suspension (Carpentier, 2009). Bourion et Cerf (1996) ont montré que la résistance aux désinfectants différait de façon importante selon la nature de la surface, la concentration du désinfectant, la structure et l’âge du biofilm. Par ailleurs, des souches de Pseudomonas aeruginosa sont devenues « tolérantes » aux ammoniums quaternaires après expositions répétées à des concentrations croissantes du produit (Jones et al., 1989; Langsrud et al., 1997).
Une étude menée par Jacquet et al. (1994) montre que Listeria monoctogenes n’était guère plus résistante que d’autres espèces bactériennes à des concentrations bactéricides de désinfectant. Par ailleurs, des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) élevées ont été observées sur des souches de Listeria monocytogenes de sérogroupe 1/2 d’origine alimentaire (4 souches) et environnementale (3 souches) (Mereghetti et al., 2000). Cependant, il n’est guère évoqué si cette «tolérance» est acquise après exposition des souches aux concentrations préconisées par le fabricant. Selon Lelieveld et al. (2003), la «tolérance» peut être liée à une mauvaise utilisation en pratique du désinfectant, c’est-à-dire un non respect par l’utilisateur des conditions d’utilisation (concentration, température, pH, temps de contact…). Ceci a été observé chez des souches de Salmonelles qui sont devenues tolérantes au chlore utilisé à des concentrations inappropriées pour la désinfection de légumineuses (Mokgatla et al., 2002; Zhuang et al., 1995).

Prélèvement des bactéries sur les surfaces

Les prélèvements de surface sont indispensables pour permettre aux industriels de contrôler la contamination des équipements et des locaux afin de valider les opérations d’hygiène appliquées pour l’élimination des bactéries. De nombreuses méthodes d’évaluation de la contamination microbienne sont décrites et sont comparées comme par exemple l’écouvillonnage/chiffonnage, les empreintes par gélose ainsi que les ultrasons.

Méthodes de prélèvement sur terrain

Frottis: Ecouvillon Le frottis est réalisé au moyen d’un écouvillon en coton ou en alginate stérilisé préalablement humidifié avec du neutralisant, de l’eau physiologique, de l’eau peptonnée ou une solution de Ringer 1/4. Pour l’énumération des micro-organismes détachés, un milieu gélosé peut être ensemencé directement par l’écouvillon mais les résultats obtenus par cette technique ne sont pas toujours fiables (Moore et al., 2002). Une autre méthode consiste à placer l’écouvillon dans un volume approprié de diluant qui est agité, ce qui va permettre de désagréger au moins partiellement les microcolonies si elles sont présentes (Gilbert, 1970) mais aussi de faire des dilutions si nécessaire. Une étude menée par Moore et al. (2001) a montré que sur des surfaces humides, l’écouvillon en coton permettait une meilleure récupération des bactéries comparé à l’écouvillon en alginate. En effet, le coton est principalement composé de cellulose, capable d’absorber une plus grande quantité de liquide résiduel sur les surfaces. Chiffonnage :Pour des surfaces supérieures à 100 cm², l’emploi d’une chiffonnette ou d’une éponge contenue dans un sachet stérile et scellé est préconisé. Du neutralisant peut être ajouté dans la chiffonnette pour éviter un effet inhibiteur du désinfectant qui peut éventuellement être encore présent sur les surfaces. Après échantillonnage de la surface à analyser, du diluant est ajouté au sachet qui est traité dans un homogénéisateur péristaltique. Des boîtes de milieux de culture sont ensuite ensemencées avec la suspension mère et ses dilutions puis incubées pendant la durée et à la température appropriées.
Une étude comparative menée par Deberghes et al. (1995) a montré que 79% des dénombrements obtenus à partir des prélèvements à l’éponge étaient supérieurs à ceux obtenus à partir de prélèvements à l’écouvillon. En effet, l’éponge ou la chiffonnette, en raison de leur bonne préhension et leur grande capacité d’absorption, sont efficaces pour l’échantillonnage des grandes surfaces, l’écouvillon restant irremplaçable pour les prélèvements effectués dans des recoins ou à l’intérieur d’appareils. Cette technique est difficile à standardiser car on ne contrôle ni la force appliquée pour le frottement ni l’angle entre la surface contaminée et l’écouvillon (Gonzales, 1995). Empreintes par application d’une gélose :Les empreintes des surfaces sont effectuées par application d’une gélose sur la surface. Une gélose nutritive est coulée dan une boîte de type RODAC® ou ATL® . Le volume coulé doit être légèrement supérieur à celui de la boîte de façon à obtenir un ménisque bombé permettant le contact de la gélose avec la surface à analyser. Cependant, cette méthode présente plusieurs inconvénients :
Le nombre réel de micro-organismes est sous-estimé, Le nombre de colonies obtenues sur la boîte doit être inférieur à 200, Les empreintes par gélose ne peuvent pas s’appliquer sur des surfaces non planes. D’après la norme NF ISO 18593 , les empreintes gélosées nécessitent un temps de contact de 10 secondes avec la surface à analyser et une pression telle que celle exercée par une masse de 500 g (Anonyme, 2004). Gonzales (1995) a montré une meilleure récupération des micro-organismes avec un temps de contact d’une minute. Actuellement, des applicateurs pour boîte contact de type ATL® conformes à la norme NF ISO 14698-1 (Anonyme, 1999) en vigueur sur les prélèvements de surface en agroalimentaire permettent de standardiser les prélèvements microbiologiques. Le principe consiste à clipser une boîte contact sur l’applicateur et à appliquer le milieu gélosé sur la surface à contrôler. Une pression est exercée sur le dessus de l’applicateur provoquant le clignotement d’un LED lumineux pendant 10 secondes. A son extinction, l’applicateur est retiré et le couvercle remis immédiatement sur la boîte. Les géloses sont ensuite incubées à la température optimale des bactéries recherchées puis les colonies dénombrées.
Les empreintes de surfaces peuvent aussi s’effectuer par application d’une lame gélosée ou de Pétrifilms®. Les lames gélosées consistent en un support rectangulaire dont les deux faces sont recouvertes d’une gélose nutritive choisie en fonction du type de micro-organisme à dénombrer. Les Pétrifilms® sont constitués de deux membranes entre lesquelles se trouve un film rigide quadrillé qui sert de support à un milieu gélifié approprié. Le film supérieur des Pétrifilms® est appliqué sur les surfaces contaminées en évitant tout contact du film inférieur avec cette même surface. Les Pétrifilms® sont ensuite incubés et les micro-organismes se développent entre les deux films.

Méthodes de prélèvement au laboratoire : cas des ultrasons

Les ultrasons sont des ondes mécaniques de pression ayant une fréquence supérieure à la plage de fréquences audibles par l’homme. Quand elles se propagent dans un milieu liquide à travers une alternance de compression-dépression, des microbulles se forment : c’est ce qu’on appelle la cavitation (Boistier-Marquis et al., 1999). Le traitement par les ultrasons consiste à immerger des échantillons de surfaces contaminées dans des flacons remplis de solution (comme par exemple de l’eau peptonnée). Ces flacons sont mis dans des bains de sonication qui fonctionnent à une haute fréquence (18-55KHz) (Jeng et al., 1990). Une étude menée par Oulahal et al. (2000) sur des coupons en acier inoxydable a montré que le détachement d’un biofilm traité par une sonotrode à 40 KHz (200W) pendant 10 secondes était quatre fois plus important que le détachement obtenu par écouvillonnage. De plus, il a été montré un effet bénéfique des ultrasons couplés à des composés enzymatiques et des agents chélateurs sur le détachement de biofilms d’E. coli et de S. aureus (Oulahal et al., 2006). Masurovsky et al. (1960) ont testé les ultrasons sur divers matériaux utilisés au contact du lait, souillés avec des suspensions de Staphylococcus aureus. Leur conclusion est que l’efficacité des ultrasons dépend de la concentration en germes, de l’état des surfaces et de la durée d’action des ultrasons. Puleo et al. (1967) ont testé l’efficacité des ultrasons sur des surfaces d’acier et de verre naturellement et/ou artificiellement contaminées par des spores
de Bacillus subtilis. Leurs résultats montrent que l’exposition de ces échantillons à l’énergie des ultrasons dans de bonnes conditions (surfaces contaminées trempées dans un fluide de rinçage froid et placées au fond du bain à ultrason, face contaminée vers la source d’énergie) est une bonne méthode pour détacher les bactéries des surfaces ou des écouvillons par comparaison à une agitation mécanique. Asséré et al. (2008) montrent un effet létal des ultrasons sur des biofilms de Pseudomonas fluorescens et de Leuconostoc mesenteroïdes à 28 KHz (150W) pendant 10 minutes. En revanche, un traitement de 4 minutes avec le même équipement apparaît comme le meilleur traitement pour détacher les bactéries sans les tuer.

Identification bactérienne avec culture préalable

Les méthodes phénotypiques

Avant l’apparition des premiers outils biochimiques et moléculaires, la classification des germes s’est longtemps basée sur de simples éléments morphologiques comme la taille, la forme ou encore le regroupement des cellules bactériennes. Sur boîte de Petri, on observe ainsi le diamètre, le contour, la hauteur et la couleur des colonies. L’ensemble des critères morphologiques offre alors un outil d’identification relativement pertinent et suffisant dans de nombreuses applications ce qui permet souvent de restreindre l’identification à quelques espèces particulièrement en diagnostic clinique des pathogènes. En 1884, une nouvelle dimension à l’identification par microscopie est apportée par le bactériologiste Hans Christian Gram. Ce dernier met au point le protocole de la coloration Gram qui va permettre de classer les bactéries en fonction des propriétés de leur paroi. Outre les critères morphologiques de base des différentes familles de micro-organismes, des critères biochimiques (métabolisme fermentatif ou oxydatif, utilisation des hydrates de carbones, présence ou non d’une enzyme particulière) sont utilisés pour discriminer genres et espèces. Le développement de systèmes d’identification biochimiques (exemple API, BioMérieux, Craponne, France) liés à une banque de données disponible sur Internet a permis d’optimiser les tests d’identification. Cependant, beaucoup de bactéries isolées de matières première (viande, lait) ou d’aliments transformés, restent mal identifiées par les galeries d’identification parce qu’elles sont fastidieuses (bactéries à croissance lente), rares ou nouvellement décrites et donc absentes des thésaurus des galeries (Wilhelm et al., 2005). D’autres techniques phénotypiques peuvent être utilisées pour distinguer les espèces de certaines familles.
Il s’agit notamment de l’analyse des acides gras phospholipidiques (AGPL) des parois bactériennes. Kozdrój et al. (2001) ont étudié la composition de la communauté bactérienne d’une échantillon de sol ainsi que les conditions environnementales qui y règnent (température, diversité des sources de carbone, salinité) par une analyse de la distribution des types d’acides gras présents.

Séquençage de L’ADNr 16S

Le développement des techniques de biologie moléculaire a permis une révision complète de la phylogénie des organismes vivants. Les nouvelles classifications phylogénétiques des bactéries sont donc basées sur des critères de proximité génétique et non plus sur des critères phénotypiques. L’ADN ribosomique 16S (ADNr 16S), qui code l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) reste la molécule la mieux renseignée dans les bases de données de séquences nucléotidiques et la plus employée dans la phylogénie bactérienne (Amann et al., 1995; Cho et al., 2006; Chun et al., 2007). D’une longueur de 1500 paires de bases (pb), elle est ubiquiste chez toutes les bactéries et il ne semble pas exister de transferts latéraux de gènes d’ADNr 16S entre micro-organismes. Elle possède une structure en mosaïque, composée de 9 régions hypervariables et de 10 régions conservées . De ces régions conservées peuvent être extraits des amorces ou sondes dites «universelles». Les régions hypervariables offrent des possibilités d’amorçages spécifiques d’un taxon donné. La base de données Ribosomal Database Project 10 (RDP 10) qui contient plus d’un million de séquences alignées d’ADNr 16S a été réalisée à partir de séquences de souches bactériennes isolées ou de clones de l’ADNr 16S. Des souches bactériennes appartiendront au même genre si leurs séquences d’ADNr 16S possèdent un degré de similitude supérieur à 97% et à la même espèce si le degré de similitude est de 99% (Drancourt et al., 2000).
Bien que l’ADNr 16S reste la molécule la mieux renseignée dans les bases de données de séquences nucléotidiques et la plus employée pour l’identification bactérienne, cependant plusieurs auteurs ont cherché à remplacer cette molécule par d’autres séquences. Certains auteurs ont préféré ainsi utiliser des gènes codant pour des protéines et non des ARNs ribosomiques. Leur argument est que les ARNs ribosomiques, qui par définition ne sont pas traduits, souffrent d’un important taux d’insertion et délétion qui rend l’alignement des séquences difficile. Ainsi, Jawad et al. (1998) proposent le gène recA, Watanabe et al. (2001) le gène gyrB, Giammarino et al. (2005) le gène SodA et Mollet et al. (1997) le gène rpoB. Ce dernier est utilisé pour discriminer certaines espèces dans des genres bien précis tels Corynebacterium (Khamis et al., 2004),
Leptospira (Scola et al., 2006) ou Staphylococcus (Drancourt et al., 2002). De même, l’étude de la famille des Enterobacteriaceae peut être facilitée comme le rapporte Mollet et al. en 1997. Par ailleurs, l’ADN cible pour les champignons est l’ADNr 18S (Wilhelm et al., 2005). Des régions non codantes peuvent aussi être utilisées dans les approches phylogénétiques. C’est ce que démontrent Forsman et al. (1997) avec l’espace intergénique existant entre les gènes des ARNr 16S et 23S. García-Martínez et al (2001) proposent leur propre base de données sur ces séquences.

Table des matières

I- INTRODUCTION
II- ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A. Bactéries des surfaces
1. Diversité bactérienne dans les écosystèmes de la filière viande bovine
2. Etats physiologiques des bactéries des surfaces
3. Evaluation de la viabilité cellulaire
3.1. Les méthodes utilisant la microscopie ou la cytométrie en flux
3.2. Les méthodes moléculaires
4. Les opérations d’hygiène dans les industries agro-alimentaires
4.1. Le nettoyage
4.2. La désinfection
4.3. Les opérations d’hygiène dans les industries
4.4. Efficacité des procédures d’hygiène
5. «Résistance» des bactéries aux produits d’hygiène
B. Méthodes appliquées à l’étude des bactéries des surfaces
1. Prélèvement des bactéries sur les surfaces
1.1. Méthodes de prélèvement sur terrain
1.1.1. Frottis
a- Ecouvillon
b- Chiffonnage
1.1.2. Empreintes par application d’une gélose
1.2. Méthodes de prélèvement au laboratoire : cas des ultrasons
2. Quantification bactérienne
2.1. Par culture
2.2. Sans culture : PCR en temps réel
2.2.1. Nature exponentielle de la réaction PCR
2.2.2. Efficacité d’amplification
2.2.3. Les systèmes de détection
a- Les agents intercalant : cas du SYBR®-Green
b- Les sondes fluorescentes
2.2.4. Applications et limites
3. Identification bactérienne avec culture préalable
3.1. Les méthodes phénotypiques
3.2. Séquençage de L’ADNr 16S
4. Identification d’écosystèmes complexes sans culture préalable
4.1. Les inventaires moléculaires
4.2. Suivi et caractérisation des communautés bactériennes complexes
4.2.1. L’électrophorèse sur gel dénaturant
4.2.2. Autres méthodes d’étude des communautés bactériennes complexes
4.3. Et la métagénomique ?
5. Analyse du polymorphisme de l’ADN
5.1. Polymorphisme inter séquences répétées ou rep-PCR
5.2. Autres méthodes de typage
5.2.1. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
5.2.2. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
5.2.3. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
III- MATERIEL ET METHODES
A. Procédure de N-D menée dans l’atelier de découpe
B. Prélèvements
1. Prélèvements de surface par chiffonnages
2. Prélèvement de surface par empreintes gélosées
3. Prélèvements d’air
C. Détermination des populations microbiennes à partir des prélèvements par chiffonnage
1. Traitement des chiffonnettes
2. Dénombrement des UFC
3. Evaluation des populations totales et viables des surfaces
3.1. Incorporation de l’EMA dans les cellules
3.2. Extraction de l’ADN
3.3. Quantification des cellules totales et viables par PCR en temps réel
3.4. Evaluation de la population bactérienne
3.5. Analyses statistiques
D. Isolement des bactéries et conservation des isolats
E. Identification des bactéries par séquençage de l’ADNr 16S
1. Extraction de l’ADN par la technique FTA®
2. Amplification de l’ADNr 16S des isolats par PCR classique
2.1. Lavage de la membrane FTA®
2.2. Choix des amorces d’amplification de l’ADNr 16S
2.3. Réactions d’amplifications
2.4. Migration des amplicons sur gel d’agarose et dosage par fluorimétrie
3. Séquençage de l’ADNr 16S
F. Identification-caractérisation des souches de Pseudomonas, Staphylococcus et Acinetobacter
1. Typage moléculaire des souches de Pseudomonas, Staphylococcus et Acinetobacter
2. Identification des souches de Staphylococcus à l’espèce par hybridation sur membrane
G. Etude de l’écosystème des surfaces inertes par la méthode DGGE
1. « Poolage » de l’ADN des différentes chiffonnettes
2. Amplification de l’ADNr 16S et de la région V3
3. Préparation du gel, électrophorèse et révélation du gel
4. Analyse du gel par Bionumerics
5. Séquençage des bandes
IV- RESULTATS ET DISCUSSION
A. Quantification des bactéries de surfaces
1. Avant-propos
2. Résultats
2.1. Populations des surfaces avant N-D
2.2. Efficacité des opérations d’hygiène
2.3. Evaluation des forces d’adhésion des cellules bactériennes
2.4. Quantification de la charge bactérienne cultivable aéroportée
2.5. Empreintes gélosées après N-D
3. Discussion
4. Conclusion
B. Etude de l’écosystème bactérien cultivable des surfaces
1. Avant-propos
2. Résultats
2.1. Evolution de l’écosystème au cours des trois campagnes
2.2. Effet du N-D sur le nombre moyen d’isolats / gabarit
2.3. Effet du matériau sur la diversité des genres
2.4. Diversité bactérienne de la flore aéroportée cultivable
2.5. Typage des genres Staphylococcus, Pseudomonas et Acinetobacter par rep-PCR
3. Discussion
4. Conclusion
C. Etude de l’écosystème des surfaces sans culture préalable
1. Avant-propos
2. Résultats
3. Discussion
4. Conclusion
V- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
VI- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VII- ANNEXES

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