Soutenance mémoire
Histoire des communautés adhérentes
Les archées et les bactéries sont estimées à 1.2×1030 cellules dont les principaux habitats sont le sous-sol océanique profond (4×1029), les sédiments océaniques supérieurs (5×1028), le sous-sol continental profond (3×1029), le sol (3×1029) et les océans (1×1029) (Fig.2) . Malgré ces estimations récentes qui évaluent cette présence bactérienne à 95% de la biomasse totale de la biosphère terrestre3 10 11, le monde bactérien n’est pas facilement visible par l’Homme. 40 à 80% des micro-organismes se trouvent dans la nature sous forme de communautés bactériennes adhérentes dites « biofilms bactériens ». C’est le mode de vie privilégié des bactéries dans la nature. Parmi ces biofilms, certains sont parfois si développés qu’il est possible de les voir à l’œil nu sans avoir besoin de matériels scientifiques sophistiqués. Les plus fameux sont les biofilms extrêmophiles, du parc national de Yellowstone aux USA (Fig.3). Pendant des décennies, l’existence des micro-organismes était ignorée. Au XVI siècle, les premières hypothèses de leur existence sont apportées par l’italien Girolamo Fracastoro (1483-1553), mais sans preuves concrètes. C’est au XVII siècle (1632-1723) qu’Anthony van Leeuwenhoek, un scientifique pionnier danois né à Delft, aux Pays-Bas, a pu observer des micro-organismes grâce à son microscope primitif. Plus précisément il a réussi à observer des biofilms. C’est à partir d’un échantillon de sa salive et plaques dentaires qu’il a décrit des « animalcules ». Ensuite Robert Hooke (1635-1703) a confirmé cette découverte ce qui a anéanti les théories admises à cette époque sur la génération spontanée des organismes. Au XIX siècle (1822-1895), en observant que des agrégats de bactéries étaient la cause de la transformation du vin en acide acétique12, Louis Pasteur démontra l’existence des microorganismes dans son mémoire sur la fermentation acétique. C’est là où la microbiologie débutera, entrainant le développement exponentiel des connaissances et des applications. Dans un premier temps, les microbiologistes se sont focalisés sur les micro-organismes en suspension planctonique. À ce stade les communautés adhérentes de micro-organismes dites ensuite « biofilm » n’ont pas suscité de grand intérêt de l’époque. Seule la filière de « biofouling » marine s’intéressait à ce mode de vie bactérien. La fixation et la croissance subséquente d’un assemblage très varié de micro-organismes à l’interface solide-eau telles que les coques des navires et d’autres structures marines immergées causent des dégâts économiques très importants (Fig.4). Ce phénomène est connu sous le nom d’encrassement ou fouling.. Zones typiquement sensibles à l’encrassement biologique sur un navire. La terminologie « film » dans le terme « biofilm » —— désigne l’adhérence et l’agrégation sur les surfaces ; il a d’abord été utilisé en microbiologie marine pour distinguer les bactéries attachées des planctoniques (1933-1935)15. En effet c’est en 1923 que le département de la marine des États-Unis, prend conscience que la boue sur la coque des navires est constituée principalement de bactéries adhérentes 16 13. Ce processus est alors étudié dans l’eau douce par Henrici, à l’aide d’un microscope. Il met en évidence l’attachement bactérien aux surfaces: “it is quite evident that for the most part water bacteria are not free floating organisms, but grow attached upon submerged surfaces” . Ses observations sont soutenues par de ZoBell & Allen13 quand ils démontrent que l’encrassement biologique est initié par des bactéries se développant en biofilm et que ces films favorisent la fixation ultérieure d’autres micro-organismes, voire d’organismes macroscopiques. Les biofilms sont alors aussi mal connus par la sphère médicale. L’évènement déclenchant l’intérêt du monde médical pour ce sujet se produit quand l’étiologie découvre un lien entre des infections chroniques et des agrégats de bactéries. Entre 1970-1972, des examens microscopiques répétés ont été effectués sur des échantillons de crachat de patients atteints de mucoviscidose (CF) et présentant aussi une infection pulmonaire chronique à Pseudomonas aeruginosa. Entre 1974-1978, les échantillons ont été prélevés à partir des poumons dans le cadre des autopsies de patients atteints de mucoviscidose (CF) et dont la cause de décès était l’infection pulmonaire chronique à Pseudomonas aeruginosa16 17. Par ailleurs, à la même période, Costerton commence à mettre en évidence au laboratoire l’importance de l’organisation en biofilm. Quelques années plus tard, avec son groupe, il publie des observations par microscopie électronique de microcolonies de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons d’un patient atteint de mucoviscidose (1980)18. Costerton accomplit un pas déterminant pour le concept de « biofilm » dans le domaine de la microbiologie médicale en 1978 19, en démontrant la résistance collective accrue de ces consortia aux antibiotiques comparée à celle des bactéries à l’état planctonique. Cette découverte a déclenché et catalysé l’intérêt de la communauté scientifique pour ces objets. Progressivement le mot ‘biofilm’ a été accepté comme la désignation la plus adéquate pour ces communautés. Le nombre de publications sur les biofilms a progressivement augmenté entre 1981 et 1996 quand Costerton a organisé la première conférence biofilm ASM à Snowbird, Utah, USA. À l’époque Costerton a donné des conférences et des cours dans tout le monde entier sur les biofilms et les infections causées, il a également initié des collaborations avec des scientifiques de différentes spécialités ainsi qu’avec des industriels16. Il a ainsi ouvert la voie à la compréhension générale, en médecine, du concept d’infection par biofilm, notamment en ce qui concerne les infections chroniques et les infections par corps étranger, par exemple sur les dispositifs médicaux. En conclusion l’existence des agrégats de bactéries enrobés dans une matrice et adhérents aux surfaces ou localisés dans des tissus est historique. En revanche, le concept des infections par les biofilms et son importance dans la médecine et l’étude des maladies chroniques date d’environ un demi-siècle. Depuis il a été confirmé que les maladies causées par des biofilms sont très fréquentes et qu’il est crucial de mieux les comprendre pour à la fois les prévenir et guérir.
Biofilm et écologie
Présents dans tous les environnements, les biofilms colonisent toutes les niches de la biosphère. Le plus souvent inoffensifs, ils jouent un rôle écologique capital et contribuent très largement au bon fonctionnement de la plupart des écosystèmes. Ces communautés adhérentes sont impliquées dans tous les cycles biogéochimiques. Elles jouent un rôle primordial dans le cycle de carbone 20 21 22 et font partie des cycles du soufre et de l’azote aux fonds de l’océan. Les biofilms participent activement à la fixation du carbone et l’oxydation anaérobie du méthane dans les sédiments anoxiques comme le montrent Boetius et al. Ces communautés microbiennes jouent aussi un rôle important dans l’oxygénation des océans et de l’atmosphère. Les bactéries ont été les premiers organismes à produire de l’oxygène (cyanobactéries) sur la surface terrestre en utilisant l’énergie solaire pour la photosynthèse3 . On cite l’exemple de la source géothermique de Yellowstone, avec ses nuances arc-en-ciel provenant du biofilm de cyanobactéries de plusieurs centimètres d’épaisseur (Fig.3). Ces communautés adhérentes sont donc d’une grande importance pour la vie sur la surface de la Terre. Les processus microbiens assurés par les biofilms sont aussi à la base de la dégradation et de l’élimination des contaminants souterrains contribuant ainsi à la purification et la bioremédiation naturelles de l’eau. Ils préservent les réserves d’eau souterraine non seulement en dégradant la matière organique, mais aussi en retenant les métaux. Par exemple, la méthylation du mercure est très majoritairement due à l’activité de microorganismes anaérobies présents dans les zones anoxiques de la colonne d’eau d’environnements marins ou de sédiments. Dans les sédiments océaniques supérieurs, les bactéries adhérentes peuvent agir comme colle pour les microparticules, ce qui augmente la taille moyenne des particules sédimentaires et altère leur transport et leur localisation. Les biofilms influencent donc fortement la texture et la stabilité des sédiments. Les biofilms sont aussi impliqués dans les processus climatiques planétaires et participent au cycle de l’eau. Un nombre important de micro-organismes est présent dans l’atmosphère avec une répartition qui varie considérablement en fonction de l’altitude, de l’emplacement (zones agricoles, en haute mer ou côtières) et la force du vent. Cette présence peut affecter la formation des nuages et les précipitations3 . Ces communautés attachées colonisatrices, peuvent se développer associées à des surfaces minérales, végétales ou animales (muqueuses, surfaces dentaires …) impactant ainsi la faune et la flore. Les plantes hébergent un large éventail de bactéries sur ou dans leurs racines (rhizosphère), leurs vaisseaux de transport, leurs tiges et leurs feuilles (phyllosphère) majoritairement sous forme de biofilms.
Matrice extracellulaire : composition et propriétés physiques
Ce qui fait d’un biofilm une structure tridimensionnelle, ce sont les biopolymères autoproduits dits substances polymériques extracellulaires (EPS) dans lesquels sont intégrés et se divisent les micro-organismes. Si les biofilms sont considérés comme une communauté, les EPS peuvent métaphoriquement être considérées comme « la maison des cellules du biofilm ». Elle détermine les conditions de vie des cellules vivant dans ce microenvironnement. La matrice extracellulaire est bien plus qu’une simple « colle » pour les biofilms. Il s’agit d’un réseau assurant la stabilité mécanique du biofilm par le maintien des cellules, en leur offrant un arrangement spatial sur une période prolongée. C’est un système hautement sophistiqué, qui confère des caractéristiques particulières. La matrice extracellulaire forme une barrière protectrice, qui protège les cellules en biofilm contre plusieurs menaces (par exemple les bactériophages, les amibes et certains bactéricides conventionnels comme les antibiotiques ainsi que les rayonnements ultraviolets) 43. Elle facilite l’accès aux nutriments en interagissant avec l’environnement grâce à ses propriétés de sorption qui permettent de séquestrer les substances dissoutes dans le micro-environnement. Elle contrôle la teneur en eau, la charge, la porosité, et la densité. La structure biofilm est par conséquent largement déterminée par ce matériau. Les EPS peuvent varier considérablement entre les biofilms, en fonction des microorganismes qui les composent et de l’environnement (flux, température et disponibilité des nutriments, etc..). Les EPS comprennent, en plus des polysaccharides, une grande variété de protéines, de glycoprotéines et de glycolipides et, dans la plupart des cas, des quantités surprenantes d’ADN extracellulaire, qui contribuent aussi aux propriétés mécaniques. Les polysaccharides sont de longues molécules, linéaires ou ramifiées, qui s’attachent à la surface des cellules. L’alginate par exemple est le composé le mieux étudié dans les biofilms Pseudomonas aeruginosa. Il est capable de retenir des protéines extracellulaires telles que les enzymes, ce qui permet maintenir leur activité dans le biofilm et d’assurer une dégradation efficace de différentes matières. La cellulose fait partie des polysaccharides très répandus dans les biofilms. Elle influence la structure des biofilms, et est également importante dans les processus infectieux dans E.coli. Malgré les avancées scientifiques récentes, l’établissement d’un profil complet de la composition de la matrice extracellulaire reste un défi et c’est ce qui a donné à la matrice la dénomination de « dark matter of biofilms ».
Biofilm multiespèces : Propriétés émergentes et interactions
Dans la nature les biofilms sont dans la plupart des cas des multiespèces. La présence fréquente de micro-organismes d’espèces différentes au sein d’un même biofilm constitue un niveau supplémentaire d’hétérogénéité biologique, mais aussi d’interactions interespèces 9 33 (Fig.11). Les propriétés émergentes spécifiques dans ces systèmes multiespèces 64 33 sont en relation étroite avec les interactions interespèces. Les études ont démontré qu’une résistance renforcée peut être liée à des interactions synergiques en multiespèces en comparaison avec les mono-espèces64 65 . D’ailleurs, récemment, Lee et al. 65 ont mis en évidence une résistance collective renforcée à la tobramycine et au dodécylsulfate de sodium (SDS) dans une communauté multiespèces de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas protegens et Klebsiella pneumonia. Suite à son exposition aux biocides, et malgré les différences de niveaux de tolérance des espèces présentes, la composition du biofilm est restée stable ainsi que les proportions en nombre de cellules de chaque espèce. De même, les infections chroniques multiespèces, présente une résistance accrue, la gravité de l’infection peut également être accrue 66 64 67. Une étude récente a démontré in vivo que la cicatrisation d’une plaie était retardée lorsqu’elle était infectée par un biofilm multiespèces de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. Elles façonnent les hétérogénéités dans les biofilms multiespèces. L’écologie des communautés de biofilms composées de quelques à de nombreuses espèces est complexe et les diverses activités et processus sont souvent liés, s’affectant mutuellement à travers l’espace et les générations. Des hétérogénéités sont créées et influencées par le développement de la communauté. Des niches et des distributions spatiales distinctes de cellules se développent et sont soutenues par des gradients et la formation de matrice. La façon dont les membres de la communauté interagissent dépend donc largement de la localisation spatiale dans la structure du biofilm. La figure met en évidence l’hétérogénéité des biofilms multiespèces et une sélection des multiples facteurs qui peuvent compliquer l’analyse des communautés de biofilms. Les interactions interespèces peuvent par ailleurs, imposées une distribution spatiale non aléatoire d’un biofilm64 68. Un exemple d’organisation spatiale au sein d’une co-infection a été fourni par Fazli et al69, où il a été constaté que les souches de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus présentes dans la même plaie chronique forment des clusters disjoints. D’ailleurs, les biofilms présentent un environnement particulièrement adapté à des phénomènes d’interactions spécifiques tels que le transfert horizontal des gènes THG » et le « quorum sensing QS », grâce à la forte densité bactérienne offrant un contact cellule cellule. Le transfert horizontal des gènes peut dans certains cas favoriser la formation de biofilm70, dans d’autres non. Quant au QS, il a été démontré dans plusieurs cas qu’il joue un rôle important dans le développement de la structure et la maturation des biofilms multiespèces 72 73. Les interactions interespèces sont dans la plupart des cas bénéfiques aux biofilms, et pouvant être classées en plusieurs catégories74 70 (Fig.12).
– Le parasitisme, quand une ou plusieurs espèces profitent de l’ensemble des avantages fournis par le reste de la communauté, sans y participer
– La coopération, quand le bénéfice et partagé mutuellement. Dans certains cas ça implique toute la population dans d’autres cas c’est entre seulement quelques espèces.
– Et la compétition, quand c’est particulièrement néfaste pour certaines espèces et profitable à d’autres, comme les phénomènes de répression et d’élimination de certaines espèces pour l’occupation de plus d’espace par d’autres. Ces phénomènes peuvent être observés entre deux ou plusieurs espèces75 73. Les interactions des bactéries des biofilms multiespèces peuvent aussi être soit directes et spécifiques (interactions physiques cellule-cellule), également appelées co-agrégations, sont bien décrites pour les bactéries formant des biofilms dans la cavité buccale64 76. Dans ce cas, la succession des biofilms bactériens est étroitement contrôlée par des interactions récepteurs-ligands associées à la surface cellulaire. La co-agrégation entraîne souvent des niveaux accrus de formation de biofilms multiespèces. Comme elles peuvent être indirectes en favorisant la croissance ou la présence de certaines espèces par d’autres (coopération et/ou parasitisme) telles que le co-métabolisme ou la syntrophie, où une espèce se nourrit du sous-produit de l’autre. Hansen et al. 77 ont montré que dans un biofilm multiespèces composé de Pseudomonas putida et d’Acinetobacter sp. cultivés sur de l’alcool benzylique Acinetobacter transforme l’alcool benzylique en benzoate, qui est métabolisé par Pseudomonas putida. Suite à cette coexistence, la biomasse totale du biofilm augmentait.
Sondes et mesures de l’oxygène en biofilm
La difficulté d’étudier l’oxygène dans les biofilms est d’abord technique, celle de pouvoir mesurer sa concentration in situ sur une base spatio-temporelle sans perturber le biofilm. En effet, les mécanismes émergent la plupart du temps de la mise en évidence des comportements cinétiques. Jusqu’à présent, les deux principales familles de mesures de l’O2 dans les biofilms sont d’une part les mesures impliquant l’utilisation de microélectrodes et d’autres par les mesures optiques faisant intervenir des sondes fluorescentes bloquées dans des couches minces sur lesquelles on fait croitre le biofilm.
Microélectrodes : Cette technique est intéressante, mais peu flexible et invasive. Cette technique repose sur des mesures ponctuelles ce qui rend sa résolution spatiale limitée et l’acquisition des profils d’oxygène dissous à l’intérieur des biofilms extrêmement fastidieuse et imprécise. Récemment, le groupe de Marvin whiteley95 a proposé une mesure spatiale des niveaux d’O2 au-dessus d’un biofilm en temps réel à l’échelle du micron. Ils ont développé une version dite ‘ultramicro-éléctrode’, pour quantifier les gradients d’O2 adjacents à la surface d’un biofilm de Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste dont la physiologie et son comportement sont fortement influencés par la disponibilité de l’O2. Leurs résultats révèlent la production d’une zone hypoxique qui s’étend sur des centaines de microns à partir de la surface du biofilm en quelques minutes. Cette ultra-microélectrode (UME) est en platine ayant un diamètre de 10µm.
Méthodes optiques : Le principe de mesure repose sur l’extinction de fluorescence d’un indicateur luminescent par O2. Les indicateurs d’O2 les plus fréquemment utilisés sont soit des complexes à base de ruthénium, soit des complexes de métalloporphyrine. L’intensité de la luminescence et la durée de vie de la luminescence sont dynamiquement éteintes par l’oxygène. Le processus est entièrement réversible et ne consomme pas d’O2. La détection optique de l’O2 a été introduite en microbiologie aquatique, lorsque des microcapteurs à fibre optique ont été développés. Les indicateurs sensibles à l’oxygène peuvent être soit immobilisés dans une matrice polymère qui est fixée à l’extrémité d’une fibre optique (micro-optodes) ou étalée sur une feuille de support transparente (optodes planaires). Les optodes O2 planaires ont principalement été fabriquées sous forme de couches de 10 à 50 µm d’épaisseur sur une feuille de polyester transparent98 99 96. Cependant, cela limite la résolution spatiale, car le matériau du capteur lui-même peut agir comme un tampon d’oxygène. Ultérieurement, des capteurs transparents d’O2 planaires « ultrafins » ont été développés par une équipe à l’université de Copenhague93. Leur méthode consiste à appliquer un revêtement par centrifugation (<1 à 2 µm) de couches ultrafines d’indicateurs optiques immobilisées (d’un complexe cyclométallique d’iridium (III) coumarine hautement luminescente dans du polystyrène) sur des lamelles de verre, pour des études dans un système de « biofilm flow chamber ». Dans certains cas cette technique peut être efficace, mais elle est peu flexible et ne permet d’étudier qu’un plan. De plus, l’immobilisation peut affecter le comportement de l’indicateur luminescent (Extinction de luminescence non idéale). Au sein de l’équipe de A. Libchaber, Carine Douarche a développé une méthode en utilisant un indicateur fluorescent (dichlorure de Ruthénium-tris(4,7-diphényl-1,10- phénanthroline) (Ru(dpp))) dont la mesure de l’intensité permet la quantification de la pO2 . L’indicateur en question est une molécule organométallique (maximum d’émission ∼ 615 nm) éteinte par l’oxygène, permettant une mesure directe de la concentration d’O2 dans l’échantillon. Cependant cette molécule est hautement toxique pour les bactéries. La stratégie était d’encapsuler la molécule dans des micelles de phospholipides, rendant le colorant biologiquement inerte et non invasif, tout en conservant sa sensibilité à l’oxygène. Dans le présent travail, nous combinons l’utilisation de cet indicateur fluorescent avec l’excitation par une nappe laser pour atteindre une description spatiale 3D de la distribution de l’O2. Une technique flexible, non invasive, et efficace pour des mesures en biofilm.
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Table des matières
Introduction
Chap. 1. Etat de l’Art des biofilms bactériens,Système d’étude & Objectifs
I. Etude bibliographique
1. Histoire des communautés adhérentes
2. Biofilms dans la nature
3. Mécanismes de formation
4. Propriétés spécifiques du biofilm
5. L’oxygène dans le biofilm
6. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy: FLIM
II. Modèle d’étude
1. Présentation du modèle
2. Mécanismes de formation
III. Objectifs et Stratégies
Chap. 2. Matériels, méthodes et développements instrumentaux
I. Souches, milieux et cultures
1. Souches
2. Fluorescence dans les biofilms et construction de souches ‘FAST’
3. Milieux & cultures
II. Cytométrie en flux
III. Croissance bactérienne en multi-plaques (Tecan)
IV. Dispositif milli-fluidique : Formation du biofilm.
V. FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
1. Principe de la mesure fréquentielle
2. Mesure dans le biofilm : Détails techniques
VI. Dispositif experimental
1. Contrôle de température et de l’O2
2. Microscope
3. Montage électronique
4. Montage optique – Nappe Laser
VII. Mesure de la concentration en O2
1. Principe de l’utilisation des micelles de ruthénium (MiRu)
2. Préparation des micelles de ruthénium (Adaptation de la sonde pour la mesure en biofilm)
3. Calibration de la sonde
VIII. Microscopie épifluorescence
IX. Automatisation des acquisitions des données de temps de vie de fluorescence
Chap. 3. Transferts de l’oxygène dans un canal milli-fluidique sous flux
I. Caractérisation des dynamiques d’échange d’oxygène en régime stationnaire (sans flux)
1. Variation de l’oxygène environnemental en cuve ouverte
2. Variation de l’O2 environnemental en canal de PDMS en absence de flux
II. Apport du flux en Oxygène
Chap. 4. Suivie de la distribution spatio-temporelle de l’O2 d’un biofilm bactérien multi-espèces en cours de développement
I. Mise en place de la mesure
II. Distribution spatio-temporelle 3D de l’O2 d’un biofilm bactérien
1. Gradients d’O2 au cours du temps
2. Distributions spatio-temporelles comparées du biofilm 4S et de l’oxygène dans le canal
III. Profils spatio-temporels individuels
1. Biofilm de Bt mono-espèce
2. Biofilm de Pf mono-espèce
IV. Conclusion
Chap. 5. Colonisation de la communauté adhérente bactérienne 4 espèces par un cinquième élément, E. coli
Conclusion générale et perspectives
Bibliographie
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