Distribution du système prophénoloxydase, des lysozymes et des inhibiteurs de protéases dans les tissus de la seiche commune Sepia officinalis

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Présentation du projet CHRONEXPO

Dans un contexte européen d’échange de compétences et de connaissances scientifiques entre la France et le Royaume-Uni, le projet CHRONEXPO INTERREG IV-A a été mis en place afin d’étudier l’impact de divers polluants d’origine anthropique retrouvés en Manche sur les stades juvéniles de divers organismes marins d’intérêt. L’un des principaux objectifs de ce projet était de réaliser des expositions aux contaminants dans des conditions réalistes, c’est-à-dire à des concentrations proches de celles retrouvées dans le milieu naturel et sur une durée cohérente avec les temps pendant lesquels les organismes sont exposés dans la nature. Ce projet regroupait cinq partenaires en France et au Royaume-Uni : l’université de Caen, l’Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN) de Cherbourg, les universités de Plymouth et Portsmouth, et le Centre des Sciences de l’Environnement, de la Pêche et de l’Aquaculture (Cefas) de Weymouth. Au sein de ces structures, l’impact de contaminants de natures diverses (métaux, radionucléides, pesticides) sur diﬀérentes espèces d’invertébrés marins d’intérêt économique et/ou écologique a été étudié (Fig. 1.1).
Le zinc (Zn) a été désigné en début de programme comme contaminant à étudier par chacun des acteurs. Ainsi, nous avons choisi d’analyser uniquement l’eﬀet de cet élément sur les juvéniles de seiche, mais de travailler sur un grand nombre de biomarqueurs potentiels.

Le zinc

Généralités

Le Zn est un élément trace métallique de numéro atomique 30 et de masse molaire 65,38 g mol-1. Comme tout élément trace métallique, c’est un bon conducteur de chaleur et d’élec-tricité qui présente sous forme solide une malléabilité utilisée depuis l’Antiquité pour la réa-lisation d’alliages (e.g. laiton, bronze). C’est le 27ème élément le plus abondant de la croûte terrestre où il est principalement trouvé sous forme de sphalérite (ZnS, ou blende). Il est par conséquent naturellement présent dans le sol, l’air et l’eau de notre planète.
Dans l’eau de mer, les ions dissous des éléments traces sont répartis entre les ions libres et ceux formant des complexes avec diﬀérents ligands, organiques ou inorganiques. Les ions libres (i.e. hydratés) sont couramment considérés comme étant la forme dissoute disponible pour être accumulée, autrement appelée la fraction biodisponible (Rainbow, 1995; Rainbow et al., 1993). Cette biodisponibilité varie en fonction de l’élément étudié, mais aussi en fonction de paramètres tels que le pH, la salinité et la concentration en matière organique dissoute (MOD) (Rainbow, 1995; Hogstrand, 2012). En absence de cette dernière (i.e. MOD), le Zn sous sa forme hydratée (i.e. Zn(OH)2) est la forme de Zn dissous majoritairement présente en eau de mer (i.e. à une salinité > 30 psu et un pH > 8), ce qui le rend particulièrement biodisponible pour les organismes marins (Hogstrand, 2012; Rainbow, 1995).

Principales fonctions

Le Zn est essentiel pour la croissance, le développement et la diﬀérenciation des micro-organismes, des plantes et des animaux (Vallee, 1986). Cet élément, impliqué donc dans de nombreuses fonctions biologiques, est la plupart du temps associé à des protéines. A ce jour, plus de 300 métalloenzymes à Zn ont été décrites, appartenant aux six classes d’enzymes : oxydo-réductases, transférases, hydrolases, lyases, isomérases et ligases. Dans la majorité des cas, l’ion Zn2+ est un cofacteur indispensable au bon fonctionnement de ces métalloenzymes. Il peut jouer un rôle catalytique (e.g. anhydrases carboniques, carboxypeptidases, phospha-tases alcalines), co-catalytique (e.g. phospholipase C, nucléase P1, leucyl-aminopeptidase) ou structurel (e.g. aspartate carbamoyltransferase, doigts de zinc).
Les éléments traces peuvent être classés en fonction de leur aﬃnité de liaison à certains ions/ligands pour former un complexe. Ainsi, les éléments traces de classe A (e.g. Ca2+, Mg2+) vont préférentiellement se lier à l’atome d’oxygène, puis à l’azote, et présenteront une aﬃnité moins importante pour le soufre. Les éléments traces de classe B (e.g. Ag+, Hg2+) ont une aﬃnité inverse pour ces trois éléments (i.e. S > N > O), tandis que les éléments traces de transition (e.g. Cd2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+) sont ambivalents et se lient indiﬀéremment à l’un ou l’autre de ces atomes (Niebœr et Richardson, 1980). Ces propriétés chimiques des éléments traces jouent un rôle fondamental dans leur répartition à l’intérieur de l’organisme et permettent de mieux appréhender les processus de détoxication mis en place pour les réguler. En tant qu’élément trace de transition, les sites de liaison coordonnant le Zn au sein des protéines peuvent être l’azote de l’histidine, l’oxygène de l’aspartate ou du glutamate, et le soufre de la cystéine (la liaison à l’histidine étant la plus couramment observée, suivie de la liaison à la cystéine ; McCall et al., 2000).
Contrairement aux autres éléments traces de transition de la première ligne du tableau périodique (i.e. Cr2+, Mn 2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+), l’ion Zn2+ a son orbitale d pleine (d10). C’est par conséquent un ion stable, qui fonctionne comme un acide de Lewis acceptant les électrons par paire, ce qui en fait un cofacteur idéal des réactions qui demandent un ion stable en tant que catalyseur. Il a été montré que cette propriété de liaison rend le Zn nécessaire à la réalisation de processus fondamentaux tels que la synthèse d’ADN et d’ARN, la division cellulaire et le bon fonctionnement du système immunitaire. Il intervient également dans la structure et le fonctionnement des membranes (Ploysangam et al., 1997; Shankar et Prasad, 1998; Dempsey, 2013; Bettger et O’Dell, 1981). Par ailleurs, le Zn exerce de façon indirecte une protection antioxydante, d’une part en induisant la synthèse de composés réducteurs comme les métallothionéines (MTs), d’autre part en tant que composant d’enzymes de régulation du stress oxydatif comme la superoxyde dismutase (SOD), et enfin en inhibant ou limitant l’activité de producteurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) comme la NADPH oxydase et certains ions métalliques (i.e. Fe2+, Cu2+) (O’Dell, 2000; Bray et Bettger, 1990; Cai et al., 1999).

Toxicité et réglementation en milieu aquatique

Les activités anthropiques contribuent à enrichir le milieu naturel en Zn. En France, mal-gré la fermeture des dernières mines d’extraction au début des années 1990, de nombreuses sources de rejet de cet élément persistent. En 2010, les secteurs industriels principalement concernés étaient la sidérurgie, la métallurgie et le coke (variété de charbon) qui émettent un peu plus de 700 tonnes de Zn (et ses composés) par an, dont environ 50 % dans les sols, 30 % dans les eaux et 20 % dans l’atmosphère. Bien que moins importants, les rejets d’ori-gines urbaines (e.g. trafic routier, incinération d’ordures) et agricoles (alimentation porcine, engrais) restent significatifs (IREP, 2010). Des analyses en milieu aquatique montrent que le Zn fait partie des composés toujours détectés et présents à des concentrations supérieures à 10 µg L-1 en entrée et en sortie de stations d’épuration (INERIS, 2010). Mis à part ces rejets, le Zn est introduit directement en milieu marin par la dissolution d’anodes sacrificielles et par certaines peintures antisalissures, qui visent à prévenir la corrosion (Alzieu et al., 1999; Mottin et al., 2012). Cet élément trace est mesuré à des concentrations importantes dans le milieu marin, pouvant dépasser le milligramme dans certains cas extrêmes (Amado Filho et al., 1997; Liu et Wang, 2013; Srinivasa Reddy et al., 2005). En Manche, il est souvent retrouvé sous forme dissoute à des concentrations proches de la dizaine de microgrammes, ce qui en fait l’un des éléments dissous les plus concentrés de cette masse d’eau (Lachambre et Fisson, 2007c; Sheahan et al., 2007).
Comme tous les éléments traces essentiels, le Zn présent en trop grande quantité induit des eﬀets délétères à des seuils diﬀérents en fonction des organismes. En milieu aquatique, la plupart des études décrivant les mécanismes de toxicité induits par le Zn ont été réalisées sur des poissons d’eau douce. Elles ont mis en évidence que la cause première d’intoxication associée à cet élément était liée à une perturbation de l’homéostasie du calcium. En eﬀet, les ions Zn2+ sont capables d’imiter les ions Ca2+ et d’entrer dans l’organisme en empruntant les canaux calciques des cellules branchiales, ce qui entraîne une hypocalcémie (par inhibition compétitive). En conditions aigües, ce phénomène se traduit au niveau des branchies, qui sont donc les premiers organes aﬀectés, par des dégradations fonctionnelles et structurelles impor-tantes (e.g. hypersécrétion, hypertrophie, hyperplasie) conduisant à l’asphyxie (Hogstrand, 2012; Hughes et Barritt, 1989; Ballatori, 2002). En milieu marin, la majorité des LC50s (i.e. concentrations induisant 50 % de mortalité) issues d’études sur des poissons et bivalves marins adultes, exposés 96 h à du Zn, est comprise entre 1 et 10 mg Zn L-1 (e.g. Ciji et Bijoy Nandan, 2014; Malik et al., 1998; Spear, 1981; Amiard-Triquet et al., 1986; Chan, 1988; Franco et al., 2006). Bien que plusieurs études en milieu marin aient mis en évidence des modifications de la vitesse de croissance, du taux de reproduction et du développement larvaire de nombreux invertébrés à des concentrations oscillant entre 50 et 500 µg L-1 (King et al., 2006; Hook et Fisher, 2002; Sarabia et al., 2008; Brereton et al., 1973; Martin et al., 1981; Fathallah et al., 2010; Nadella et al., 2013; Tellis et al., 2014; Watling, 1982; Calabrese et al., 1973; Calabrese et Nelson, 1974; Jorge et Moreira, 2005), peu d’entre elles ont décrit l’origine des perturbations observées (Hogstrand, 2012; Tellis et al., 2014). Alors que le Zn ne semble pas aﬀecter diﬀéremment les stades de développement des téléostéens, les seuils de toxicité du Zn mesurés chez des invertébrés sont plus élevés pour les stades adultes que pour les stades larvaires (e.g. Tellis et al., 2014; Hogstrand, 2012; Fathallah et al., 2010).

Le système digestif de Sepia oﬃcinalis

Les céphalopodes étant en grande majorité des carnivores macrophages, leur mode de nutrition se distingue de celui des autres mollusques. D’une part, les morceaux de proies avalés contiennent très souvent des fragments squelettiques ; d’autre part, leur mode de vie très actif nécessite la consommation de grandes quantités de nourriture. Les particularités de la structure et du fonctionnement de l’appareil digestif des céphalopodes découlent de ces caractéristiques (Mangold et Bidder, 1989b).
Le système digestif des céphalopodes est en forme de U (Fig. 1.6). Il commence au niveau d’un bulbe buccal situé au centre de la couronne brachiale et est principalement composé de deux puissantes mandibules (renfermant une radula), et de muscles lui conférant une mobilité importante. Les orifices des glandes salivaires antérieures et postérieures débouchent dans la cavité buccale. Bien que les principales fonctions des sécrétions salivaires soient indéniable-ment l’aide à la consommation de la proie, via des molécules paralysantes et/ou lysant les tissus externes et internes avant l’ingestion, le rôle précis des composés contenus dans les glandes salivaires reste peu connu (Kanda et al., 2003; Nagai, 2012; Ueda et al., 2008; Fry et al., 2009; Undheim et al., 2010; Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983).
La cavité buccale est prolongée par l’œsophage qui permet d’amener le bol alimentaire à l’estomac, dont les parois musculeuses réalisent un broyage mécanique, associé à l’action d’enzymes sécrétées par la glande digestive (digestion extracellulaire), l’estomac ayant une faible capacité sécrétrice (Boucaud-Camou, 1973). Une fois cette étape réalisée, le bol ali-mentaire passe dans le cæcum où se prolonge l’action des enzymes et débute l’assimilation des éléments digérés. L’intestin sert principalement à récupérer les débris non dégradés afin de les évacuer en fin de digestion. Tout au long de ces étapes, la glande digestive sécrète des enzymes vers l’estomac et le cæcum via les canaux digestifs (Mangold et Bidder, 1989b). Ces canaux, bordés par les appendices de la glande digestive, servent également de voie pour la remontée du bol alimentaire vers la glande digestive et les appendices de la glande digestive (Boucaud-Camou, 1973; Yim et Boucaud-Camou, 1980; Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983). Ces derniers ont pour rôle principal l’assimilation des petites molécules issues de la digestion extracellulaire pour la distribution dans l’organisme (Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983; Perrin, 2004). Ils sont également impliqués dans l’osmorégulation via l’ab-sorption de sels et d’eau (Wells et Wells, 1989; Schipp et von Boletzky, 1976). La glande digestive, qui est l’organe de synthèse de la majorité des enzymes digestives, est également le siège de l’assimilation d’une partie des nutriments issus de la digestion extracellulaire ainsi que celui d’une digestion intracellulaire par endocytose d’une partie du bol alimentaire (Boucaud-Camou et al., 1985; Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983; Boucaud-Camou et Yim, 1980). Contrairement aux appendices de la glande digestive, les nutriments assimilés par la glande digestive sont réutilisés pour son propre métabolisme (Boucaud-Camou et Yim, 1980).

La glande digestive de Sepia oﬃcinalis et sa maturation

La glande digestive de la seiche est composée de tubules, formés par un épithélium unis-tratifié, qui se rejoignent dans de larges lumières pour déboucher dans les canaux de la glande digestive (Fig. 1.7). Ces tubules sont bordés d’une fine couche de tissus conjonctifs et muscu-laires richement vascularisés (Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983). Cet organe possède une structure histologique complexe, variant assez largement suivant le stade de digestion, l’âge de l’animal, et probablement d’autres facteurs encore indéterminés (Boucaud-Camou, 1973; Yim et Boucaud-Camou, 1980). Chez les céphalopodes, la glande digestive joue un rôle important dans les processus digestifs tels que la production de la plupart des enzymes digestives ainsi que le stockage de nutriments et de lipides, mais aussi dans la détoxication, le stockage et l’excrétion de certains composés toxiques (Boucaud-Camou et Roper, 1995; Martínez et al., 2011; Costa et al., 2014). Il a longtemps été admis qu’un type cellulaire, présent sous diﬀérentes formes, était à l’origine de ces multiples fonctions (Boucaud-Camou et Boucher-Rodoni, 1983; Yim et Boucaud-Camou, 1980). Récemment, une étude histolo-gique approfondie de cet organe a proposé une classification en trois types cellulaires : les cellules digestives (ou cellules à boules), les cellules excrétrices et les cellules basales (Fig. 1.7). Les premières, correspondant aux cellules décrites jusqu’à présent, assurent la sécrétion d’enzymes, l’excrétion des produits de la digestion et de certains métaux comme le Fe, l’ab-sorption, le stockage de lipides et de polysaccharides ; les secondes ont un rôle d’excrétion de sels (non représentées) ; et les troisièmes sont impliquées dans le renouvellement des deux premières, ainsi que dans la détoxication, le stockage et l’excrétion de certains éléments traces (Fig. 1.7 ; Costa et al., 2014).
Une des particularités du processus de digestion des céphalopodes est la simultanéité d’une digestion extracellulaire assurée par des enzymes fonctionnant à un pH alcalin, avec une digestion intracellulaire ayant lieu à pH acide. Cette caractéristique confère aux céphalopodes leur potentiel de croissance considérable (Costa et al., 2014).
La maturation de la glande digestive se déroule pendant les premières semaines suivant l’éclosion du juvénile (i.e. entre trois et quatre semaines en fonction des conditions), et corres-pond à une phase de multiplication intense des cellules suivie d’une phase de diﬀérenciation cellulaire (Yim et Boucaud-Camou, 1980). En eﬀet, à la naissance, la glande digestive du juvénile est composée de deux petites masses de cellules indiﬀérenciées accolées à un vitellus interne qui sera consommé dans les premiers jours suivant l’éclosion, simultanément à la phase de multiplication cellulaire. Ce vitellus est assimilé via des processus de digestion intracellulaire acide. La phase de diﬀérenciation cellulaire est initiée par la première prise alimentaire et se traduit par la mise en place progressive de la digestion extracellulaire alca-line. Ce processus va se développer jusqu’à ce que la maturation de la glande digestive soit complète (Yim et Boucaud-Camou, 1980; Boucaud-Camou et al., 1985). La digestion intra-cellulaire, quant à elle, est présente et se maintient au niveau de la glande digestive pendant toute la vie de l’animal. Lorsqu’elles sont pleinement fonctionnelles, les cellules digestives de la glande digestive présentent de nombreuses vésicules, d’au moins deux types : des vésicules servant au stockage des enzymes alcalines, excrétées au cours de la digestion, et des lysosomes contenant des enzymes acides qui participent à la digestion intracellulaire (Boucaud-Camou et Yim, 1980; Costa et al., 2014).

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Table des matières

I Introduction
1 Introduction
1.1 Contexte et présentation du projet CHRONEXPO
1.1.1 Contexte scientifique
1.1.2 Présentation du projet CHRONEXPO
1.2 Le zinc .
1.2.1 Généralités .
1.2.2 Principales fonctions
1.2.3 Toxicité et réglementation en milieu aquatique
1.3 Le modèle biologique : la seiche commune
Sepia officinalis .
1.3.1 Généralités .
1.3.2 Le système digestif de Sepia officinalis
1.3.3 Le système circulatoire et l’immunité des céphalopodes
1.3.4 Rappel des connaissances concernant l’écotoxicologie des éléments traces chez la seiche .
1.4 Objectifs de l’étude et organisation du manuscrit
II Distribution du système prophénoloxydase, des lysozymes et des inhibiteurs de protéases dans les tissus de la seiche commune Sepia officinalis
2 Prophenoloxidase system, lysozyme and protease inhibitor distribution in the common cuttlefish Sepia officinalis
2.1 Introduction .
2.2 Material and methods .
2.2.1 Animals and tissue samples
2.2.2 Chemicals .
2.2.3 Enzyme extraction .
2.2.4 Biochemical analysis .
2.2.5 Statistical analysis .
2.3 Results and discussion .
2.3.1 APO- and PO-like activity distribution and potential functions
2.3.2 Lysozyme distribution
2.3.3 PI distribution .
III Etude des effets d’expositions prolongées au zinc sur la physiologie du stade juvénile de la seiche commune Sepia officinalis au cours de sa vie côtière
3 Physiological perturbations in juvenile cuttlefish Sepia officinalis induced by subchronic exposure to dissolved Zn
3.1 Introduction .
3.2 Materials and methods
3.2.1 Animals
3.2.2 Experimental design
3.2.3 Predatory behavior study
3.2.4 Enzymatic assays
3.2.5 Chemicals
3.2.6 Statistical analysis
3.3 Results .
3.3.1 Zn measurements in seawater
3.3.2 Mortality .
3.3.3 Predation behavior .
3.3.4 Enzymatic responses to Zn exposure in juvenile
3.3.5 Zn exposure impacts on juvenile cuttlefish growth
3.4 Discussion .
3.4.1 Mortality .
3.4.2 Predatory behavior impairment
3.4.3 Digestive system perturbations
3.4.4 Immune system perturbations
3.4.5 Growth loss induced by Zn exposures
3.5 Conclusions .
4 Metal homeostasis in the juvenile cuttlefish Sepia officinalis and consequences of dissolved zinc exposure
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Animals
4.2.2 Experimental design
4.2.3 Subcellular fractionation and MT determination
4.2.4 Trace element analysis in respective soluble and insoluble fractions
4.2.5 Biochemical analysis
4.2.6 Statistical analysis
4.3 Results
4.3.1 Trace metal homeostasis in juvenile cuttlefi
4.3.2 Zn exposures
4.4 Discussion .
4.4.1 Metal homeostasis in juvenile cuttlefish
4.4.2 Zn exposures .
5 Essais et limites d’une contamination trophique
5.1 Choix de la proie .
5.2 Description de l’espèce choisie
5.3 Description du système d’élevage
5.3.1 Structure d’élevage .
5.3.2 Conditions d’élevage .
5.3.3 Suivis .
5.3.4 Bilan concernant l’élevage de N. integer
5.4 Contamination au Zn de Neomysis integer
5.4.1 Résultats et discussion
5.4.2 Bilan et perspectives
IV Caractérisation des hémocytes de Sepia officinalis et développement de leur culture primaire dans le but de réaliser des tests de toxicité in vitro 1
6 Hemocyte morphology and phagocytic activity in the common cuttlefish (Sepia officinalis)
6.1 Introduction .
6.2 Material and methods .
6.2.1 Animals .
6.2.2 Hemolymph collection .
6.2.3 Chemicals .
6.2.4 Morphological characterization of S. officinalis Hcs
6.2.5 Biochemical analysis .
6.2.6 Flow cytometry (FCM) analysis
6.2.7 Data analysis .
6.3 Results and Discussion .
6.3.1 Hc viability and concentration
6.3.2 Hc identification and characterization
6.3.3 Enzymatic assays .
6.3.4 FCM analysis .
6.4 Conclusions .
7 Développement et utilisation des hémocytes de seiche en conditions in vitro pour des études en écotoxicologie
7.1 Introduction .
7.2 Matériels et méthodes .
7.2.1 Prélèvement d’hémolymphe et mise en culture
7.2.2 Effet des paramètres de culture sur la viabilité
7.2.3 Effet des paramètres de culture sur la viabilité
7.2.4 Analyse des données .
7.3 Résultats et discussion
7.3.1 Effet du milieu de culture et de la température
7.3.2 Effet du Cd et du Zn sur la phagocytose et la production de ROS .
V Conclusion générale – perspectives
8 Conclusion générale – perspectives
8.1 Effets du Zn sur le stade juvénile de S. officinalis
8.2 Caractérisation des hémocytes de S. officinalis et développement de leur culture primaire .
Références bibliographiques