Différentes méthodes d’études de l’activité antioxydante

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Techniques de plantation

Le semis est très aléatoire. L’ombrage est indispensable dans les premiers mois de la croissance.
La multiplication par racines ou la reproduction par drageons peuvent être des méthodes pour la régénération de l’arbre (Gautier, 2002).

Travaux antérieurs sur la Chimie

• Des études phytochimiques ont permis de caractériser dans l’extrait de racine lyophilisé de  Stereospermun kunthianum, le groupement naphta quinone et l’anthraquinone en quantité importante (Sanogo et al., 2006)
• Le criblage phytochimique de la poudre de l’écorce de la tige de S. kunthianum a révélé la présence d’alcaloïdes, de tanins, de saponines, de dérivés anthracéniques et des sucres réducteurs (Ching et al., 2009).
• Le screening phytochimique préliminaire de l’extrait de feuilles de Stereospermum kunthianum a révélé la présence de stérols, de coumarines, d’acides gras supérieurs et l’absence de d’aglycones flavoniques et d’alcaloïdes (Aliyu et al., 2009).
• Compaoré et al., (2011) révèlent la présence dans l’extrait acétonique de l’écorce de tige de Stereospermum kunthianum : de rutine, d’ isoquercétine, de quercétine, de lutéoline et des acides férulique et p-coumarique.

Activités pharmacologiques

Activités antalgique et anti-inflammatoire

L’activité analgésique des extraits de feuilles et d’écorces a été déterminée par l’évolution de l’inhibition de la douleur provoquée par l’acide acétique et l’activité anti-inflammatoire a été testée par l’inhibition de l’œdème induit par la caraghénine dans la patte, chez des souris. Le paracétamol et l’indométacine ont été utilisés comme des médicaments de référence. La meilleure activité analgésique a été obtenue avec les feuilles avec une inhibition de 84 % (Sanogo et al., 2006).

Activité anticonvulsivante

Ching et al. (2009) ont montré que l’extrait aqueux d’écorces de tiges de Stereospermum kunthianum possède une activité anticonvulsivante.
L’extrait administré par voie intrapéritoniale (200-400 mg/kg) protège 57,69% et 84,6% respectivement des rats contre les crises induites par l’électrochoc.

Activité anti diarrhéique

D’après Ching et al., (2009), Stereospermum kunthianum possède une activité anti-diarrhéique dose dépendante.
Les résultats ont montré que l’extrait, aux doses utilisées, a entraîné une réduction importante de la diarrhée induite chez les souris par l’huile de ricin.
La meilleure activité est obtenue à la dose de 400 mg/kg.

Activité in vivo de cicatrisation

Tsala et al.(2016) ont étudié l’activité cicatrisant de Stereospermum kunthianum. L’activité de guérison a été évaluée chez des rats en suivant l’effet des extraits et de la référence (dexaméthasone) sur une incision de dimension précise, effectuée sur la peau de l’animal.
Les plaies traitées par les extraits de Stereospermum kunthianum se sont révélées épithalisées plus rapidement que celle des rats témoins traités par la référence (dexaméthasone).

Activité antibactérienne

L’extrait de feuilles de S.kunthianum possède une activité antibactérienne (Aliyu et al., 2009). En effet, ces derniers ont testé l’activité des feuilles sur les souches bactériennes suivantes : Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp et Aeromonas hydrophila en utilisant une gélose diffusion. La meilleure activité a été trouvé à 30 mg.ml-1 avec des diamètres d’inhibition de 35 mm pour S. aureus, 28 mm pour Klebsiella spp et A. hydrophila. La plus faible inhibition a été obtenue avec P.aeruginosa avec un diamètre d’inhibition de 9 mm.

Usages ethnobotaniques

Les écorces et les racines entre fréquemment dans des préparations destinées aux traitements internes et externes de la syphilis primaire et de la lèpre.
Stereospermun kunthianum est aussi prescrit sans adjuvant pour les états nauséeux et fébriles, les ulcères de l’estomac (macéré ou décocté de racines en boisson) et pour les ulcères phagédéniques sous forme de poudre en usage externe.
Chez les sérères du sine – Saloum, l’écorce de S.kunthianum, très amère, est utilisée comme vermifuge avec Heeria insignis ou comme contre poison avec Parkia biglobosa.
Les peuls et toucouleurs recommandent les feuilles et les racines pour les maladies des voies respiratoires et les gastrites.
Chez les guérisseurs des groupes mandés, la racine est considérée comme un puissant diurétique, qui justifie leur utilisation dans l’anurie, la blennorragie, la bilharziose.
En usage externe les bains avec les macérés de feuilles sont recommandés comme défatigant. Dans le Sénégal oriental le décocte d’écorces du tronc est utilisée dans les toux rebelles, les bronchites et les pneumonies.
Etant donné le nom de « yatu demeu » (bâton de sorcière) donné par les wolof S. kunthianum, ils lui reconnaissent une puissance magique particulière dans les cas de possession pour délivrer les individus poursuivis par les mangeurs d’âmes (Kerharo, 1974).
Au Benin, S. kunthianum est utilisé en cas de colique, de constipation dans ce cas c’est le décocté des feuilles mélangées aux fruits d’Aframomum melegueta qui est administré par voie oral. Elle est associée aux feuilles de Strychnos innocua en cas de vertige.
En cas d’hyperthermie, les écorces de tige de S. kunthianum pulvérisées sont humectées et déposées sur le corps du bébé le soir au coucher.
Les écorces de racines de Stereospermum kunthianum en association avec celles d’Annona senegalensis et de Trichila emetica sont aussi utilisées en cas d’envenimation (morsure de serpent) (Adjanohoun et al., 1989).
Diverses parties morphologiques de Stereospermum kunthianum sont utilisés en médecine traditionnelle au Nigeria pour traiter un éventail de maladies humaines. Les gousses sont mâchées avec du sel pour traiter la lèpre, les éruptions cutanées et les maladies vénériennes. Les rameaux sont mâchés pour nettoyer les dents et traiter les douleurs dentaires (Ching et al., 2009).
L’écorce de la tige de Stereospermum kunthianum, avec de l’alginate de sodium et du chlorure de calcium, donnent un bon matériau bio-absorbant qui est utilisé pour l’élimination du plomb, du cadmium et du chrome, dans les solutions aqueuses (Osemeahon et al., 2015).

Etudes sur la toxicité

Des travaux de toxicité aigüe sur S. kunthianum ont été effectués chez des rats de 110 g à 130 g et chez des souris de 20 g à 25 g.
Aucun décès n’a été enregistré même après administration de la dose la plus élevée de 8 g/kg durant une période d’observation de 14 jours (Ching et al., 2009).

Rappel sur des radicaux libres

Définition du stress oxydatif

Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant (comme le montre la figure 5) est la conséquence d’un déséquilibre entre la production de radicaux libres et leur destruction par des systèmes de défenses antioxydantes. Les radicaux libres peuvent engendrer des dommages importants sur la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant de nombreuses cibles : les protéines, les lipides et acides nucléiques. Les radicaux libres sont une forme particulière d’espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possède un électron célibataire (ou non apparié) (Soares et al., 2005).
Les principales espèces réactives sont consignées dans le tableau II avec leur formule chimique.

Origines des radicaux libres

Origine interne

La naissance de radical libre se fait de façon suivante : 5% de l’oxygène que nous inspirons se transforme en un dangereux radical libre appelé (anion super oxyde). En effet, pour fournir de l’énergie à partir des aliments que nous ingérons, nos cellules font intervenir une série de réactions au cours desquelles un électron passe d’une molécule à l’autre, formant une espèce de courant électrique. Une fois sur vingt environ, cet électron échappe à son transporteur pour se coller à l’oxygène, le transformant en super oxyde (Haleng et al., 2007). Le précurseur des EOR, l’anion super oxyde O2.- peut provenir de plusieurs sources cellulaires. Il est formé après réduction du dioxygène O2 par un électron et en présence d’un cofacteur NADPH. Cet anion est très instable et peut traverser la membrane plasmique (Ndiaye, 2016). Les différentes enzymes permettant cette réaction sont : la NADPH oxydase, xanthine oxydase, les cyclo-oxygénases ou COX, les lipo-oxygénases, les nitric oxyde synthases (NOS), les enzymes du réticulum endoplasmique lisse (cytochrome P450) et celles de la chaine transport des électrons dans la mitochondrie (Cai et al., 2000).
L’auto-oxydation des molécules telles que la dopamine, l’adrénaline, les flavines et les hydroquinones est une importante source d’EOR (Freeman et Crapo., 1981). Le produit direct de ses auto-oxydations est souvent l’O2.. Ainsi, l’auto-oxydation de la dopamine est en partie impliquée dans le processus apoptotique lors des pathologies neurodégénératives, notamment lors de la maladie de Parkinson (Thannickal & Fanburg, 2000).
La xanthine oxydase catalyse la dégradation de l’hypoxanthine en acide urique en condition de forte demande d’ATP et de déficit en oxygène. Mais elle peut également catalyser l’oxydation de la xanthine en acide urique, notamment lors d’une ischémie-reperfusion ou hypoxie. Dans cette réaction, l’oxygène moléculaire agit comme un accepteur d’électrons produisant ainsi l’O2- (Mckelvey et al., 1988 ; Parks et al., 1988).
La NADPH oxydase joue un rôle fondamental dans la réponse immunitaire et plus précisément dans la lutte contre les microorganismes (Babior, 1999). En effet, lors de la phagocytose, cette enzyme présente dans la membrane plasmique des phagocytes, catalyse la formation d’O2- (Krause, 2004 ) .
Le réticulum endoplasmique lisse contient des enzymes qui catalysent une série de réaction pour détoxifier les molécules liposolubles et d’autres produits métaboliques toxiques (Freeman et al., 1983 ; Turrens et al., 1982). La plus connue de ces enzymes est le cytochrome P450 qui oxyde les acides gras insaturés et les xénobiotiques, produisant ainsi des EOR (Morel et al., 1999).
Les peroxysomes sont une importante source de production de peroxyde d’hydrogène (H2O2) cellulaire (Boveris et al., 1972). Toutefois, H2O2 est utilisé comme substrat de la catalase péroxysomale (enzyme antioxydant) afin de réaliser des réactions de peroxydation d’autres substrats. Ces réactions sont importantes dans le processus de détoxification présentes dans le foie et le rein. Seule une faible quantité d’H2O2 produit au niveau du peroxysome pourrait échapper à la catalase (Balaban et al., 2005).

Origine externe

Les radicaux libres de source externe sont extrêmement nombreux et variés.
– La respiration : elle absorbe de l’oxygène rejette du gaz carbonique et des radicaux libres.
– La pollution automobile : les citadins ont dans leur sang ou dans leur poumon des niveaux de RL supérieur à ceux des campagnards.
– La pollution industrielle : responsable d’une plus grande concentration de toxiques dans l’atmosphère.
– L’exposition à la pollution atmosphérique (hydrocarbures), aux métaux lourd (cadmium, chrome, plomb, manganèse, mercure), aux xénobiotiques présents dans ou à proximité de notre alimentation (insecticides, pesticides phtalates) (Methorst et al., 2014).
– Le soleil : la lumière réfléchie lors d’une exposition sur la plage, au bord de la piscine etc. peut doubler la quantité du rayonnement reçue par la peau (Rafal et al., 2004).
– Le tabagisme, la consommation d’alcool etc.

Action sur les substances biologiques

Les liaisons d’oxygène qui présentent des électrons non appariés tendent à arracher des électrons à d’autres molécules ou atomes. Certes, près de 80% des radicaux sont capturés dans des mitochondries par la superoxyde dismutase. Mais le reste arrive intacte dans le cytosol des cellules. Une fois dans le cytosol, les radicaux libres interagissent avec d’autres liaisons et, en leur arrachant des électrons, parviennent à former de nouveaux. Il s’en suit donc une réaction en chaine au cours de la laquelle les électrons changent de « propriétaire ». Au final, cela peut provoquer des mutations ponctuelles, des différenciations cellulaires ou encore des perturbations enzymatiques. Le radical libre le plus réactif est le radical hydroxyle (OH.), qui a une durée de vie extrêmement courte (10-8 seconde) dans un milieu de pH physiologique.
En cas d’inflammation, la durée de vie et la concentration des radicaux hydroxyles augmente. La peroxydation des lipides par des radicaux hydroxyles peut aussi provoquer, par une autre forme de réaction en chaine, la formation de nouveaux radicaux hydroxyles. Ils s’attaquent essentiellement l’ADN et plus précisément à ses bases azotés (A, T, C, G), aux protéines, essentiellement les systèmes enzymatiques, aux membranes biologiques qu’ils composent (Delattre et al., 2005).

Action sur les acides nucléiques

L’ADN est une molécule que l’on retrouve dans toutes nos cellules. Il renferme toutes les informations nécessaires au bon fonctionnement de notre organisme.
Sa dégradation par des radicaux libres peut mener à des mutations ou à la mort cellulaire.
La molécule d’ADN est constituée de deux brins se faisant face et reliés par des liaisons hydrogène. Ces liaisons faibles sont formées entre deux bases complémentaires (Thymine-Adénine ou Cytosine-guanine).
Les principaux dommages radio-induits de la molécule d’ADN sont des ruptures de chaine ou bien des dégradations localisées.
Les cassures simples ou doubles brins sont consécutives à des ruptures de liaison sucre-phosphate. La première étape de ces cassures est, par exemple, la capture d’un hydrogène du désoxyribose en position C’4 par le radical hydroxyle, illustrée par la figure 6.
Les ruptures simples brins représentent une part importante des conséquences dues aux irradiations. Les cassures doubles brins sont plus rares puisqu’ elles correspondent à deux ruptures de brins opposés, séparés de moins de dix paires de bases l’une de l’autre.
Les dégradations localisées de l’ADN sont principalement des altérations des bases azotées.
Ces dégradations résultent essentiellement de l’addition du radical hydroxyle sur les doubles liaisons de base azotées. Les positions C5 et C6 des bases pyrimidiques (thymine, cytosine) et C4 et C8 des bases puriques (adénine, guanine) sont principalement atteintes. Les bases pyrimidiques sont les plus sensibles face à l’attaque des espèces actives de l’oxygène (Nadal, 2009).

Action sur les protéines

Les protéines sont des macromolécules biologiquement très importantes, constituées d’une ou plusieurs chaines d’acides aminés liés entre elles par des liaisons peptidiques. Les protéines sont des éléments nécessaires à la vie des cellules. En effet, elles assurent de nombreuses fonctions cellulaires. Les radicaux, issus des rayonnements ionisants, entrainent essentiellement des réactions d’oxydations des protéines.
Les protéines les plus sensibles aux attaques des radicaux libres sont celles qui comportent des acides aminés possédant un atome de soufre (cystéine, méthionine). C’est le cas de nombreux enzymes cellulaires et protéine de transport. Par exemple, les résidus cystéines des protéines sont facilement oxydées par les EOR pour former un radical thiyle. Si deux résidus cystéine sont assez proches, ces derniers forment des ponts disulfures. Quant aux résidus méthionines, ils peuvent être oxydés rapidement en sulfones.
Les protéines sont alors sujettes à des réticulations comme la formation de ponts di-tyrosine à des coupures en cas de forte agression ou tout simplement à des modifications d’acides aminés. Les protéines modifiées deviennent inactives et plus sensibles à l’action des protéases. Certaines protéines oxydées deviennent également hydrophobes et forment des amas anormaux dans et autour des cellules (Naadal, 2009).

Action sur les lipides

Les lipides constituent la matière grasse des êtres vivants. Ce sont des molécules hydrophobes principalement constituées de carbone, d’hydrogène et d’oxygène (Naadal, 2009).
Les premières cibles des EOR sont les lipides notamment ceux présents dans les membranes cellulaires et subcellulaires. Les membranes riches en acide gras polyinsaturés (AGPI) sont très sensibles à l’oxydation en raison de leur degrés élevé d’instauration (Hulbertl, 2005). L’oxydation des lipides génère des peroxydes lipidiques qui sont eux même très réactifs. La peroxydation des lipides induit une modification de la fluidité, de la perméabilité et de l’excitabilité des membranes (Hong et al, 2004).
Le radical hydroxyle peut arracher à l’acide arachidonique un hydrogène en position allylique pour former un radical arachidonyle. La persistance de ce radical lui permet d’évaluer puis de réagir avec l’oxygène, conduisant à un radical peroxyde. Cette séquence est appelée peroxydation lipidique. Il s’agit d’une réaction en chaine, puisque le radical peroxyle obtenu peut réagir avec un autre acide gras et former à nouveau un radical diène conjugué.
Les radicaux peroxydes peuvent évoluer en peroxydes cycliques, qui subissent plusieurs transformations et peuvent libérer notamment des aldéhydes toxiques (malonaldéhyde, hydroxynonénal) et des alcanes ou des alcènes (éthane, pentane, éthylène) (Naadal, 2009).

Implication du stress oxydatif dans des pathologies

Le stress oxydant est impliqué dans de très nombreuses maladies comme facteur déclenchant ou associé à des complications de l’évolution. La multiplicité des conséquences médicales de ce stress n’a rien de surprenant car, selon les maladies, celui-ci se localisera à un tissu et à des types cellulaires particuliers, mettra en jeu des espèces radicalaires différentes et sera associé à d’autres facteurs variables et à des anomalies génétiques spécifiques à chaque individu.
La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l’âge car le vieillissement diminue les défenses antioxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux. En faisant apparaitre des molécules biologiques anormales et en surexprimant certains gènes. Le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies :
 Cancer
 Cataracte
 Sclérose latérale amyotrophique
 Vieillissement accéléré
 L’infertilité masculine
 Dégénération musculaire
Il est aussi un des facteurs potentialisant l’apparition de maladies plurifactorielles telles que :
 Le diabète
 La maladie d’Alzheimer
 La maladie Parkinson
 Maladies neurologiques
 Les rhumatismes
 Les maladies cardiovasculaires (hypertension, arrêt cardiaque, accident coronarien, accident vasculaire cérébrale).

Rôle physiologique des EOR concernant la fertilité masculine

Si des concentrations élevées d’EOR sont capables d’entrainer des altérations du sperme, un niveau physiologique d’EOR jouerait un rôle important dans les processus physiologiques normaux du spermatozoïde. Au cours du transit épididymaire, les EOR modifient par oxydation les caractéristiques structurales et biochimiques de l’ADN, des protéines et des lipides du spermatozoïde. Ils contribuent ainsi à la condensation nucléaire, au remodelage des membranes et à l’acquisition d’une mobilité rectiligne. Dans le tractus génital féminin, ils interviennent dans la capacitation, la réaction acrosomique, l’acquisition d’une mobilité hyperactive, et la fusion spermatozoïde-ovocyte.
La capacitation est la dernière phase du développement du spermatozoïde nécessaire pour la fécondation de l’ovocyte. La production contrôlée d’EOR se fait dans les spermatozoïdes au cours du processus de capacitation, initiant diverses modifications moléculaires. Les EOR entrainent une augmentation de l’AMPC qui est nécessaire à l’acquisition d’une mobilité hyperactive par les spermatozoïdes. Les spermatozoïdes hyperactifs présentent une forte amplitude, un mouvement flagellaire assymétrique, un déplacement de la tête accru et une mobilité non linéaire (Methorst, 2014).

Stress oxydatif et diabète

Le diabète est une maladie chronique du a une élévation chronique du taux de sucre dans le sang. Certains mécanismes conduisent à la formation d’EOR.
 Dans le diabète, lorsque le taux du glucose augmente, l’hexokinase est alors saturée et le glucose en excès est en partie métabolisé par la voie des polyols dans les tissus insulino-indépendant (à peu près 30% du glucose), comme les reins, le tissue neuronal ou les micros vaisseaux rétiniens (Gonzalez et all, 1984). Cette voie fait intervenir deux enzymes : l’aldose réductase et le sorbitol déshydrogénase (figure 9).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : Généralités sur Stereospermum Kunthianum Cham
I.1- Synonymes
I.2- Noms en langues nationales
I.3- Botanique
I.3.1- Place systématique de l’espèce
I.3.2- Répartition géographique
I.3.3- Description de la plante
I.3.3.1- Port
I.3.3.2- Feuilles
I.3.3.3- Fleurs et fruits
I.3.3.4- Les Ecorces
I.4- Techniques de plantation
I.5- Travaux antérieurs sur la Chimie
I.6- Activités pharmacologiques
I.6.1- Activités antalgique et anti-inflammatoire
I.6.2- Activité anticonvulsivante
I.6.3-Activité anti diarrhéique
I.6.4- Activité in vivo de cicatrisation
I.6.5- Activité antibactérienne
I.7- Usages ethnobotaniques
I.8- Etudes sur la toxicité
Chapitre II : Rappel sur des radicaux libres
II.1- Définition du stress oxydatif
II.2- Origines des radicaux libres
II.2.1- Origine interne
II.2.2- Origine externe
II.3- Action sur les substances biologiques
II.3.1- Action sur les acides nucléiques
II.3.2- Action sur les protéines
II.3.3- Action sur les lipides
II.4- Implication du stress oxydatif dans des pathologies
II.4.1- Rôle physiologique des EOR concernant la fertilité masculine
II.4.2- Stress oxydatif et diabète
II.5- Système Antioxydant
II.5.1- Antioxydants naturels
II.5.1.1- Antioxydants endogènes
II.5.1.2- Antioxydants exogènes
Chapitre III : Différentes méthodes d’études de l’activité antioxydante
III.1- Méthode du DPPH
III.2- Méthode FRAP (ferric reducing antioxidant power)
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre I : Matériels et méthodes
I.1- Matériels et Réactifs
I.1.1- Matériel végétal
I.1.2- Matériel de laboratoire
I.1.3- Réactifs utilisés
I.2 – Méthodes d’étude
I.2.1- Dosage de la teneur en eau
I.2.2- Obtention de l’extrait éthanolique
I.2.3- Screening chimique
I.2.3.1- Réactions de caractérisation en tubes
I.2.3.2- Chromatographie sur couche mince
I.2.4 -Activité antioxydante
I.2.4.1- Protocole opératoire de la méthode DPPH
I.2.4.2- Protocole opératoire de la méthode FRAP
I.2.4.3- Expression des résultats
Chapitre II : Résultats et discussion
II.1- Résultats
II.1.1- Teneur en eau
II.1.2- Extraction
II.1.3- Screening chimique
II.1.4- Activité antioxydante
II.1.4.1- Méthode DPPH
II.1.4.1.1- Extrait éthanolique des feuilles de Stereospermum kunthianum
II.1.4.1.2- Extrait éthanolique des écorces de Stereospermum kunthianum
II.1.4.1.3- Solution éthanolique d’acide ascorbique
II.1.4.1.4- Détermination des concentrations inhibitrices à 50% (CI50)
II.1.4.2- Méthode FRAP
II.1.4.2.1- Extrait éthanolique des feuilles de Stereospermum kunthianum
II.1.4.2.2- Extrait éthanolique des écorces du tronc de Stereospermum kunthianum
II.1.3.2.3- Solution éthanolique d’acide ascorbique
II.2- Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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