Différenciation des cellules du cumulus, rôle de l’ovocyte

Différenciation des cellules du cumulus, rôle de l’ovocyte

METABOLISME 

Missions du cumulus Une véritable coopération existe entre l’ovocyte et les CC. En effet, ce que l’ovocyte ne fait pas lui-même, il le fait « sous-traiter » par le cumulus. Particulièrement lors de la maturation finale de l’ovocyte, le COC doit fournir différents métabolites, électrolytes, purines et pyrimidines, ou encore acides gras, acides aminés et glucides.

Le glucose

Le glucose est la source d’énergie de processus nécessaires à la maturation du COC et il est utilisé par le biais de différentes voies de métabolisation. En effet, un COC bovin mature consomme deux fois plus d’oxygène, de pyruvate et de glucose qu’un COC immature (Sutton et al. 2003a). En outre, lors de maturation in vitro de COC, des concentrations inadéquates de glucose – trop basses ou trop élevées – provoquent des perturbations de la maturation nucléaire et cytoplasmique de l’ovocyte ainsi que de l’expansion du cumulus, et par-là même une compétence au développement réduite (revue par (Sutton-McDowall et al. 2010). Ces effets semblent être dus, dans le cas des concentrations en glucose trop faibles chez la souris, à un manque d’approvisionnement des voies de la glycolyse et des pentoses phosphates, limitant alors la synthèse d’acides nucléiques et la production d’énergie (Downs et al. 1998).

Dans le cas de concentrations en glucose trop élevées chez le bovin, c’est l’augmentation de la production de ROS et le déclin de la glutathione réduite – enzyme anti-oxydante – qui sont mises en cause (Hashimoto et al. 2000).Afin de servir la cause ovocytaire, le glucose doit d’abord passer par le cumulus car, bien que chez le bovin ou l’humain, l’ovocyte exprime certains transporteurs de glucose (Dan-Goor et al. 1997; Augustin et al. 2001), il n’en absorbe que très peu. En revanche, le cumulus, lui, possède un transporteur supplémentaire qui lui permet d’incorporer efficacement ce sucre (Nishimoto et al. 2006). Thompson et ses collègues (Thompson et al. 2007) ont ainsi calculé que les CC de COC bovins immatures consomment 23 fois plus de glucose que les ovocytes.La voie majeure de métabolisation du glucose par le COC est celle de la glycolyse. Cependant, l’ovocyte bovin affiche une activité phosphofructokinase (PFK) faible (Cetica et al. 2002) – enzyme-clé de la glycolyse transformant le glucose en fructose – de ce fait c’est le cumulus qui prend en charge cette voie.

Le cumulus, afin de fournir le COC en énergie, convertit ainsi le glucose en pyruvate et lactate (Harris et al. 2009). L’ovocyte bovin peut alors utiliser ces substrats dans le cycle de Krebs, puis la phosphorylation oxydative lui permet de produire de l’ATP (Steeves and Gardner 1999). Chez le bovin, la consommation de glucose par le COC au cours de la maturation in vitro augmente, toutefois, la production de lactate reste constante, suggérant alors une stabilité de l’activité glycolytique au cours de ce processus (Sutton et al. 2003a).Dans le COC, le glucose entre aussi dans la voie des pentoses phosphates.

D’ailleurs, lors de la maturation in vitro de COC porcins, l’inhibition de cette voie modifie l’activité mitochondriale et oxydative de l’ovocyte, faisant alors obstacle à la progression de la méiose (Alvarez et al. 2016). Chez le bovin, l’ovocyte révèle une activité G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase, enzyme-clé de cette voie) plus élevée que le cumulus (Cetica et al. 2002). La voie des pentoses phosphates permet : d’une part, la production de NADPH – via la G6PDH – pour la régulation des ROS par réduction de la glutathione ; et d’autre part, la production de PRPP (phosphoribosylpyrophosphate) servant à la synthèse des purines nécessaires à la régulation de la méiose (Sutton-McDowall et al. 2010). La voie des pentoses phosphates est donc impliquée dans la maturation cytoplasmique et nucléaire de l’ovocyte.

Une autre voie de métabolisation du glucose est mise en œuvre par le COC, celle de la biosynthèse des hexosamines. Dans les CC, la conversion du produit final de cette voie, la UDP-N-acetyl glucosamine, en acide hyaluronique par HAS2 (hyaluronic acid synthase 2) est requise pour la formation de la matrice extracellulaire nécessaire à l’expansion du cumulus (Sutton-McDowall et al. 2004; Gutnisky et al. 2007). La UDP-N-acetyl glucosamine participe également à la régulation post-traductionnelle en intervenant dans la O-glycolysation des protéines. La voie des hexosamines servirait en outre de sonde métabolique permettant une réponse cellulaire adaptée au statut énergétique de la cellule en question (revue par (Wells et al. 2003). Chez le xénope, la O-glycosylation semble varier au cours de l’ovogenèse et du développement précoce (Dehennaut et al. 2009). Dans les COC murins, la O-glycosylation de la HSP90 (heat-shock protein 90) due à une hyperglycémie mimée par l’ajout de glucosamine, réduit la compétence au développement de l’ovocyte (Frank et al. 2014).

Régulation par l’ovocyte

L’influence ovocytaire dans la régulation de la consommation de glucose du COC pourrait être spécifique de l’espèce puisque chez la souris, sans ovocyte, l’activité glycolytique des CC est fortement réduite (Sugiura et al. 2005) tandis que chez le bovin, l’absence de l’ovocyte n’aurait pas d’impact sur la consommation de glucose par les CC (Sutton et al. 2003a). Toutefois, une autre étude chez le bovin a montré que l’activité glycolytique des CC est réduite lorsque l’ovocyte est retiré du COC (Zuelke and Brackett 1992).

Les lipides

Les cellules du cumulus détiennent également un rôle dans le transport et le métabolisme des lipides. En effet, lors de la maturation in vitro, l’absence des CC entraîne une diminution des réserves lipidiques de l’ovocyte bovin (Auclair et al. 2013).Les acides gras (AG) interviennent dans la constitution des membranes et l’ancrage de protéines dans celles-ci. Les AG servent aussi de précurseurs aux prostaglandines et de source potentielle d’énergie (revue par (Dunning et al. 2014b). Chez le bovin, les ovocytes (Wonnacott et al. 2010) et les COC (Adamiak et al. 2006) contiennent plus d’AG saturés que les cellules de la granulosa. Le déroulement de la méiose ainsi que l’expansion du cumulus et son apoptose sont différentiellement influencés selon le type et les concentrations d’AG utilisés (Leroy et al. 2005). De plus, le traitement en maturation in vitro de COC bovins avec un mélange spécifique d’acides gras stimule l’expression de gènes du métabolisme énergétique et du stress oxydatif dans l’ovocyte alors qu’il inhibe ces mêmes gènes dans le cumulus (Van Hoeck et al. 2013).

Par ailleurs, les blastocystes issus de la fécondation de ces ovocytes comptent moins de cellules, montrent d’avantage d’apoptose ainsi qu’une altération de l’expression de gènes reliés au métabolisme (Van Hoeck et al. 2011; Van Hoeck et al. 2013).La β-oxydation des AG dans la mitochondrie permettant la synthèse d’ATP augmente drastiquement au cours de la maturation in vitro de COC murins, et bien qu’une partie de cette oxydation ait lieu dans l’ovocyte, la majeure partie se déroule dans le cumulus (Dunning et al. 2010). La même étude indique qu’in vivo, en période de maturation péri-ovulatoire, l’expression de Cpt1b, relié à l’entrée d’AG à longue chaîne dans la mitochondrie, augmente significativement dans le COC. La comparaison entre maturation in vitro et in vivo a montré qu’in vitro, la β-oxydation est moins active pour l’ovocyte félin (Spindler et al. 2000) et l’expression de gènes de cette voie est dérégulée dans les CC simiesques (Lee et al. 2011) et murines (Dunning et al. 2014a).

Également, chez le bovin, durant la maturation in vitro, l’activité catalytique des lipases pour l’utilisation des acides gras comme source d’énergie, est plus élevée dans l’ovocyte que dans les CC où en plus elle décline avec le temps (Cetica et al. 2002). Finalement, la β-oxydation apparaît indispensable à la reprise de la méiose et à la maturation nucléaire (Paczkowski et al. 2013) ainsi qu’au développement embryonnaire, notamment chez le bovin (Ferguson and Leese 2006), le porc (Sturmey et al. 2006) ou encore la souris (Dunning et al. 2010).

Table des matières

RESUME
ABSTRACT
LISTE DES TABLES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ABREVIATIONS ET DES SIGLES
REMERCIEMENTS
AVANT-PROPOS
1. INTRODUCTION
1.1. Le follicule ovarien
1.1.1. Ovogenèse
1 1.1.2. Folliculogenèse
1.1.3. Ovulation
1.2. Le cumulus oophorus
1.2.1. Différenciation des cellules du cumulus, rôle de l’ovocyte
1.2.2. Communications bidirectionnelles
1.2.3. Métabolisme : missions du cumulus
1.2.4. Réponse du COC au pic préovulatoire de LH
1.2.5. Cumulus post-ovulatoire
1.3. La compétence ovocytaire au développement
1.3.1. Définition
1.3.2. Évaluation de la compétence ovocytaire
1.3.3. Mesure de la compétence ovocytaire
1.3.4. Optimisation de la stimulation ovarienne
1.4. Hypothèse et objectifs
2. CUMULUS CELL GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH PRE-OVULATORY ACQUISITION OF DEVELOPMENTAL COMPETENCE IN BOVINE OOCYTES
2.1. Résumé
2.2. Abstract
2.3. Introduction
2.4. Results
2.4.1. COC morphology
2.4.2. Genes inventory
2.4.3. Hierarchical cluster analysis
2.4.4. Variation of gene expression across time
2.4.5. Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
2.4.6. qRT-PCR results
2.5. Discussion
2.6. Conclusion
2.7. Materials and methods
2.7.1. Ovarian stimulation treatment, in vitro production and cumulus–oocyte complex (COC) recovery from super-stimulated animals
2.7.2. Cumulus cell retrieval
2.7.3. RNA extraction
2.7.4. RNA processing for microarray analysis
2.7.5. Microarray data normalization and statistical analysis
2.7.6. RNA processing for qRT-PCR and statistical analysis
2.7.7. Statistical analysis of COC morphology
2.8. References
2.9. Tables
2.10. Figures
3. THE EFFECTS OF BASAL LH INHIBITION WITH CETRORELIX ON CUMULUS CELL GENE EXPRESSION DURING THE LUTEAL PHASE UNDER OVARIAN COASTING STIMULATION IN CATTLE.
3.1. Résumé
3.2. Abstract
3.3. Introduction
3.4. Results
3.4.1. COC Morphology
3.4.2. Genes Inventory and Clustering
3.4.3. IPA analysis
3.4.4. qRT-PCR results
3.5. Discussion
3.6. Conclusion
3.7. Materials and methods
3.7.1. Ovarian stimulation treatment, in vitro production, and recovery of cumulus-oocyte complexes (COC) from super-ovulated animals
3.7.2. Cumulus cell retrieval
3.7.3. RNA extraction
3.7.4. RNA processing for microarray analysis
3.7.5. Microarray data normalization and statistical analysis
3.7.6. RNA processing for qRT-PCR and statistical analysis
3.7.7. Statistical Analysis of COC Morphology
3.8. References
3.9. Tables
3.10. Figures
4. ANALYSIS OF LHCGR AND SELECTED STEROID ENZYME MRNA EXPRESSION IN BOVINE CUMULUS CELLS DURING IN VITRO MATURATION.
4.1. Résumé
4.2. Abstract
4.3. Introduction
4.4. Results
4.4.1. LHCGR and MVK mRNA expression during in vitro maturation
4.4.2. Steroidogenic enzyme and progesterone receptor mRNA expression during in vitro maturation
4.5. Discussion
4.6. Conclusion
4.7. Materials and methods
4.7.1. Cumulus-Oocyte Complex in vitro maturation and retrieval
4.7.2. RNA processing and quantification
4.8. References
4.9. Tables
4.10. Figures
5. INDIVIDUAL BOVINE
I N V I T R O EMBRYO PRODUCTION AND CUMULUS CELL TRANSCRIPTOMIC ANALYSIS TO DISTINGUISH CUMULUS-OOCYTE COMPLEXES WITH HIGH OR LOW DEVELOPMENTAL POTENTIAL
5.1. Résumé
5.2. Abstract
5.3. Introduction
5.4. Results
5.4.1. In vitro embryo production and quality assessment
5.4.2. Gene inventory
5.4.3. Ingenuity Pathway Analysis
5.4.4. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction results
5.5. Discussion
5.6. Conclusion
5.7. Materials and methods
5.7.1. In vitro culture and CC recovery
5.7.2. Analysis of RNA
5.8. Acknowledgments
5.9. References
5.10. Tables
5.11. Figures
6. CONCLUSION ET DISCUSSION GENERALES
BIBLIOGRAPHIE

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