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Implication des arrestines dans l’apoptose
Les-arrestines interagissent avec d’autres partenaires protéiques et interviennent dans différentes voies de signalisation comme l’apoptose en participant aux cycles de phosphorylation/déphosphorylation de la protéine Akt (une protéine kinase B) en formant autour d’elle, après activation de récepteur de l’IGF1, un complexe comprenant en plus de Akt/PKB, son activateur, la PI3K (PI3kinase) et son inhibiteur, la phosphatase PP2A (Protein Phosphatase 2A) (Povsic et al., 2003) (Beaulieu et al., 2005). La stimulation du récepteur de l’IGF1 met en place un mécanisme anti-apoptotique via l’activation de la PI3K et de Akt, mais cette action anti-apoptotique nécessite la présence des β-arrestines ou tout du moins de la β-arrestine 1 (Povsic et al., 2003). La régulation d’Akt par les-arrestines semble donc être un niveau de protection de la cellule contre l’apoptose. Ce rôle anti-apoptotique que pourraient jouer les-arrestines semble confirmé par des observations faites sur des cellules déficientes en-arrestine pour lesquelles, lorsque certains récepteurs (FPR ou AT1AR) sont stimulés trop longtemps, l’apoptose est bien plus importante que chez les cellules sauvages (Revankar et al., 2004).
Régulation du système immunitaire par les β-arrestines
Bien que les β-arrestines soient présentes dans les cellules participant à l’immunité, leur rôle à ce niveau reste très peu étudié. Il a cependant été montré que les β-arrestines peuvent interagir avec la protéine TRAF6 (Tumor necrosis factor receptor associated factor 6), nécessaire pour l’activation des facteurs NF-κB et AP-1, deux activateurs transcriptionnels de l’immunité innée. Après activation du TLR-IL-1R (Toll like receptor-interleukin-1 receptor), le domaine C de la β-arrestine 1 ou 2 va interagir avec le domaine N de TRAF6, ce qui empêche l’activation des facteurs NF-κB et AP-1. Chez les souris invalidée pour la β-arrestine 2, une augmentation de la réponse inflammatoire et une diminution du seuil létal d’endotoxines sont observées (Wang et al., 2006).
Rôle des-arrestines au niveau du noyau et dans la régulation transcriptionnelle
Les β-arrestines 1 et 2 ont un signal de localisation nucléaire, mais seule la β-arrestine 2 possède un domaine d’export nucléaire. Ceci concorde avec les observations qui montrent la présence de la β-arrestine 1 dans le cytoplasme ainsi que dans le noyau alors que la β – arrestine 2, qui est exportée du noyau par la protéine chaperon CRM1, est retrouvée exclusivement au niveau du cytoplasme (Scott et al., 2002) (Kang et al., 2005). La β-arrestine 2 semble avoir un rôle dans la régulation spatiale de certains de ses partenaires, comme la kinase JNK3 ou l’ubiquitine ligase Mdm2, qu’elle retient en partie dans le cytoplasme alors qu’ils sont normalement localisés dans le noyau (Song et al., 2006) (Figure 8, insert).
Les β-arrestines régulent également, de façon plus ou moins directe, la transcription de certains gènes. Les arrestines se lient au facteur NF-κB et l’empêchent d’aller activer la transcription au niveau du noyau (Witherow et al., 2004). La β-arrestine peut aussi agir au niveau de la membrane plasmique en inhibant l’auto-ubiquitination de la protéine TRAF6 qui ne peut alors plus activer la kinase I-κB. Son effet de dissociation du facteur NF-κB avec sa protéine inhibitrice est inhibé et la transcription ne peut pas avoir lieu (Wang et al., 2006).
Un autre exemple de régulation par les β-arrestines est observé au niveau des récepteurs δ et κ aux opioïdes. Après activation de ces récepteurs, la β-arrestine 1 est transloquée au noyau où elle provoque l’hyper-acétylation de l’histone H4 au niveau des promoteurs des gènes p27 et c-fos qui sont alors transcrits (Kang et al., 2005).
Plus récemment, l’analyse protéomique des partenaires des β-arrestines a permis de révéler de nouveaux partenaires nucléaires. En interagissant avec certaines protéines telles que les ARN polymérases I et II ou encore des facteurs de transcription comme la myocardine ou STAT1, les arrestines participent à l’inhibition, ou au contraire à l’activation de la transcription de plusieurs gènes. Les arrestines sont également capables d’interagir avec certains facteurs de régulation des histones comme HDAC2 (enzyme permettant la dé-acetylation de lysine en N-terminal des histones). De plus, les β-arrestines semblent avoir un rôle dans la maturation des ARNm et de leur traduction en interagissant avec des facteurs d’élongation comme eEF1A ou eIF-4B ou avec des protéines ribosomales (Xiao et al., 2007) (Neuhaus et al., 2006).
Enfin, les β-arrestines sont également impliquées dans la prolifération cellulaire où elles ont un rôle dans l’atténuation du signal mitotique (Schmid and Bohn, 2009).
Description
Caractéristiques générales
Alors que les arrestines visuelles ne sont présentes que dans les cellules photo-réceptrices, les β-arrestines sont présentes de façon ubiquiste dans toutes les cellules de l’organisme (Attramadal et al., 1992; Parruti et al., 1993).
Les arrestines interviennent dans de nombreuses fonctions cellulaires et de nouveaux rôles ne cessent d’être mis en évidence. Ceci peut s’expliquer par le nombre et la variété des partenaires retrouvés notamment pour les β-arrestines 1 et 2 (337 partenaires potentiels pour ces 2 protéines) (Xiao et al., 2007). Les arrestines peuvent interagir aussi bien avec des protéines de signalisation cellulaire (kinases et phosphatases, protéines de la famille des petites GTPases), des protéines impliquées dans le trafic de vésicules (AP-2 ou VPS35), des facteurs d’organisation du cytosquelette (actine, tubuline, vimentine) ou encore des acides nucléiques (interaction avec des protéines d’interaction à l’ADN et des facteurs de transcription, entre autre) ou des protéines chaperons. Ces partenaires étant localisés dans différents compartiments subcellulaires, ceci suggère une organisation spatiale des arrestines très diversifiée également (52 % des partenaires sont cytosoliques, 26 % sont nucléaires et 5 % sont membranaires, les autres étant distribués dans les différents compartiments cellulaires) (Xiao et al., 2007).
Données structurales
Les premières données structurales sur les arrestines ont été obtenues à la fin des années 1990 par l’étude aux rayons X de l’arrestine 1 (S) de bœuf (Granzin et al., 1998). Les résultats montrent que l’arrestine est composée de deux régions organisées en feuillets antiparallèles avec une extrémité C-terminale très flexible (résidus 361 à 418) et un regroupement d’acides aminés chargés au cœur de la protéine. Cette étude indique également que la région d’interaction avec la rhodopsine phosphorylée se situe sur la région N -terminale entre les acides aminés 158 et 185. La première structure cristallographique des β-arrestines, obtenue en 2001 à une résolution de 1.9 Å avec la β-arrestine 1 bovine tronquée, confirme la forme allongée, quasi exclusivement en brins de la β-arrestine (Han et al., 2001). La structure complète de la β-arrestine 1 a été rapidement résolue par la suite (Milano et al., 2002). La très forte homologie entre les β-arrestines 1 et 2 a permis de modéliser la structure de la β -arrestine 2 à partir des données cristallographiques obtenues pour la β-arrestine 1.
Phosphorylation
La β-arrestine 1 possède un site de phosphorylation constitutif au niveau de la sérine 412 qui diminue son affinité pour la clathrine (Lin et al., 1997). C’est uniquement sous sa forme active, et donc déphosphorylée, que la protéine peut interagir avec les récepteurs. Le retour de la protéine à un état inactif phosphorylé se fait grâce aux MAP kinases ERK 1/2 (Lin et al., 1999).
La β-arrestine 2 est quant à elle phosphorylée au niveau de la thréonine 382 (Kim et al., 2002). De même que pour la β-arrestine 1, cette phosphorylation est constitutive, mais la déphosphorylation ne semble pas nécessaire aux fonctions de la β-arrestine 2.
Lorsque les cellules sont mises en présence d’un agoniste (par exemple l’isoprotérénol qui active les récepteurs β-adrénergiques) on observe une diminution globale du nombre d’arrestines phosphorylées d’environ 20 %. Cependant, la déphosphorylation est très variable selon la localisation des arrestines. A la membrane plasmique, la totalité des arrestines est déphosphorylée. Au niveau du cytoplasme, aucune déphosphorylation n’est notée, et l’activation de récepteurs par l’agoniste n’a pas d’effet sur l’activation des arrestines. Enfin, la moitié environ des arrestines portées par des endosomes est déphosphorylée. Ces observations s’expliquent par le fait que le récepteur activé par l’agoniste va recruter les arrestines au niveau de la membrane plasmique où elles sont déphosphorylées, et son internalisation va conduire les arrestines non phosphorylées au niveau des vésicules endosomales (il faut noter en parallèle une forte augmentation de la quantité globale d’arrestines au niveau de la membrane plasmique et des vésicules après activation des récepteurs) (Lin et al., 1997).
Des formes mimant un état constitutivement phosphorylé (S412D) ou constitutivement déphosphorylé (S412A) de la β-arrestine 1 ont permis de mettre en évidence le fait que la phosphorylation de l’arrestine n’est pas nécessaire que ce soit pour la désensibilisation ou pour l’internalisation du récepteur (ce qui est attendu étant donné que c’est l’extrémité C – terminale de l’arrestine qui intervient dans cette interaction). Par contre, l’internalisation du récepteur est significativement plus efficace dans les cellules exprimant la forme S412A de la protéine. A l’inverse, les cellules qui expriment le mutant S412D voient quant à elles l’internalisation des récepteurs fortement diminuée par un effet dominant négatif de la protéine mutante qui ne peut pas exposer les sites d’interaction à la clathrine et à l’AP-2 (Lin et al., 1997).
Ubiquitination
Les β-arrestines 1 et 2 sont poly-ubiquitinées, un état nécessaire pour l’internalisation clathrine-dépendante des récepteurs suite à leur activation. Cette ubiquitination se produit lors de l’interaction de l’arrestine avec le récepteur activé et est catalysée par l’ubiquitine ligase E3 Mdm2 (Shenoy et al., 2001). Le temps de résidence des ubiquitines sur l’arrestine est plus ou moins long et dépend de la durée de l’interaction entre l’arrestine et le récepteur (Shenoy and Lefkowitz, 2005b). Par exemple, l’interaction de la β-arrestine 2 avec le récepteur β2-AR forme un complexe de faible affinité et lors de cette interaction, l’arrestine prend une conformation propice pour interagir avec la déubiquitinase USP33 (Ubiquitin Specific Protease 33). Cela entraîne une déubiquitination rapide de la protéine et sa dissociation du récepteur. Une autre conséquence est que la β-arrestine ne peut pas activer les ERK et la voie de signalisation secondaire arrestine-dépendante. A contrario, la β-arrestine 2 forme un complexe assez stable avec le récepteur V2R et ne prend pas une conformation propice à l’interaction avec USP33. La β-arrestine est ubiquitinée plus longtemps, l’interaction entre le récepteur et l’arrestine est prolongée et la β-arrestine 2 peut activer une voie de signalisation secondaire via les ERK (Shenoy et al., 2009).
En plus d’être elles-mêmes ubiquitinées, les arrestines participent à l’ubiquitination de partenaires. Par exemple, l’ubiquitination et la dégradation rapide du récepteur aux chémokines CXCR4 après son activation semblent être au moins en partie régulées par l’arrestine. La β-arrestine 1 possède un site d’interaction avec la protéine AIP4 (Atrophin Interacting Protein 4) qui est masqué lorsque l’arrestine est dans un état inactif et qui devient accessible suite à l’interaction avec le récepteur CXCR4 activé. La β-arrestine 1 interagit faiblement avec l’AIP4 en absence de stimulation et cela suppose la présence d’un second site d’interaction d’affinité plus faible. Des expériences de pull down ont permis de montrer que l’arrestine interagit directement avec l’un des quatre domaines WW de AIP4. D’autres domaines de AIP4 entrent peut-être en jeu, notamment pour l’interaction de faible affinité, mais rien n’est démontré. Le site d’interaction avec AIP4 se situe au niveau du domaine N de l’arrestine entre les résidus 161 et 260. L’inhibition de la β-arrestine 1 a pour conséquence d’empêcher la dégradation du récepteur qui est cependant toujours ubiquitiné et internalisé. L’action de l’arrestine ne se situe donc pas au niveau de l’ubiquitination du récepteur, mais plus en aval. L’interaction entre la β-arrestine 1 et AIP4 se fait au niveau des endosomes. Elle pourrait entrainer un temps de résidence du récepteur plus long sur l’endosome ou bien provoquer un deuxième round d’ubiquitination suivi du ciblage du récepteur vers le lysosome. AIP4 n’a pas d’influence sur le niveau d’ubiquitination de la β-arrestine 1(Bhandari et al., 2007). De la même façon, les β-arrestines permettent l’ubiquitination du récepteur à l’IGF1 par la Mdm2 en servant d’adaptateur entre ces deux protéines (Girnita et al., 2005).
Oligomérisation
La première structure obtenue pour l’arrestine 1 correspond à celle d’un tétramère composé de deux dimères asymétriques (Granzin et al., 1998; Hirsch et al., 1999) alors que la structure cristallographique de la-arrestine 1 est celle d’un monomère pour la protéine complète et d’un oligomère si elle est tronquée (Han et al., 2001) (Milano et al., 2002). Cette oligomérisation se fait par les extrémités C-terminales des-arrestines, alors que les interactions sur un oligomère d’arrestine visuelle ont lieu entre l’extrémité C-terminale d’une molécule et le domaine en feuillets d’une autre.
Des données plus récentes obtenues par co-immunoprécipitation et par FRET tendent à confirmer que les-arrestines sont présentes sous forme oligomérique dans la cellule et que ces oligomères peuvent s’associer entre eux (Storez et al., 2005) (Milano et al., 2006) (Xiao et al., 2007).
Les-arrestines ont deux sites d’interaction avec l’inositol hexakisphosphate (IP6), un sur le domaine C-terminal avec une forte affinité (Kd0.04M) constitué par les résidus Lys232, Arg236, Lys250, Lys324 et Lys326 et l’autre d’affinité plus faible sur le domaine N (Kd2.6 M) constitué des résidus Lys157, Lys160 et Arg161 (Figure 11A) (Sasakawa et al., 1995) (Milano et al., 2006). L‘IP6 pourrait alors servir de ligand de pontage des-arrestines entre le domaine N d’une molécule et le domaine C de l’autre (Figure 11B). Ceci est confirmé par des expériences de filtration sur gel et de centrifugation analytique montrant une forte oligomérisation de la β-arrestine 1 (aussi bien homo-oligomérisation qu’hétéro-oligomérisation avec la β-arrestine 2) en présence d’IP6. Une forme mutée de l’arrestine dans le site d’interaction avec l’IP6 empêche l’homo- et l’hétéro-oligomérisation des-arrestines, sans empêcher l’internalisation du récepteur, ni l’interaction de l’arrestine avec la clathrine, l’AP-2 ou encore ERK1 /2 (Milano et al., 2006; Hanson et al., 2008). Ceci est en accord avec les résultats montrant que l’interaction entre le récepteur et la β-arrestine est inhibée par l’oligomérisation la-arrestine (Gaidarov et al., 1999).
Les arrestines ayant des rôles variés au niveau cellulaire, les différentes formes oligomériques de la protéine pourraient réguler en partie son activité. La présence de dimères de β-arrestines semble nécessaire à l’activation des ERK 1/2 (Xu et al., 2008). L’état oligomérique semble également jouer sur la localisation de la-arrestine 1 qui sous sa forme monomérique est plutôt nucléaire, alors qu’elle est majoritairement cytoplasmique sous la forme oligomérique (Storez et al., 2005) (Milano et al., 2006). L’oligomérisation dépendant de l’IP6 régule donc la localisation cytosolique de l’arrestine en l’empêchant d’aller au noyau et d’interagir avec la membrane plasmique et augmente ainsi sa disponibilité lors de l’activation des récepteurs. Le rôle des β-arrestines comme protéines d’échafaudage dépend également de leurs état d’oligomérisation qui va moduler les affinités pour les différents partenaires (Xu et al., 2008). L’affinité des arrestines pour l’IP6 est très largement inférieure à leur affinité pour les RCPG (de l’ordre du micromolaire pour l’IP6 et du nanomolaire pour les récepteurs). L’IP6 ne rentre donc pas en compétition avec les récepteurs pour l’interaction avec l’arrestine au niveau de la membrane plasmique. Cependant, cette affinité de la β-arrestine pour l’IP6 est suffisante pour que l’IP6 rentre en compétition avec des complexes cytosoliques tels que les microtubules ou la calmoduline, qui ont également une affinité de l’ordre du micromolaire et des sites d’interaction situés sur la même face de l’arrestine.
Drosophila melanogaster
On peut noter la présence, en plus de deux arrestines visuelles et d’un homologue de β-arrestine, de la protéine Kurtz qui présente plusieurs points communs avec ces dernières notamment sa capacité à interagir avec des récepteurs après leur stimulation (Johnson et al., 2008). Elle régule entre autres le récepteur Notch vers lequel elle cible une E3 ubiquitine ligase, Deltex, qui va ubiquitiner le domaine intracellulaire de Notch envoyé par la suite vers une voie de dégradation (Mukherjee et al., 2005) (Shenoy and Lefkowitz, 2005a). La drosophile possède également plusieurs autres protéines de type arrestine non caractérisées, 1 homologue de DSCR3, 1 homologue de Vps26 et 14 ADCs dont les fonctions ne sont pas caractérisées.
Caenorhabditis elegans
On retrouve une arrestine, ARR-1 qui a environ 65 % d’homologie avec les β-arrestines et qui possède un cœur polaire ainsi que des sites spécifiques d’interaction avec la clathrine et la sous unité β2 de l’adaptine sur son domaine C. Cette protéine majoritairement exprimée dans les cellules neuronales, intervient dans l’adaptation olfactive mais semble également avoir un rôle dans le contrôle de la ponte des œufs qui est inhibée chez un individu arr1-. Dans les deux cas, l’intervention de ARR1 se fait au niveau des RCPG (Palmitessa et al., 2005). Plusieurs ADCs ainsi que Vps26 sont également présentes chez C. elegans.
Levures et champignons
Onze protéines dont la structure est modélisable à partir des arrestines sont retrouvées. Ces protéines interviennent aussi bien dans la résistance à certains composés tel que l’o-dinitrobenzène pour la protéine Rod1p (Shinoda and Kikuchi, 2007), la réponse aux changements de pH avec Rim8 et PalF, la résistance à certains métaux comme le cadmium (Ecm21, Crs2) ou encore dans la machinerie autophagique (Aly1p, Aly2p). Ces protéines ont été appelées ARTs (Arrestin Related Trafficking adaptors) et elles régulent l’ubiquitination de certains cargos protéiques en recrutant une ubiquitine ligase de type HECT (Rps5) au niveau de la membrane plasmique en réponse à des stimuli spécifiques. Le niveau d’ubiquitination de ces cibles à la membrane plasmique va les diriger, après endocytose, vers une voie de recyclage ou de dégradation. Malgré des mécanismes très différents, le rôle des ARTs est comparable à celui des arrestines dans le sens où elles régulent l’endocytose de protéines membranaires (Lin et al., 2008).
Le transporteur à manganèse Smf1 est également capable de transporter le cadmium qui est toxique pour la cellule. Smf1 est internalisé lorsque les cellules sont en présence de ce métal pour échapper à son effet toxique. L’endocytose de Smf1 nécessite son ubiquitination au préalable sur les Lys33 et Lys34 par Rsp5. Comme aucun motif PY n’est présent sur Smf1, un adaptateur protéique est essentiel pour le recrutement de Rps5 qui possède un motif WW. Les protéines Ecm21 ou Csr2 (aussi appelées Art2 et Art8) qui sont des membres de la famille des arrestines sont capables d’interagir avec Rps5 grâce à leur motif PY et avec Smf1 phosphorylé, et permettent l’ubiquitination de Smf1 par Rps5. Une fois ubiquitiné et associé à Ecm21 ou Csr2, le transporteur est internalisé (Nikko et al., 2008).
PalF chez Aspergillus (Rim8 ou Art9 chez S. cerevisiae) est impliquée dans des voies de signalisation induites par le pH. PalF malgré une faible similarité de séquence possède les domaines N et C des arrestines et se lie de façon stable et directe à deux régions différentes de l’extrémité C-terminale du récepteur PalH. La substitution S86P chez PalF a exactement le même effet que la substitution V53A chez la β-arrestine 1, une diminution de l’interaction avec les RCPG. Il y a probablement conservation du mécanisme d’interaction avec le récepteur entre ces deux protéines. Lorsque les cellules sont en milieu alcalin, PalH est activé et PalF phosphorylé sur un résidu sérine très conservé sur le domaine arrestine-N. In vivo, l’interaction entre PalH et PalF est nécessaire pour déclencher la voie de signalisation pH dépendante. Par contre et contrairement aux β-arrestines, PalF ne semble pas jouer un rôle de désensibilisation au niveau du récepteur en venant empêcher l’interaction avec les protéines G hétérotrimériques. Son rôle semble restreint à la signalisation (Herranz et al., 2005).
Dictyostelium discoideum
Chez Dictyostelium on retrouve un homologue de Vps26, un homologue de DSCR3, Vps26L et 6 protéines à domaine arrestine, AdcA-F dont l’une, AdcA, a fait l’objet de ce travail de thèse.
Classification des arrestines
En 2008 Alvarez propose de classer les protéines de la famille arrestine en 2 types : les arrestines de type α et les arrestines de type β (à ne pas confondre avec les β -arrestines). Selon les critères d’Alvarez, les arrestines de type α ne possèdent pas d’hélice H1 dans leur domaine N, mais possèdent un motif PPxY d’interaction avec le motif WW des ubiquitines ligases. Par contre, les arrestines de la famille β, qui regroupe les arrestines visuelles et les β-arrestines, n’ont pas de motif PPxY (ou (P/L)PxY) et possèdent une hélice qui est séquestrée dans la conformation inactive de la protéine et probablement libérée dans sa conformation active. On retrouve également sur les arrestines de type β des sites d’interaction à la clathrine et à AP -2 qui ne sont pas présents sur les arrestines de type α (Alvarez, 2008) ; (Mittal and McMahon, 2009). De plus, les arrestines de type β sont majoritairement cytosoliques dans les cellules non activées alors que les arrestines de type α sont elles plutôt associées aux membranes.
Cette classification est toutefois ambiguë et discutable, car la modélisation tridimensionnelle des ADCs 2, 3 et 4 (qui sont de type α selon Alvarez) montre la présence d’une hélice α dans le domaine N. ADC 5, qui est également de type α selon Alvarez, ne possède ni hélice dans le domaine N ni motif PPxY (Aubry et al., 2009).
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I. LES ARRESTINES
I. Historique
A. Les arrestines visuelles
B. Les -arrestines
II. Principales fonctions des -arrestines
A. Régulation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)
B. Régulation d’autres types de récepteurs
C. Participation à la cascade de signalisation
III. Description
A. Caractéristiques générales
B. Données structurales
C. Régulation
IV. La superfamille des arrestines
A. Les protéines à domaine arrestines
B. Classification des arrestines
PARTIE II. DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
I. Dictyostelium , un organisme eucaryote unicellulaire capable de multicellularité
A. Historique
B. Cycle de vie
II. Les atouts du modèle
III. Le répertoire amibien des RCPG
IV. Dictyostelium, un modèle pour l’étude du trafic endocytaire
A. La macropinocytose
B. La phagocytose
OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE
MATERIEL ET METHODES
I. Techniques de biologie cellulaire
A. Souches et conditions de culture cellulaire
B. Electroporation de Dictyostelium
C. Développement multicellulaire de Dictyostelium
D. Imagerie cellulaire
E. Suivi de l’activité endocytaire
II. Techniques de biologie moléculaire
A. Sous-clonage
B. Extraction de plasmides
C. Extraction d’ADN génomique de Dictyostelium
D. Southern blot
III. Techniques de biochimie
A. Analyse des protéines
B. Expression de protéines recombinantes
C. Pull down
D. Immunoprécipitation
E. Fractionnement subcellulaire
F. Filtration sur gel
G. Résonance plasmonique de surface
IV. Double hybride
RESULTATS
PARTIE I. IDENTIFICATION DES PROTEINES A DOMAINE ARRESTINE DE DICTYOSTELIUM
PARTIE II. CARACTERISATION DE LA PROTEINE ADCA
I. AdcA une protéine multimodulaire
A. Le module arrestine
B. Le domaine H
C. Le domaine
D. Le domaine FYVE
E. Le domaine Y
II. Des homologues d’AdcA existent chez d’autres amibes et le phytoplancton
III. Répartition des homologues d’AdcA chez d’autres espèces
IV. Développement d’outils pour l’étude de AdcA
A. Production d’anticorps anti-AdcA
B. Expression de protéines étiquetées
C. Expression temporelle d’AdcA
V. Localisation subcellulaire de la protéine AdcA
A. AdcA est associée à la fraction membranaire
B. AdcA est associée à la voie endocytaire
C. AdcA est recrutée sur des compartiments précoces de la voie endocytaire
D. La localisation endocytaire d’AdcA met en jeu le domaine FYVE de la protéine
VI. La protéine AdcA forme des oligomères
A. Le domaine H est capable d’homo-oligomériser de façon métal-dépendante
B. La protéine AdcA est capable de former des oligomères in cellulo
PARTIE III. ETUDE DU ROLE FONCTIONNEL DE LA PROTEINE ADCA
I. Obtention des mutants adcA et adcA/adcD nuls
A. Elaboration des constructions d’invalidation de adcA et adcD
B. Sélection des clones invalidés
II. Caractérisation phénotypique du mutant adcA nul
A. La mutation adcA nulle n’affecte pas la croissance cellulaire
B. L’invalidation de adcA n’a pas d’effet sur le programme de développement multicellulaire
C. L’activité d’endocytose n’est pas altérée dans la souche adcA nulle
D. L’invalidation de adcA conduit à un défaut dans la voie de recyclage depuis les endosomes
PARTIE IV. RECHERCHE DE PARTENAIRES DE ADCA
I. Approche informée
A. La clathrine
B. La machinerie ESCRT
II. Identification de partenaires par crible double hybride
A. Construction et test de l’appât
B. Analyse sommaire des clones positifs
C. Caractérisation de l’interaction AdcA-ArfA
III. Recherche de partenaires par pull down
DISCUSSION et PERSPECTIVES
Discussion
Perspectives
BIBLIOGRAPHIE
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