Diagnostic de la candidose vulvovaginale

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

La vulvovaginite à Candida

La candidose vulvovaginale est l’une des plus fréquentes infections gynécologiques de la femme en période d’activité génitale. Elle est le plus souvent due à C. albicans (80 %) et à C. glabrata (20 %). Les candidoses vulvovaginales sont hormono-dépendantes et surviennent dans la seconde partie du cycle menstruel et pendant la grossesse (troisième trimestre). Après la ménopause, la prévalence décroît. La prise d’antibiotiques à large spectre et le diabète mal contrôlé sont des facteurs favorisants parmi tant d’autres (Figure 2).
La candidose vulvo-vaginale n’est pas considérée comme une IST.
Les symptômes majeurs sont un prurit et des brûlures vulvaires intenses. Une dyspareunie et une dysurie sont souvent signalées. Le diagnostic est évoqué par la leucorrhée blanche typique, d’abondance variable (lait caillé, sécrétions caillebottées).
Dans 90% des cas, la candidose vulvo-vaginale est simple et d’évolution favorable. Dans 10% des cas, elle est compliquée, sévère et récidivante, définie par quatre épisodes à cultures positives sur une période de 12 mois. La candidose vaginale récidivante peut être la première manifestation clinique de l’infection à VIH chez une femme séropositive [4].

Diagnostic de la candidose vulvovaginale

Aucun des signes cliniques de la CVV n’est pathognomonique, ainsi le diagnostic clinique doit être confirmé par un diagnostic mycologique. La plupart des patientes présentant une CVV symptomatique peuvent être facilement diagnostiquées sur la base d’une estimation du pH vaginal et d’un examen microscopique des sécrétions vaginales. L’examen direct des secrétions vaginales avec de l’eau physiologique a une sensibilité de 40 à 60%. La préparation à la potasse (KOH) à 10% est encore plus sensible pour mettre en évidence la présence d’hyphes. On trouve un pH vaginal normal (4,0 à 4,5) dans la vaginite à Candida, et la découverte d’un pH supérieur à 4,5 devrait alerter fortement les cliniciens sur la possibilité d’une vaginose bactérienne, d’une trichomonose ou d’une infection mixte (Figure 3) [24].

Agents antimycotiques oraux

Le kétoconazole (400 mg par jour pendant 5 jours) et l’itraconazole (200 mg par jour pendant 3 jours ou 400 mg pour 1 jour) ont été en grande partie remplacés par le fluconazole (150 mg en une seule prise par jour). Tous se sont révélés extrêmement efficaces pour la guérison clinique de la vaginite aiguë à Candida. Les résultats cliniques de la thérapie orale sont au moins aussi bons que la thérapie antimycotique topique conventionnelle. Plusieurs études indiquent que la plupart des femmes préfèrent une thérapie par voie orale. Les femmes présentant une inflammation et des symptômes d’inflammation plus graves doivent recevoir plus d’une dose unique de fluconazole et une deuxième ou une troisième dose est conseillée, à intervalles de 72 heures [24].

Mécanismes de la résistance acquise

Notre utilisation fréquente et prophylactique des antifongiques a conduit au développement d’une résistance robuste des champignons d’importance médicale. De nombreux mécanismes de résistance aux antifongiques ont été identifiés, notamment: modification de la cible médicamenteuse ou surexpression, régulation à la hausse de transporteurs multi-drogues et activation des réponses au stress (Figure 5). Bien que la résistance aux polyènes reste extrêmement rare, la résistance aux azolés et aux échinocandines est bien documentée [22].

Test de sensibilité aux antifongiques : l’antifongigramme

La technique d’étude de sensibilité aux antifongiques la plus fiable utilise des modèles animaux et ne peut pas être utilisée dans la pratique courante qui va privilégier les méthodes in vitro [20]. L’activité in vitro des antifongiques vis-à-vis des champignons est déterminée à l’aide de la mesure des concentrations minimales inhibitrices (CMI). La CMI définit une activité fongistatique qui est une simple inhibition de la croissance en présence de l’antifongique. La fongicidie est exprimée en concentration minimale fongicide (CMF) et correspond à une diminution significative de l’inoculum infectieux avec moins de 0,01 % de microorganismes survivants comparativement à l’inoculum initial en présence de l’antifongique. La détermination du rapport CMF/CMI a un intérêt pour l’amphotéricine B car il permet une meilleure distinction entre souches sensibles et souches résistantes. Un rapport inférieur ou égal à quatre permet de définir un produit fongicide [8].

Indications

La détermination de la sensibilité in vitro des levures ou champignons filamenteux aux antifongiques permettra de guider la thérapeutique antifongique chez les patients. Ces tests permettent également de préciser l’épidémiologie locale et de détecter l’émergence de résistance [3].

Les méthodes d’antifongigramme

Différentes techniques sont disponibles, il existe des techniques de microdiluition en milieu liquide et des techniques de diffusion en milieu gélosé. Certaines sont commercialisées et bien adaptées aux tests réalisés en routine dans les laboratoires de biologie médicale. En revanche, les techniques de référence ne sont pas commercialisées et seront plutôt utilisées comme techniques de confirmation, pour les études épidémiologiques ou à des fins de recherche.
Les techniques peuvent également être différentes en fonction du type de champignon à tester (levures ou champignon filamenteux).
Le principe général est d’évaluer l’inhibition de la croissance du champignon en présence de l’antifongique. Pour l’ensemble de ces techniques, il est donc nécessaire d’isoler la souche en culture à partir du prélèvement [3].

Technique de microdilution en milieu liquide

Le principe de ces techniques est d’évaluer la croissance du champignon dans des puits ou cupules en présence de concentrations croissantes (progression géométrique de raison 2) d’un antifongique donné. Le plus souvent, ces techniques sont réalisées dans des plaques de 96 puits. La plus petite concentration pour laquelle la croissance du champignon est inhibée détermine la concentration minimale inhibitrice (CMI). La définition de l’inhibition de la pousse (partielle ou complète) est variable en fonction de l’antifongique et du type de champignon (levure ou  champignon filamenteux) [3].

Techniques de référence

Il existe deux techniques de référence : la technique CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) et la technique EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility).
Ces méthodes n’étant pas commercialisées, elles sont réalisées uniquement par des centres de référence [19].

Méthode CLSI

En 1992, après plus de 10 années d’études au sein du comité de standardisation des techniques biologiques à utilisation médicale, les Américains ont défini les paramètres permettant de déterminer la sensibilité des levures aux principaux antifongiques systémiques. Réalisée initialement en tubes (macrodilutions), la méthode CLSI a rapidement été adaptée pour une utilisation en microplaques (microdilutions). Mais cette technique laborieuse, non commercialisée, reste l’apanage de laboratoires américains spécialisés. C’est avec cette technique que les premières CMI seuils vis-à-vis des principaux antifongiques systémiques ont pu être proposées (Tableau II) [19].

Méthode EUCAST

La méthode EUCAST est une technique européenne dérivée de la méthode CLSI. Elle s’en distingue par une concentration supérieure en glucose (2% au lieu de 0,2 %), un inoculum plus dense (1-5 x 105 UFC au lieu de 0,5-2,5 x 103 UFC) et une lecture par spectrophotométrie. Par rapport à la technique CLSI, ces modifications permettent une lecture plus rapide (24 heures au lieu de 48 heures) et la possible automatisation de lecture des plaques. Il faut souligner que les CMI obtenues par la méthode EUCAST sont généralement plus basses que celles obtenues avec la technique CLSI [19]. Les seuils de CMI définissant la sensibilité ou la résistance par la méthode CLSI ne pouvant être transposés à la méthode EUCAST, des seuils spécifiques ont été définis (Tableau II) [19].

Techniques commercialisées

Il existe plusieurs techniques commercialisées fondées sur le principe de la dilution en milieu liquide. Certaines de ces techniques présentent une bonne corrélation avec la méthode de référence. Le choix de la technique sera également déterminé par le panel d’antifongique proposé par ces tests commerciaux.
Une de ces techniques est dérivée directement de la technique de référence CLSI. Un indicateur coloré (bleu alamar) est présent dans le milieu de culture et passe du bleu au rose lors de la pousse du champignon. La CMI correspondra au dernier puits qui présente une coloration bleue (absence de pousse). Le phénomène de traine observé avec les azolés, peut donner une coloration intermédiaire (violette), ce qui rendra difficile la détermination de la CMI [3].

Techniques de diffusion en milieu gélosé

Le principe de ces techniques est de tester la pousse d’un champignon (levure ou champignon filamenteux) sur un milieu gélosé à la surface duquel on dépose un dispositif (disque ou bandelette) imprégné de l’antifongique à tester. L’antifongique va diffuser rapidement dans la gélose et après incubation et croissance du champignon, une zone d’inhibition de croissance sera visible autour du dispositif. En fonction du dispositif, on obtiendra soit un diamètre d’inhibition (disque), soit directement une CMI grâce à un gradient de concentration d’antifongique le long de la bandelette. Là encore, comme pour les techniques de dilution en milieu liquide, la définition de l’inhibition de la pousse (partielle ou complète) est variable en fonction de l’antifongique et du type de champignon [3].

Techniques de références

Le CLSI a développé des techniques de références fondées sur l’utilisation de disques imprégnés d’antifongique, une pour les levures et une pour les champignons filamenteux. Le milieu de culture utilisé est le Mueller-Hinton (MH) supplémenté avec 2% de glucose pour favoriser la pousse et avec du bleu de méthylène (0,5 μg/mL) pour une meilleure visualisation des zones d’inhibition. Le MH est également utilisé pour les champignons filamenteux mais sans supplémentation en glucose, ni incorporation de bleu de méthylène. Les disques imprégnés, d’une concentration prédéfinie d’antifongique, sont disponibles dans le commerce. La mesure du diamètre d’inhibition permet de catégoriser la souche en sensible/intermédiaire/résistant, mais ne permet pas d’en préciser les CMI [3].

Méthodes commerciales

Les tests disponibles mettent en oeuvre deux procédés :
 La diffusion de l’antifongique en milieu gélosé, sous forme de comprimés Néo-sensitab® (Rosco Diagnostic®) ou de bandelette E-test® (BioMérieux®)
 L’incorporation de l’antifongique au milieu de culture Fungitest (BioRad, Mames la Coquette, France), ATB® fungus (BioMérieux, Marcy l’étoile, France) et Candifast® (International Microbio, Signes, France), Vitek 2 AST Card® (BioMérieux®).

Méthodes de l’étude

Réisolement des souches

Les souches conservées à basse température ont été ramenées à température ambiante, avant d’être repiquées sur une gélose Sabouraud additionnée de chloramphénicol et d’actidione pendant 48 heures à 37° C.
Des colonies isolées de ces cultures jeunes ont été sélectionnées pour la réalisation de l’antifongigramme.

Réalisation de l’antifongigramme avec l’automate Vitek2®

Préparation de la cassette

Préparation et standardisation de l’inoculum

Un écouvillon légèrement humidifié a été utilisé pour prélever la partie superficielle des colonies de levures sans toucher le milieu de culture. Ensuite, les colonies ont été mises en suspension dans 3 ml de solution saline (Ref. V1204).
Enfin nous avons standardisé cette suspension selon les méthodologies appropriées en utilisant le DensiCHEK plus.

Lecture de l’inoculum

Pour la lecture de l’inoculum, nous avons procédé comme suit :
 Allumer le DensiCHEK plus et vérifier que le type de tube est correct sinon se référer au chapitre « modification du type de tube » dans manuel d’utilisation de DensiCHEK plus ;
 Placer le tube bien homogénéisé et le faire tourner, une série de tirets sera suivie de la valeur Mac Farland, s’assurer qu’elle soit comprise dans une plage acceptable pour le germe testé (Tableau III).

Préparation des suspensions pour l’antifongigramme

 Utiliser la pipette manuelle fournie avec le système, transférer dans un second tube contenant 3 ml de solution saline, la quantité préconisée : 280 μL pour les levures ;
 Puis placer les cartes sur la cassette en plongeant leur paille de transfert dans les tubes ;
 Déposer côte à côte les cartes d’identification et d’anfongigramme d’une même souche.

Utilisation de l’instrument

Chargement de la cassette pour inoculation. – Charger la cassette (dans un délai maximum de 30 minutes) dans la chambre d’inoculation. Fermer la porte et appuyer sur le bouton « lancer remplissage ». Un voyant lumineux indique au bout de 70 secondes que le cycle de remplissage est terminé.
Chargement de la cassette dans le lecteur-incubateur. – Retirer la cassette, la placer dans le lecteur-incubateur (dans un délai maximum de 10 minutes) puis refermer la porte. Un voyant lumineux clignotant indique que le chargement est terminé, retirer la cassette vide du lecteur-incubateur. Vérifier que le volume des tubes témoigne du remplissage correct des cartes. A la fin de l’analyse, les cartes usagées sont éjectées automatiquement dans le collecteur de déchets intégrés.

Démarrage de Windows®

 Au démarrage de l’ordinateur, saisir le code d’utilisateur et le mot de passe Windows
 L’écran principal s’affiche, double cliquer sur l’icône V2 pour ouvrir l’application VITEK®2;
 Saisir l’ID utilisateur, puis passer au champ suivant avec la touche « Tab » ou la souris et saisir le mot de passe pour accéder à l’application VITEK 2 système
 L’affichage principal de l’application VITEK2 Compact s’ouvre, présentant le menu avec ses 6 icônes ;
 Sélectionner l’icône « Gestion des cassette »
 Sélectionner la ligne (en surlignant en bleu sombre) correspondante à la carte antifongigramme
 Puis cliquer sur l’icône « Saisir les données de l’isolat »
 Sélectionner le nom du germe en utilisant la liste déroulante correspondante.
 Les champs « Tests additionnels AST » et « Quantité de germes » sont facultatifs.

Interprétation des résultats [6]

L’obtention d’une valeur de CMI (ou d’un diamètre d’inhibition) est interprétée pour permettre la catégorisation des souches en sensible / intermédiaire / résistant.
 CMI: plus faible dilution d’antifongique montrant une inhibition de croissance de 80 à 100% par rapport à un contrôle de pousse sans antifongique (cupule contrôle) ;
 Sensible (S): il s’agit de souches pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique, dans le cas d’un traitement à dose habituelle est acceptable.
La quantité d’antifongique se trouvant dans les cupules est suffisante pour inhiber la croissance de la souche in vitro ;
 Intermédiaire (I): il s’agit de souches pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. L’action de l’antifongique sur la souche n’est pas garantie.
 Résistante (R): il s’agit de souches pour lesquelles il existe une forte probabilité d’échec thérapeutique. L’antifongique n’inhibe pas la croissance de la souche in vitro.
Cette étape est réalisée en comparant la valeur de CMI (ou de valeur d’inhibition) avec des seuils de sensibilités cliniques (CBP, Clinical Breack Point) qui doivent être déterminés pour chaque technique et pour chaque espèce.
L’EUCAST et le CLSI ont ainsi défini des seuils pour les principaux Candida impliqués en pathologie, et pour un certain nombre d’antifongiques (Tableau IV), avec mise à jour régulière des seuils réalisée par les comités de référence [3].

Discussion

Dans un cadre épidémiologique, l’objectif de cette étude était de déterminer le profil de sensibilité de différentes souches de Candida provenant d’une collection du laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU Le Dantec de Dakar, avec au bout une détermination des valeurs de CMI des antifongiques vis-à-vis des espèces et/ou souches.
L’étude de la sensibilité aux antifongiques a été réalisée par méthode de diffusion en milieu liquide grâce à la carte AST-YS08 sur l’automate Vitek® 2.
Cet automate permet une détection fiable et rapide des plus faibles niveaux de résistance des souches de Candida avec un gain de temps de moins de 24 heures.
La performance de l’antifongigramme du système Vitek 2 sur Candida spp., a été déjà démontrée par des études ultérieures [1, 16] Ainsi, il a été démontré que les résultats d’antifongigramme fournis par le système Vitek 2 sont superposables à ceux de la méthode conventionnelle et ceux du E-test [1, 16] avec un gain de temps de moins de 24 heures.
Concernant les souches de cette étude, elles ont été constituées de 37 souches cliniques isolées de CVV avec C. albicans (n= 27), C. tropicalis (n= 6), C. glabrata (n= 3) et C. parapsilosis (n= 1). Pour une première fois, le nombre de souches ne nous a pas semblé aussi important que la diversité des espèces. Ainsi, malgré un nombre de souches légèrement plus important de 45, Djohan et al, [12] en Côte d’Ivoire ont travaillé uniquement sur C. albicans. Toutefois, c’est un nombre de souches négligeable, comparé aux 2099 souches étudiées par Lei et al, en 2018 sur une période de collecte de 5 ans [18].
Sur les souches de C. albicans étudiées, toutes ont été sensibles au fluconazole, aux échinocandines et à l’amphotéricine B selon l’interprétation du système Vitek 2.
Des résultats similaires ont été retrouvés à Tunis en 2016 [9] avec toutefois une résistance notée vis-à-vis du fluconazole (6 cas sur 46) contrairement à nos résultats.
La résistance au fluconazole concernerait 2% des souches de C. albicans surtout chez les sujets à risque d’infections fongiques (RIF) soumises à une prophylaxie au fluconazole [10].
L’absence de tel protocole prophylactique dans notre contexte pourrait expliquer l’absence de la résistance au fluconazole de nos souches.
En tenant en compte des valeurs CBP de l’Eucast, une souche de C. albicans a exhibé une sensibilité intermédiaire aux échinocandines avec une CMI de 0,5μg/mL vis-à-vis de la micafungine et de la caspofungine (S : ≤0,25μg/mL et R≥ 1μg/mL).
En effet, les échinocandines constituent une alternative pour le traitement des souches de levures résistantes aux azolés mais récemment une émergence des souches de Candida résistantes aux échinocandines a été notée. Cette résistance serait liée à une exposition prolongée aux échinocandines, particulièrement chez les sujets à RIF avec des épisodes récurrents de candidémies [21].
Paradoxalement, ces molécules d’échinocandines ne sont même pas encore disponibles au Sénégal pour imaginer une éventuelle pression médicamenteuse. Ainsi, une probable mutation des gènes FKS1 et FKS2, responsables d’une modification de la cible (b-1,3-D-glucane synthase), [21] serait plus probable.
Les cas de résistance de C. albicans que nous avons observés au cours de notre étude ont concerné le flucytosine (1 cas sur 27, avec une CMI très élevée ≥64μg/mL) et le voriconazole (2/27) avec des CMI très élevées de 32 (4 μg/mL) à 64 (8μg/mL) fois le CBP du voriconazole. Pareillement, en 2012 à Abidjan (Côte d’Ivoire) [12], ont enregistré cinq cas résistance de C. albicans au voriconazole sur une collection de 45 souches. Cependant, ils n’ont observé aucune résistance concernant le flucytosine.
Par contre aucune résistance au voriconazole n’a été notée sur une série de 89 souches de C. albicans testées dans une étude réalisée en Italie en 2018 [23].
Même si dans notre étude cette résistance au voriconazole n’a concerné que 2 souches sur 27, elle semble étonnante alors que les souches en question exhibent une sensibilité au fluconazole avec des CMI respectives basses ≤0,5 et à 1 μg/mL.
Sur les six souches de C. tropicalis, une totale sensibilité a été retrouvée vis-à-vis de tous les antifongiques testés.
Cette totale sensibilité de C. tropicalis retrouvée dans notre étude serait son profil habituel de sensibilité aux antifongiques [10].
Contrairement à nos résultats, des taux de résistance de C.tropicalis au fluconazole, 27% (11/41) et au flucytosine, 10% (4/41) avec respectivement des CMI ≥ 64 μg/mL et ≥ 32 μg/mL ont été observés dans une étude réalisée au Canada en 2000 [25]. Une résistance de C. tropicalis au voriconazole avec une seule souche sur une série de douze a été décrite en Tunisie en 2016 [9]. Selon la littérature, C. tropicalis exhibe une résistance aux azolés, plus particulièrement au fluconazole avec comme mécanisme une augmentation du nombre des pompes à efflux [21]. Les trois souches de C. glabrata testées au cours de cette étude ont exhibé une totale sensibilité à l’amphotéricine B, aux échinocandines, à la flucytosine et au voriconazole, en se conformant aux interprétations du système Vitek 2.
Ces observations sont comparables à celles retrouvées en Tunisie en 2016 [9]. Par contre elles ont montré une sensibilité intermédiaire au fluconazole (CMI à 16 μg/mL).
Une mauvaise activité du fluconazole sur les souches de C. glabrata a été observée en Iran en 2011 avec un taux de résistance de 60 % (48/80) [5] et des CMI ≥ 64 μg/mL. Également en 2018 en Italie, Scapaticci et al, [23] ont observé une sensibilité intermédiaire au fluconazole de toutes leurs souches de C. glabrata (19/19).
En général, C. glabrata a une faible sensibilité aux azolés due à une surexpression des pompes à efflux comme pour les autres espèces de Candida. Cette résistance étant le plus souvent en réaction croisée pourrait justifiée la sensibilité intermédiaire au voriconazole.
Nos résultats ont montré une sensibilité de la souche de C. parapsilosis à tous les antifongiques selon les interprétations du système Vitek 2. Toutefois, en se référant aux valeurs CBP de l’Eucast, la sensibilité de la souche est intermédiaire vis-à-vis des échinocandines avec une CMI à 0,5 μg/mL.
Les résultats de notre étude sur l’activité de la caspofungine sur la souche de C. parapsilosis ont été superposables à ceux retrouvés dans l’étude de Badiee et al, en Iran [5].

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIÈRE PARTIE: RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. Les levures du genre Candida et la candidose vulvovaginale
I.1. Morphologie et taxonomie des Candida
I.2. La vulvovaginite à Candida
I.3. Diagnostic de la candidose vulvovaginale
I.3.1. La culture
I.3.2. Identification des Candida
I.4. Traitement de la candidose vulvovaginale
I.4.1. Agents topiques pour la vaginite à Candida aiguë
I.4.2. Agents antimycotiques oraux
I.5. Mécanismes de la résistance acquise
II. Test de sensibilité aux antifongiques : l’antifongigramme
II.1. Indications
II.2. Les méthodes d’antifongigramme
II.2.1. Technique de microdilution en milieu liquide
II.2.1.1. Techniques de référence
II.2.1.2. Techniques commercialisées
II.2.2. Techniques de diffusion en milieu gélosé
II.2.2.1. Techniques de références
II.2.2.2. Méthodes commerciales
DEUXIEME PARTIE: ETUDE EXPERIMENTALE
I. Cadre d’étude
II. Type et période d’étude
III.. Matériels et méthodes
III.1. Matériels de l’étude
III.1.1. Souches de Candida
III.1.2. Matériels de travail
III.2. Méthodes de l’étude
III.2.1. Réisolement des souches
III.2.2.Réalisation de l’antifongigramme avec l’automate Vitek2®
III.2.2.1. Préparation de la cassette
III.2.2.2. Utilisation de l’instrument
III.2.2.3. Démarrage de Windows®
III.2.2.4. Affichage des résultats
III.2.2.5. Interprétation des résultats
IV. Analyse statistique
V. Résultats
V.1. Caractéristiques des souches de Candida
V.2. Susceptibilité des Candida vis-à-vis des antifongiques testés
V.3. Profil de sensibilité et CMI spécifiques vis-à-vis des espèces
V.3.1. Candida albicans
V.3.2. Candida tropicalis
V.3.3. Candidaglabrata
V.3.4. Candida parapsilosis
VI. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES

Télécharger le rapport complet