Développement et optimisation d’une méthode de détection des drogues

Depuis de nombreuses années, la compréhension de l’être humain a préoccupé les plus grands esprits. Différentes études ont été menées afin de mettre le doigt sur des questions existentielles sur l’homme et ce qui le compose. Ces études ont pu être réalisées grâce à la création et l’utilisation de technologies récentes qui ont pu affirmer certaines observations. En 1590, Hans et Zacharias Hansen inventèrent le premier instrument donnant accès à l’infiniment petit, le microscope [1]. Suite à cette découverte, la nécessité d’observer des éléments de plus en plus petits a conduit à pousser toujours plus loin les limites de l’observation et inventer de nouveaux appareillages toujours plus performants [2]. L’introduction de l’imagerie a permis d’évoluer dans le domaine de la biologie et de la médecine en passant d’une étude globale à une analyse moléculaire permettant d’observer des substances telles que des protéines, des peptides ou des métabolites. La recherche s’est orientée ainsi progressivement vers des investigations dites « omiques » telles que la génomique, la protéomique et plus récemment la métabolomique. Parallèlement, les progrès et les innovations dans la spectrométrie de masse (MS), en termes de sensibilité et de sélectivité, ont également entraîné le développement de ces nouvelles études [3]. La MS est ainsi devenue le constituant essentiel de la plate-forme analytique. Dans ce contexte, de nombreuses stratégies MS ont été élaborées pour mettre en évidence ou surveiller des molécules d’intérêt dans des biomatrices [4]. Parmi elles, l’une des approches les plus innovantes et stimulantes a été le développement de technologies d’imagerie. Ainsi, un nouvel outil puissant a fait son apparition dans le secteur du diagnostic par MS, l’imagerie par spectrométrie de masse (IMS). L’IMS est une technique analytique qui permet de cartographier la distribution de divers analytes dans des sections tissulaires, allant des protéines vers des molécules plus petites telles que les lipides, les drogues ou les médicaments. L’instrument enregistre les spectres de masse pour chacun des points disposés de manière régulière sur l’ensemble du tissu. Ces deux informations importantes (spectre et coordonnée) permettent de reconstruire des images ioniques au moyen d’outils informatiques. A partir d’une seule acquisition, il est alors possible d’observer autant d’images qu’il y a de molécules associées et voir leur localisation sur le tissu (figure A) [5]. Cette technique offre une grande sélectivité car la distinction entre les composés et les métabolites se fait facilement grâce à la spectrométrie de masse. Il est ainsi possible également de localiser la distribution d’un médicament parallèlement à un marqueur d’une maladie en progression comme le cancer [6]. Dans la dernière décennie, de nombreux efforts ont été entrepris pour développer des méthodologies et des instruments pour l’IMS [7,8]. Ces efforts ont conduit à sa reconnaissance dans le monde entier en raison de son potentiel clinique pour le diagnostic et le pronostic. Cependant, l’IMS est encore un nouvel outil qui est actuellement en cours de développement pour pousser la technologie vers l’avant et la rendre plus régulièrement accessible aux utilisateurs. Dans ce contexte, l’amélioration de la vitesse d’imagerie, la résolution spatiale et la sensibilité sont des questions et des défis techniques particulièrement importants dans le domaine de l’IMS.

La spectrométrie de masse a été longtemps utilisée afin d’analyser des composés peu polaires, volatils et stables à la chaleur mais de nouvelles techniques d’ionisation ont étendu le domaine d’analyses aux biomolécules fragiles telles que les protéines ou les acides nucléiques [10]. L’une d’entre elles est l’ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) qui a été découverte en 1987 et qui a connu un grand succès. Cette technique fonctionne à l’aide d’un laser UV qui va balayer le tissu recouvert d’un dépôt de matrice dont les cristaux formés co-cristallisent avec les analytes. L’énergie du laser est absorbée par la matrice et provoque une sublimation qui va entraîner la matrice et les analytes afin d’être ionisés [11]. Cette forme d’ionisation a facilité la détection de divers composés dans des mélanges complexes. Sur cette idée, à Nashville aux Etats Unis, Richard M.Caprioli et son groupe de recherche ont étendu les analyses aux coupes de tissu et ont étudié la distribution des peptides et protéines dans des tumeurs cérébrales (glioblastome) grâce à l’IMS MALDI [12]. Il a été possible, en effectuant « un profilage », c’est-à-dire en effectuant l’acquisition de quelques points à différents endroits « sains et malades » du tissu, d’associer des pics de molécules à différentes zones histologiques et détecter ainsi des marqueurs caractéristiques tels que le marqueur T.4 lié à une tumeur cérébrale. De la même manière, en effectuant une plus grande acquisition de points, il a été possible d’obtenir une image donnant plus d’informations quant à la distribution spatiale et à l’intensité du composé choisi (Figure B).

MATERIEL

Echantillons

L’échantillon de foie de rat utilisé pour la première partie du projet provient du laboratoire de toxicologie et chimie forensique de Genève. Les échantillons humains de foie et cortex cérébrale contaminés à la MDMA, à la quétiapine, à la trazodone, au midazolam et le cerveau dopé à la cocaïne employés pour l’imagerie et le screening toxicologique sont issus d’autopsies réalisées au cœur du centre universitaire romand de médecine légale (CURML) sous les n° d’autopsies 288/15, 160133-M, 160178-M et 308/15.

Appareillages

Les différents appareils employés tout au long de ce travail se trouvent dans le laboratoire de toxicologie et chimie forensique (UTCF) du centre universitaire romand de médecine légale de Lausanne et sont décrits ci-dessous.
• Lames de microscope ThermoFisher Scientific SuperfrostTM Plus 75 x 25 x 1mm
• Microcentrifugeuse (Techne Cambridge force 16, witec Ag)
• Cryostat (Leica CM1860 UV)
• Sprayer MALDI spotter Suncollect (SunChrom)
• Spectromètre de masse MALDI LTQ XL (Thermo Scientific)
• Logiciels: Thermo Tune Plus, ImageQuest, Xcalibur data system, MsiReader .

Produits

Le méthanol, l’acétonitrile, l’eau et l’acide trifluoroacétique sont de qualité ́ ULC-MS et proviennent de Biosolve (référence méthanol : 136841, acétonitrile : 1204101, eau: 232141, acide trifluoroacétique : 202341). L’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) et l’acide -cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), composants principaux de la matrice, sont de pureté ≥99.0% HPLC et sont obtenus auprès de la firme Sigma Aldrich (référence DHB : 85707-1G-F) et Fluka Analytical (référence CHCA : 70990 1G-F). Les standards de drogues à 1mg/ml dissoutes dans du méthanol ont été commandés auprès de la firme Lipomed (référence amphétamine : AMP-95-HC 1LM, MDMA: MDM-94-HC-1LM, Cocaïne: COC-156- FB-1LA, Diazepam: DIA-107-1LM, Midazolam: MID-111-FB-1LM, Citalopram: CTL-1065- HB-1LM, Quetiapine: QUE 1200-FU-1LM, Olanzapine: OLZ-1064-FB-1LA, morphine: M-35- FB-1LM, méthadone: MET-637-HC-1LM, tramadol: TRA-779-HC-1LM, 9- tetrahydrocannabinol: THC-135-1LE) et Cerilliant (Fluoxetine: F-918, amitryptiline: A923). Les produits tels que l’acide acétique de pureté  99.8% (33209) et l’acétate d’ammonium de pureté  98% (32301-100G) ont été commandés auprès de Sigma Aldrich. L’hydroxyde d’ammonium 25% est fourni par Fluka avec un n° de référence de 09861. Finalement, le milieu d’enrobage OCT a été acquis auprès de la société Leica Biosystems avec un numéro de référence de 14020108926.

Conditions de base

Les conditions de base regroupent les conditions nécessaires à la détection des quatorze drogues étudiées sans optimisation. Les conditions exigées sont une déposition homogène de la solution de drogues pour obtenir une détection dans l’entier du tissu analysé et avoir ainsi un modèle expérimental. Une application homogène de la matrice est aussi nécessaire afin d’optimiser la limite de détection et la qualité des images ioniques obtenues. Afin de répondre à ces exigences, plusieurs expériences ont été réalisées en variant différents paramètres dans le but d’obtenir les conditions requises. Premièrement, les deux matrices CHCA 15mg/ml dans 50%ACN/50%H2O/0.1%TFA et DHB 30mg/ml dans 50%MeOH/50%H2O/0.1%TFA ont été préparées en pesant chaque matrice, en les diluant dans les solvants choisis, en les centrifugeant trois fois 10min à 10’000tours/min et en récupérant le surnageant entre chaque centrifugation pour éviter par la suite une obstruction du capillaire du sprayeur. Puis, elles ont été utilisées sur des tissus non dopés pour étudier à blanc le nombre de couches de matrice nécessaires à l’extraction. Pour cela, 10 et 15 couches de chaque matrice ont été sprayées à une vitesse de 10µl/min pour la couche 1, 20 µl/min pour la couche 2, 30µl/min pour la couche 3 et 40µl/min pour les couches 4 et suivantes avec l’appareil SunCollect sur quatre tissus différents (figure H). Les tissus ont été préparés préalablement en découpant à l’aide du cryostat à -20°C des sections de 12µm d’épaisseur de foie et en les déposant sur une lame à microscope. Les paramètres utilisés pour le sprayeur et la découpe ont été optimisés au cours d’une étude précédente réalisée dans l’unité de toxicologie et chimie forensique.

Après avoir obtenu les conditions minimales d’extraction pour chaque matrice, il a été question d’étudier la déposition homogène du mélange de drogues afin d’avoir un modèle expérimental nécessaire pour optimiser les protocoles. Les concentrations de 1µg/ml et 10µg/ml dans 50% ACN / 50% H2O / 0.1% TFA ont été testées mais afin de se rapprocher d’une concentration réelle, la concentration de 1µg/ml a été retenue. Ensuite, le spottage manuel avec une pipette de volume de 0.2µl et 1µl et le sprayage automatique avec SunCollect de la solution de drogue ont été expérimentés. Ces deux opérations ont été réalisées sur et sous le tissu [40] pour examiner la meilleure absorption du tissu en variant le volume déposé pour le spottage (0.2µl et 1µl) et en modifiant le nombre de couches déposées et la vitesse d’application en µl/min pour le sprayage.

Table des matières

1. INTRODUCTION
2. MATERIEL
2.1 ECHANTILLONS
2.2 APPAREILLAGES
2.3 PRODUITS
3. METHODES
3.1 CONDITIONS DE BASE
3.2 OPTIMISATION DE LA DETECTION
3.3 IMAGERIE DE CAS REELS
3.4 SCREENING TOXICOLOGIQUE
4. RESULTATS ET DISCUSSION
4.1 CONDITIONS DE BASE
4.2 OPTIMISATION DE LA DETECTION
4.3 IMAGERIE DE CAS REELS
4.4 SCREENING TOXICOLOGIQUE
5. CONCLUSION
6. BIBLIOGRAPHIE
7. ANNEXES
7.1 APPAREILLAGE MALDI LTQ ORBITRAP
7.2 PRODUITS ET SECURITE
7.3 OPTIMISATION DE LA DETECTION
7.4 IMAGERIE DE CAS REELS
7.5 SCREENING TOXICOLOGIQUE

Télécharger le rapport complet