Développement et évaluation de stratégies de lutte biologique

Organisation de la filière plant de pomme de terre en France

             Créée en 1932, la FN3PT regroupe depuis l’origine les syndicats de producteurs de plants de pommes de terre admis au contrôle officiel. Depuis 1994, elle coordonne au niveau national ses 3 OP, le CNPPT (Comité Nord Plants de Pomme de Terre créé en 1980), BP (Bretagne Plants créé en 1970) et le CCS (Comité Centre et Sud créé en 1978). Leurs missions sont nombreuses : le contrôle et la certification des plants par délégation du Ministère de l’Agriculture (figure 1), la production de matériel de départ (boutures, mini-tubercules), l’amélioration des techniques de production et l’appui technique aux producteurs de plants français, la création variétale, l’organisation économique du secteur et la promotion générique du savoir-faire français. Les 3 OP disposent d’importants moyens techniques (figure 2) : Centres techniques (Achicourt dans le Pas-de-Calais, Hanvec dans le Finistère et Lavergne en Haute-Vienne) équipés de laboratoires modernes de contrôle qualité et de pathologie ainsi que d’installations expérimentales (en partie agréées B.P.E. (Bonnes Pratiques d’Expérimentation) pour réaliser des essais reconnus officiellement pour l’homologation de produits phytosanitaires) ; les 3 laboratoires sont agréés par les services officiels (GNIS-SOC et DGAL) et bénéficient d’accréditations par le COFRAC en bactériologie, virologie et nématologie (norme 17025). 3 stations de création variétale : Bretteville-du-Grand-Caux (76), Kerloï (29) et Lavergne (87). 1 réseau de techniciens spécialisés chargés du contrôle en culture par délégation du ministère mais impliqués aussi dans des actions de développement et de conseil techniques auprès des producteurs.

Taxonomie

                La maladie de la jambe noire et de la pourriture molle sur pomme de terre est provoquée par des bactéries appartenant aux genres Pectobacterium et Dickeya, qui étaient autrefois regroupés dans le genre bactérien Erwinia (respectivement E. carotovora et E. chrysanthemi). Appartenant à la famille des Entérobactéries, il s’agit de bactéries à Gram négatif, aéroanaérobies facultatives, ayant une forme de bâtonnet (bacilles de 0.5-1 * 1-3 μm) et munies d’une ciliature flagellaire péritriche (Perombelon et Kelman, 1980 ; Hauben et al., 2005 ; Charkowski, 2007). Depuis sa création, de nombreux nouveaux genres et espèces bactériennes ont été définis à partir du genre Erwinia, aboutissant à des propositions de remaniement dans la taxonomie des souches au sein du genre qui apparaissent déjà dans la bibliographie des années 1990-2000 (Costa et al., 2006 ; Paulin et al., 2001). Un important arsenal de méthodes taxonomiques était disponible pour classer les souches responsables de pourriture molle au sein des espèces d’Erwinia (voir ci-après). Waldee proposa en 1945 de définir d’un côté le genre Erwinia pour les pathogènes occasionnant des nécroses sèches ou des flétrissements des plantes (telle qu’E. amylovora) et de l’autre le genre qu’il nomma, Pectobacterium intégrant les bactéries phytopathogènes pectinolytiques (E. carotovora et E. chrysanthemi) responsables de pourriture molle. Alors non unanimement reconnus par la communauté scientifique, ce n’est que par les études des séquences 16S de l’ADN ribosomique (rrs ou 16S rDNA) pour l’étude de la phylogénie des agents responsable de la pourriture molle au sein des Erwinia que ces genres ont été finalement acceptés (Hauben et al., 1998 ; Kwon et al., 1997). Hauben et al. (2005) dans la seconde édition du Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology ainsi que les travaux récents de taxonomie de Gardan et al. (2003) et Samson et al. (2005) se basant sur des techniques moléculaires, phénotypiques, sérologiques et des analyses phylogénétiques ont proposé une nomenclature pour les pectinobactéries dont celles associées à la pomme de terre : Pectobacterium atrosepticum (Pa) et P. carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) alors qu’Erwinia chrysanthemi est devenu Dickeya spp., regroupant différentes espèces comme Dickeya dadantii, D. zeae, D. paradisiaca, D. dianthicola (Ddi) (Samson et al., 2005 ; Tsror et al., 2009, Toth et al., 2011) et l’espèce D. solani (Dsol) plus récemment décrite (Van der Wolf et al., 2014). Par ailleurs, récemment de nouvelles sous-espèces de Pectobacterium telles que P. carotovorum subsp. brasiliense et P. wasabiae ont été associées aux symptômes de pourriture molle sur tubercule ou de jambe noire sur pomme de terre au Brésil (Duarte et al., 2004), Afrique du Sud (Van der Merwe et al., 2010 ; Moleleki et al., 2013), Finlande (Nykyri et al., 2012), Pays-Bas (Nunes Leite et al., 2014) ou France (Hélias et al., 2014 ; Khayi et al., 2015a). La figure 7 reprend les Pectobacterium et Dickeya associées aux symptômes de jambe noire et de pourriture molle sur la culture selon Czajkowski et al. (2015a).

Répartition géographique des pathogènes

                Parmi les espèces bactériennes responsables de la pourriture molle et la jambe noire sur pomme de terre, Pa, Pcc, Ddi et Dsol ont été étudiées dans ce travail. La répartition géographique de ces bactéries est principalement conditionnée par leurs exigences thermiques de croissance. L’espèce P. atrosepticum, répandue dans les régions tempérées, infecte presque exclusivement la pomme de terre (Toth et al., 2003 ; Gardan et al., 2003) sans doute parce que la plupart des souches de Pa, forment un groupe homogène et sont plus sensibles aux températures élevéesque Pcc et Dickeya spp. (Pérombelon et Kelman, 1980). Néanmoins, certaines souches de Pa ont été occasionnellement isolées à partir de tomate (Gardan et al., 2003 ; Hélias et al., 2008), de chou chinois (De Boer et al., 1987) et de poivron (Stommel et al., 1996). Aujourd’hui, en France, selon les derniers relevés d’epidémiovigilance réalisés au sein de la FN3PT-RD3PT il apparait comme l’agent principal responsable de la maladie de la jambe noire, ce qui peut être mis en lien avec la concordance entre les exigences écologiques de la bactérie et celles de laculture de pomme de terre (Pérombelon, 1992). Son développement préférentiel de croissance est obtenu pour des températures comprises entre 15 et 25 °C (Pérombelon et Kelman, 1987). Pcc quant à lui, est distribué sur une aire géographique plus vaste aussi bien dans les zones tempérées que tropicales et sur une gamme d’hôtes très large sur lesquels il est responsable de la pourriture molle (pomme de terre, choux, poivrons, carotte, maïs…) (Perombelon et al., 1987). Cette bactérie se développe à des températures plus élevées que P. atrosepticum, allant de 20 à 30 °C et peut également être isolée à partir de plantes cultivées à des températures plus élevées allant jusqu’à 40 °C. Pa et Dickeya ont été pendant longtemps identifiés comme des agents préférentiellement associés à la maladie de jambe noire (Pérombelon, 2002 ; Hélias et al., 2000 ; Toth et al., 2003). Certains scientifiques ont montré dans leurs travaux que Pcc était également capable de provoquer la jambe noire sur pomme de terre dans les zones tempérées du globe (Molina & Harrison 1977 ; De Haan et al., 2008, Hélias et al., 2008). Enfin, les Dickeya sévissent principalement en zone tropicale et subtropicale sur de nombreuses cultures d’intérêt agronomique telles que la pomme de terre, la banane, l’artichaut ou le maïs mais aussi sur des plantes ornementales comme le chrysanthème, le saintpaulia ou l’œillet (Pérombelon, 2002 ; Gardan et al., 2003 ; Charkowski, 2007). Toutefois, le genre Dickeya est depuis une dizaine d’années retrouvé dans les régions tempérées (Europe de l’Ouest et du Nord) notamment en Allemagne, France, Pays-Bas, Pologne, Israël (figure 11). Les dommages sur culture de pommes de terre en Europe sont uniquement dus à D. dianthicola et D. solani. Dans ces zones, les espèces sont également décrites sur d’autres plantes-hôtes comme la tomate, le chou ou l’endive (Tsror et al., 2009 ; Toth et al., 2011, Reverchon et Nasser, 2013) pour D. dianthicola et plantes ornementales pour D. solani.

Le sol et la rhizosphère des plantes

               Les propriétés physico-chimiques du sol peuvent également influencer l’expression de la maladie, favoriser la contamination des tubercules ou plantes mais aussi modifier les équilibres microbiologiques. Les sols ayant une capacité élevée de rétention d’eau (argilo-humiques) favorisent les conditions humides nécessaires au développement bactérien. D’autre part, en créant une atmosphère asphyxiante, les sols compacts favorisant l’humidité sont propices au développement des bactéries pectinolytiques aux alentours des racines (rhizosphère) et augmentent les risques d’infection (Bain et al., 1990).

Les pratiques agricoles comme facteurs de contamination

              Le passage de machines agricoles dans les parcelles en cours de culture constitue un facteur de dissémination des bactéries. La plantation, le défanage, la récolte puis le conditionnement mécanique des tubercules sont autant de facteurs de propagation des pathogènes sur pommes de terre. Ils peuvent être le point initial de contamination au sein des stocks de plants qui serviront de semences l’année suivante. Cette contamination a lieu lors du contact de tubercules sains avec des tubercules, portions de végétaux ou des matériaux infectés (Van Vuurde et de Vries, 1994). Un défaut de désinfection du matériel et les blessures occasionnées lors de la manipulation mécanique favorisent les contaminations (Elphinstone et Pérombelon, 1986). L’effet des précédents culturaux semble avoir un rôle dans la contamination des cultures de pommes de terre. McCarter-Zorner et al. (1985) ont observé la présence de Pa et Pcc au sein de la rhizosphère de différentes cultures (laitues, carottes et betteraves à sucre). Les cultures de Brassicaceae (brocoli, colza, rutabaga, navet et chou) sont reconnues comme hébergeant fréquemment les Pa et Pcc et à des niveaux relativement élevés (McCarter-Zorner et al., 1985; Pérombelon et al., 1989). Ces bactéries sont également isolées à partir de rhizosphères d’adventices (laiteron, mouron, pâturin, amarante, chénopode blanc et renouée) (McCarterZorner et al., 1985). L’importante gamme d’hôtes de ces pathogènes laisse supposer que d’autres adventices pourraient permettre leur maintien dans l’environnement. D’autre part, certaines cultures seraient plus à même de jouer un rôle de plantes réservoirs pour certains Pectobacterium ou Dickeya plutôt que d’autres (non publié, source FN3PT/RD3PT). Enfin, les pratiques agricoles comme l’arrosage par aspersion sur des tiges malades peuvent également disperser Pa et Pcc sur plusieurs mètres (Graham & Harrison, 1975). En outre, le lavage des tubercules avant leur commercialisation peut disséminer la bactérie dans les lots de pomme de terre lorsque l’eau servant au lavage n’est pas renouvelée ou décontaminée (Pérombelon & Kelman, 1980).

Huiles minérales ou végétales

            De récentes études traitent de l’effet d’huiles végétales ou minérales pour lutter contre des pathogènes des cultures, dont la pomme de terre, soit dans le but de réduire leur impact soit pour contrôler une de leurs propriétés. Ainsi, Vokou et al., en 1993 ont montré que des huiles végétales ou essentielles (Coridothymus capitatus, Origanum dictanus et Satureja thymbra) avaient une action anti-microbiennes contre Pa et Pcc. D’autres huiles issues de Cinnamomum zeylanicum, Corydothymus capitatus et Origanum heracleoticum ont inhibé à plus de 80% la croissance in-vitro de Pa (Dabiré, 2009). Cependant aucun produit efficace de lutte biologique contre les Pectobacterium ni les Dickeya n’est disponible commercialement (Charkowski et al., 2006 ; Czajkowski et al., 2012). L’ensemble des techniques décrites ne sont pas exclusives et pourraient être associées dans une pratique de lutte intégrée contre Pectobacterium et Dickeya. L’impact environnemental et l’efficacité de ces nouvelles stratégies de lutte doivent être évalués avant leur commercialisation.

Table des matières

Avant-propos
Chapitre I : Introduction Générale
Partie 1. La filière du plant de pomme de terre en France 
1.1 Organisation de la filière plant de pomme de terre en France
1.2 Production du plant de pomme de terre en France
1.2.1 La filière plant en quelques chiffres
1.2.2 Un contrôle qualité à toutes les étapes du schéma généalogique de production
1.3 Importance de la recherche dans la filière plant en France
1.4 Evolution de l’agriculture
Partie 2. Introduction Bibliographique 
2.1 Connaissances générales sur les agents de la jambe noire et de la pourriture molle sur pomme de terre
2.1.1 Taxonomie
2.1.2 Caractérisation des bactéries pectinolytiques
2.1.3 Symptomatologie
2.1.3.1 Au champ
2.1.3.2 En stockage
2.1.4 Répartition géographique des pathogènes
2.1.5 Incidence de la maladie de jambe noire et de pourriture molle sur plant
2.2 Epidémiologie des maladies causées par Pectobacterium et Dickeya
2.2.1 Cycle des maladies de la jambe noire et de la pourriture molle
2.2.2 Sources d’inoculum
2.2.3 Facteurs de dissémination et de développement
2.2.3.1 Conditions environnementales favorables
2.2.3.2 Le tubercule mère
2.2.3.3 Le sol et la rhizosphère des plantes
2.2.3.4 L’eau et les aérosols
2.2.3.5 Insectes et autres facteurs biotiques
2.2.3.6 Les pratiques agricoles comme facteurs de contamination
2.2.4 Pathogénicité des bactéries pectinolytiques
2.3 De la prophylaxie aux stratégies nouvelles de lutte biologique contre les bactéries responsables de la jambe noire et de pourriture molle
2.3.1 La prophylaxie
2.3.2 Traitements physico-chimiques
2.3.2.1 Les traitements physiques
2.3.2.2 Les traitements chimiques
2.3.2.3 Fertilisation des plantes et résistance à la maladie
2.3.3 La résistance végétale
2.3.3.1 Sélection variétale
2.3.3.2 L’utilisation des Plantes Génétiquement Modifiées (PGM)
2.3.4 Stratégies de lutte biologique
2.3.4.1 Stimulateurs de défenses des plantes
2.3.4.2 Compétiteurs bactériens
2.3.4.3 Bactéries ciblant le quorum-sensing et molécules d’anti-virulence
2.3.4.4 Prédateurs naturels des phytopathogènes pectinolytiques
2.3.4.5 Huiles minérales ou végétales
2.3.5 Produits commerciaux à base d’agents bactériens
2.3.5.1 Généralités sur la commercialisation des agents de lutte biologique
2.3.5.2 Produits commerciaux à base de Pseudomonas et Bacillus
Chapitre II : Pouvoir pathogène et études : génomique, métabolique et transcriptomique de deux phytopathogènes de la pomme de terre
1.1 Introduction
1.2 Matériel et Méthodes
1.2.1 Souches bactériennes et conditions de culture
1.2.2 Etude de la virulence de D. dianthicola RNS04.9 et D. solani 3337
1.2.2.1 Pathosystème tubercules hors sol
1.2.2.2 Pathosystème plante entière en serre
1.2.3 Analyse génomique des pathogènes
1.2.4 Etude métabolique
1.2.5 Etude Transcriptomique de D. dianthicola RNS04.9 et D. solani 3337
1.2.5.1 Phase exponentielle de croissance
1.2.5.2 Phase de début d’apparition des symptômes de macération
1.2.5.3 Extraction des ARN totaux bactériens
1.2.5.4 Séquençage des ARN (RNAseq ou RNA-sequencing)
1.3 Résultats
1.3.1 Virulence comparée de D. dianthicola RNS04.9 et D. solani 3337
1.3.2 Génome des pathogènes (Article 1)
1.3.3 Etude métabolique
1.3.4 Etude transcriptomique
1.4 Conclusions du chapitre II
1.5 Annexe du chapitre II
Chapitre III : Stratégie de lutte biologique ciblant les pathogènes responsables de jambe noire et de pourriture molle sur S. tuberosum
1.1 Situation des travaux
1.2 Contributions aux travaux
1.3 Mise au point de pathosystèmes en serre (pathogène-plante-sol)
1.3.1 Matériel et méthodes
1.3.1.1 Bactéries et conditions de culture
1.3.1.2 Pathosystèmes en serre
1.3.1.3 Détection de l’agent pathogène dans les tubercules de semence utilisés et dans les symptômes observés
1.3.2 Résultats
1.3.2.1 Modalité d’infection par trempage des tubercules
1.3.2.2 Modalités d’infection par arrosage de la rhizosphère (direct ou après blessure des racines)
1.3.3 Bilan de la mise au point
1.4 Article 2 : Biocontrol of the potato blackleg and soft-rot disease caused by Dickeya dianthicola
1.4.1 Introduction
1.4.2 Material and Methods
1.4.2.1 Bacterial strains and growth conditions
1.4.2.2 Isolation of bacterial strains from environmental samples
1.4.2.3 Screening for antagonistic activity against Dickeya and Pectobacterium pathogens
1.4.2.4 Screening for bioprotection on potato tubers
1.4.2.5 Calculation of the absolute fitness value (W) in competition assays
1.4.2.6 Genus identification of the antagonist strains by rrs-sequencing
1.4.2.7 Multi-locus sequence analysis of the biocontrol agents
1.4.2.8 Strain-specific qPCR primers for detecting pathogenic and biocontrol strains
1.4.2.9 Greenhouse assays
1.4.2.10 Survey and analysis of the blackleg symptoms in greenhouse assays
1.4.2.11 Detection of pathogenic populations in the tuber progeny in greenhouse assay
1.4.2.12 Monitoring of the pathogenic and biocontrol soil populations in greenhouse assays
1.4.2.13 Conversion of results from qPCR biocontrol or pathogenic populations monitoring of the greenhouse assays
1.4.3 Results
1.4.3.1 Identification of the Dickeya- and Pectobacterium-growth inhibiting bacteria
1.4.3.2 Bacterial isolates reduced the soft-rot symptoms on potato tubers
1.4.3.3 Fitness decrease of the phytopathogens in co-culture assay
1.4.3.4 MLSA-characterization of the biocontrol agents
1.4.3.5 Blackleg-symptom reduction by the biocontrol agents PA3G8, PA14H7 and PA4C2
1.4.3.6 Limitation of the dissemination of the pathogen to tuber progeny
1.4.3.7 Dynamics of the pathogenic and biocontrol agents in greenhouse assays
1.4.4 Discussion
1.5 Conclusion et Bilan du chapitre III
Chapitre IV : Recherche de nouvelles molécules chimiques perturbant la signalisation quorum-sensing
1.1 Situation des travaux
1.2 Contributions à ce travail
1.3 Article 3 : N, N’-alkylated Imidazolium-Derivatives Act as Quorum-Sensing Inhibitors Targeting the Pectobacterium atrosepticum-Induced Symptoms on Potato Tubers
1.3.1 Introduction
1.3.2 Results and Discussion
1.3.2.1 Construction of the Pectobacterium AHL-Biosensor
1.3.2.2 QSIs Identification
1.3.2.3 Biological Effects of the Identified QSIs on Pectobacterium Cells
1.3.2.4 QSIs Could Moderate the P. atrosepticum-Induced Symptoms in Potato Tubers
1.3.3 Experimental Section
1.3.3.1 Bacterial Strains and Growth Conditions
1.3.3.2 Chemical Library
1.3.3.3 Screening for QSIs
1.3.3.4 Measurement of AC50, GIAC50, MIC and MBC Values of the QSIs
1.3.3.5 Virulence Assays on Potato Tubers
1.3.4 Conclusions
1.4 Etudes complémentaires à l’article 3
1.4.1 Etudes complémentaires avec la souche bio-indicatrice d’A. tumefaciens NT1(pZNLR4)
1.4.1.1 Matériel et méthodes
1.4.1.2 Résultats
1.4.1.2.1 Identification des QSI d’Agrobacterium
1.4.1.2.2 Valeurs des IC50 et évaluation de la toxicité bactérienne (paramètres CMI/CMB) des QSI chez Agrobacterium
1.4.2 Molécules de la chimiothèque agonistes au signal QS chez Pectobacterium et Agrobacterium
1.5 Conclusions et bilan du chapitre IV
Chapitre V : Discussion générale et Travaux futurs
1.1 Discussion générale
1.1.1 Pouvoir pathogène de D. dianthicola et D. solani
1.1.2 Stratégies de biocontrôle
1.1.2.1 Les agents bactériens ciblant l’inhibition de la croissance des pathogènes
1.1.2.2 Stratégie ciblant l’expression des gènes régulés par QS
1.1.3 Lutte biologique intégrée
1.2 Perspectives
1.2.1 Perspectives sur l’étude des pathogènes
1.2.2 Perspectives des stratégies de biocontrôle
Références Bibliographiques
Résumé
Annexes

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