Développement d’un test de viabilité cellulaire et d’un modèle murin de carcinose péritonéale ovarienne

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Biocapteurs pour la détection de maladies

Des analyses biologiques utilisant des lectines comme biocapteurs ont été développées pour la détection de glycoprotéines circulantes ou membranaires [53]. Ces systèmes sont basés sur la conversion de l’interaction de lectines avec leur carbohydrate en un signal mesurable pour permettre la quantification de biomarqueurs. Ces signaux peuvent être électrochimiques, optiques, massiques, ou encore thermaux, cependant les biocapteurs électrochimiques sont les plus développés car ils sont rapides, pratiques, peu couteux et faciles d’utilisation [53,54]. Ces dispositifs vont permettre le criblage de pathogènes et le diagnostic de maladies grâce à la détection de biomarqueurs glycosidiques.
Par exemple, un biocapteur électrochimique, utilisant la Concanavaline A et des électrodes modifiées avec des nanoparticules d’or, a été décrit pour la détection de glycoprotéines dans le sérum de patients infectés par le virus de la dengue [55].
Les agglutinines de Sambucus nigra de type I (SNA-I), spécifiques des acides sialiques et immobilisées sur une surface (or), constituent un biocapteur ultrasensible. Celui-ci a été développé pour quantifier la fétuine et l’asialofétuine, des glycoprotéines sialylées ou non portant un glycotope. Ce biocapteur utilise la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) et permet la détection de ces glycoprotéines à des concentrations de l’ordre du femto-molaire. Cette sensibilité permet d’envisager son utilisation pour le diagnostic de maladies associées à des sialylations aberrantes de glycoprotéines.
Dans des échantillons biologiques, la lectine SNA-I est aussi utilisée pour la détection de l’antigène Tn sialylé (sTn), un monosaccharide coiffé d’acide sialique exprimé sur des glycoprotéines dans les
carcinomes. La SNA-I est immobilisée sur une surface faite d’électrodes en or et mise en présence de sérums provenant de donneurs sains et de patients atteints d’un carcinome. La quantification par EIS de ce biocapteur permet de distinguer les sérums d’individus sains et malades [57].
L’évaluation de la présence de mannose et d’acide sialique à la surface de cellules normales et cancéreuses peut être effectuée avec un biocapteur électrochimique fait de Concanavaline A et de SNA-I. Le mannose, détecté par la Concanavaline A, va être exprimé par les cellules normales et cancéreuses alors que les acides sialiques vont être plus nombreux à la surface des cellules tumorales. Ce biocapteur est donc également très prometteur pour le criblage de l’expression de glycanes à la surface des cellules dans le cadre d’un diagnostic précoce et de suivi de traitement [58].
Les différents exemples présentés ci-dessus permettent de faire ressortir certaines informations essentielles pour le développement d’une lectine permettant la détection de motifs glycosidiques particuliers et les applications en thérapie qui peuvent en découler. Tout d’abord, les lectines sous forme extraites et purifiées peuvent ne pas être entièrement pures. Un autre composé présentant une certaine affinité pour la lectine peut avoir été co-purifié et engendrer une compétition pour la reconnaissance spécifique du marqueur glycosidique par la lectine d’intérêt, ou agir comme un inhibiteur non compétitif faisant écran. Des effets biologiques dus au contaminant co-purifié, et non à la lectine, peuvent également être observés. La production d’une lectine sous forme recombinante permet de s’affranchir de ce paramètre puisqu’une fois le clonage et la production effectués, la purification spécifique de lectine est assurée par des colonnes d’affinité. Cependant, des contaminants provenant de l’hôte dans lequel la lectine est produite, comme les endotoxines pour une production en système bactérien par exemple, peuvent être retrouvés en sortie de purification.
Par ailleurs, l’utilisation de lectines comme marqueurs histochimiques ou biocapteurs démontrent qu’il est possible de les marquer, avec de la peroxidase, ou encore avec un fluorophore ou un isotope radioactif, sans gêner la reconnaissance du sucre.
Enfin, nous avons vu que des lectines utilisées in vivo peuvent être administrées de différentes manières dépendant de l’effet thérapeutique recherché.

La lectine de Xerocomellus Chrysenteron

Propriété insecticide, purification, et clonage de la lectine recombinante XCL
Les champignons supérieurs représentent une source potentielle de molécules susceptibles d’être utilisées dans différents domaines. A l’origine de ce travail, le groupe de Biochimie des protéines du Laboratoire de Synthèse et Physicochimie de Molécules d’Intérêt Biologique (L. Chavant, A. Klaebe, L. Paquereau et D. Fournier) cherchait à exploiter cette source en phytoprotection. Les résultats obtenus indiquaient que l’essentiel de l’activité insecticide de 14 espèces de champignons testées était dû à la présence de protéines. Certaines d’entre elles appartenaient à des familles potentiellement actives contre les insectes, comme les lectines [59] qui étaient facilement détectables. Le groupe s’est donc focalisé sur l’extraction des activités lectines les plus toxiques à partir de quatre espèces : Lespista nuda, Xerocomellus chrysenteron, Clitocybe nebularis et l’Amanite phalloïde.
La purification de ces protéines à partir des extraits bruts a été réalisée sur colonne de lactosyl-sépharose [60]. La toxicité des lectines purifiées a ensuite été testée sur D. melanogaster et c’est la lectine de Xerocomellus chrysenteron (XCL) qui présentait la plus forte toxicité [61]. Des tests d’agglutination ont démontré que la liaison d’XCL est inhibée par le D-galactose, le lactose (β-D-galactopyranosyl (1→4) D-glucose) et la N-acétylgalactosamine.
Pierre Buillard laissa la première trace écrite de ce champignon qu’il présenta comme le Bolet Chrysentere à la fin du XVIII° siècle (Figure 2). Le nom de Xerocomus chrysenteron lui est donné en 1888 par Lucien Quélet [62], pour être finalement renommé Xerocomellus chrysenteron en 2008 [63].

Liaison aux sucres et structure tridimensionnelle de la protéine XCL

Les constantes d’affinité d’XCL pour certains sucres ainsi que la résolution de la structure tridimensionnelle d’XCL ont fait l’objet de deux articles [73,74].

Liaison au motif glycosidique

La détermination par microcalorimétrie isotherme de titration (Isothermal titration calorimetry, ITC) des constantes de liaison d’XCL à différents motifs saccharidiques a donné des résultats attendus pour ce type d’interaction. Des constantes de dissociation de l’ordre du millimolaire (5mM) pour les monosaccharides, comme la N-acétylgalactosamine, imposent l’utilisation de concentrations relativement élevées en protéine pour réaliser l’expérience. La concentration d’XCL utilisée était de l’ordre de 0,4mM, soit environ 6mg.mL-1, c’est-à-dire proche de la limité de solubilité de la protéine, l’équipe n’ayant jamais pu dépasser 7mg.mL-1 (précipitation d’XCL au-delà). Pour des sucres comme le lactose ou le galactose, ces expériences ont donc été impossibles à réaliser. Vis-à-vis du disaccharide reconnu spécifiquement par XCL, l’antigène de Thomsem-Friedenreich (TF ; -D-Gal(1-3)-D-GalNac), seul ou ancré sur la Fétuine, les constantes de dissociation sont de l’ordre du micromolaire, précisément 9,4µM pour l’antigène TF seul, puis 1,7 et 0,4µM respectivement pour la Fétuine et l’Asialofétuine (Figure 6, [73]).

Dissémination depuis une tumeur primaire

Ce processus est initié par le détachement d’un groupe de cellules de la masse tumorale primaire leur permettant d’accéder et/ou de migrer dans la cavité péritonéale. Ce phénomène se produit selon différents mécanismes. L’un des plus décrits consiste en une exfoliation spontanée de cellules cancéreuses pouvant être médiée par la diminution d’expression ou la perte de fonction de molécules d’adhésion intercellulaire, comme l’E-cadhérine, à la surface de tumeurs épithéliales. Ce mécanisme est décrit pour les carcinoses péritonéales d’origine colorectale [99], gastrique [100] et ovarienne [101]. L’initiation du détachement des cellules peut aussi provenir d’une perforation iatrogénique ou spontanée de la tumeur primaire [102] entraînant la présence de cellules tumorales viables dans la cavité péritonéale qui vont se redéposer. On parle alors de dissémination.
Cette dernière va s’effectuer en s’appuyant sur 3 forces physiques : la gravité, la convection due aux mouvements péristaltiques du tractus digestif et la pression négative exercée par les mouvements du muscle diaphragmatique. Ces trois forces physiques conduisent à un sens de circulation du liquide péritonéal dans lequel baignent les cellules tumorales le plus souvent amassées en cluster [103]. Les sites d’implantation de ces disséminations vont dépendre d’un processus passif lié au ralentissement du flux péritonéal, de la biologie des cellules cancéreuses libres ainsi que de celles des tissus dans lesquels ces métastases s’implantent [104].
Le premier mécanisme d’implantation est nommé trans-mésothelial. Au cours de ce processus, les cellules s’attachent directement au mésothélium péritonéal par le biais de molécules d’adhésion (CD44, Intégrines, etc.) [105], puis elles pénètrent la barrière mésothéliale ce qui leur permet d’adhérer au tissu conjonctif sub-mésothélial via les intégrines. Suite à l’invasion de l’espace sub-péritonéal à proximité de capillaires sanguins, la prolifération va se faire via la production de facteur de croissance par les cellules cancéreuses (autocrine) ou par les cellules conjonctives (paracrine) [106].
L’autre route d’implantation est qualifiée de trans-lymphatique. Les cellules cancéreuses libres vont accéder à l’espace lymphatique sub-péritonéal au travers d’ouvertures, ou stomates, faites par les vaisseaux lymphatiques dans le mésothélium péritonéal (stomates, Figure 14, [107]).

Carcinoses péritonéales d’origine pancréatique

Le cancer pancréatique évolue lui aussi fréquemment en carcinose péritonéale [121]. La médiane de survie pour les patients présentant une carcinose ou d’autres métastases excède rarement 3 mois
Les métastases péritonéales sont observées chez approximativement 40% des patients [129].
L’autre site privilégié des métastases dans ce cancer est le foie dans 50 à 60% des cas [130]. Les métastases péritonéales proviennent de sites cancéreux non détectés en chirurgie ou imagerie, ou de la dissémination de foyers tumoraux pendant la chirurgie [131]. Dans ce dernier cas, l’HIPEC (gemcitabine) en thérapie adjuvante intraopératoire pourrait être bénéfique pour prévenir les rechutes locorégionales [132,133].

Carcinoses péritonéales d’origine ovarienne

Concernant le cancer épithélial ovarien, la totalité des patientes évoluera vers une carcinose péritonéale et il est communément admis qu’une CRS complète est le paramètre le plus important pour prolonger leur durée de vie. Les carcinoses péritonéales ovariennes seront développées de manière plus détaillée dans le paragraphe suivant puisqu’il s’agit du modèle d’étude choisi dans ce projet.

Evaluations cliniques d’algorithmes prédictifs et de biomarqueurs

Une réponse aux traitements est souvent associée à une diminution de moitié du taux de CA125 sanguin, alors que lorsqu’il est doublé cela indique une résistance aux traitements et une progression de la maladie. L’élévation permanente du CA125 après les traitements de première intention est un indicateur spécifique de rechutes qui prédit la persistance de tumeurs résiduelles [319]. Cependant, malgré un retour à la normale du dosage pendant les traitements, des tumeurs sont retrouvées dans la moitié des chirurgies de seconde intention. Ainsi le CA125 n’est pas assez sensible pour l’évaluation d’une réponse complète aux thérapies de première intention [264].
Pour distinguer une maladie bégnine d’un cancer ovarien, le HE4 a démontré la plus forte sensibilité, 72.9% (et 95% de spécificité), comparé au CA125 entre autres. Cependant, la meilleure sensibilité en diagnostic est la combinaison du CA125 et de l’HE4 (76.4%), ce qui suggère que l’utilisation combinée de ces deux marqueurs est plus fiable que leur dosage individuel [320]. Dans une autre étude, le panel de 4 biomarqueurs (CA125, HE4, MMP-7 et mésothéline) a été évalué pour la surveillance des patientes après CRS et chimiothérapie. Il en ressort que HE4 peut prédire l’apparition de rechutes plus tôt que le CA125, et il permet aussi l’évaluation des patientes n’exprimant pas le CA125. En revanche, le MMP-7 et la mésothéline ont un faible potentiel comme compléments du CA125 pour la surveillance des rechutes [321].
Il existe également plusieurs algorithmes prédictifs de la malignité d’une masse pelvienne qui ont été établis en combinant l’âge, le statut ménopausique, l’imagerie et les dosages sanguins de biomarqueurs. Dans les années 1990, le Risk of Malignancy Index (RMI) a été développé. Il prend en compte trois caractéristiques préopératoires : un score déterminé après imagerie par ultrason, le statut ménopausique et le dosage du CA125. En plaçant le seuil du RMI à 200, sa sensibilité est de 85% pour 97% de spécificité [287].
Suite à une étude mentionnée précédemment combinant le CA125 et l’HE4 [320], le même groupe a développé un autre algorithme, le Risk Of Malignancy Algorithm (ROMA) en intégrant les taux de CA125 et HE4 avec le statut ménopausique, sans considérer les données d’imagerie [322]. Plusieurs études ont démontré une sensibilité de 93% pour 75% de spécificité. Cet algorithme semble plus sensible chez les femmes ménopausées [323].
Un autre algorithme, appelé OVA1, a été approuvé par la FDA en 2009 pour discriminer les masses pelviennes malignes et bénignes. OVA1 combine les données d’imagerie, le statut ménopausique et le dosage du CA125 avec 4 autres biomarqueurs [324]. Dans cette étude, il est démontré qu’OVA1 augmente la sensibilité mais diminue la spécificité.
Compte tenu des études cliniques effectuées avec ces algorithmes, OVA1 et ROMA ne devraient pas être utilisés en diagnostic du cancer ovarien ou pour retarder une chirurgie de première intention. Leur utilisation doit être limitée à une aide pour la décision de référer ou non une patiente à un oncologiste gynécologue spécialisé lorsque la probabilité de malignité d’une masse pelvienne est importante [264].
Au bilan, différents marqueurs, principalement de nature protéique mais aussi de nature glycosidique, ont été identifiés dans le cancer ovarien. Cependant, à l’heure actuelle, aucun test diagnostic non invasif (non chirurgical) ou de dépistage à des stades précoces n’est disponible. Pour cause, le manque de sensibilité et de spécificité des tests ELISA pour détecter le marqueur universel de l’EOC, le CA125, puisque celui-ci est le même à la surface d’une cellule cancéreuse et d’une cellule saine. Par ailleurs, il n’y a que très peu de travaux développant des sondes pour la détection spécifique du marqueur glycosidique des carcinomes, l’antigène TF [325–329].
Pour valider un test diagnostique, la spécificité (reconnaître un seul partenaire) et la sensibilité (seuil de détection) de l’objet utilisé pour la détection (sonde) sont donc évaluées. La spécificité représente la probabilité que le test identifie correctement les personnes n’étant pas atteintes par la pathologie. La sensibilité indique la probabilité que toutes les personnes atteintes par la pathologie soient identifiées par le test diagnostique (Figure 25, [330]).

Fonctionnalisations des nanovecteurs

L’efficacité de délivrance d’un principe actif va dépendre non seulement de la capacité d’encapsulation du nanovecteur mais également de son ciblage des cellules cancéreuses, de sa vitesse de relargage de la molécule après endocytose et de ses propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Lorsque des nanocontainers présentent les propriétés nécessaires à une délivrance efficace, ils vont permettre une meilleure pénétration des principes actifs dans les tissus ciblés. Ainsi, il est possible de réduire les doses administrées, ce qui diminue par conséquent la toxicité au niveau des tissus sains environnants [343].
La fonctionnalisation des nanovecteurs va permettre d’assurer un ciblage des cellules cancéreuses lorsque la nanoparticule transportant le principe actif ne possède pas d’affinité intrinsèque pour un biomarqueur par exemple. Ces fonctionnalisations vont être de nature génétique ou chimique.

Fonctionnalisations génétiques

La résolution de la structure d’un nanovecteur protéique va permettre d’envisager sa production comme protéine recombinante et donc d’ajouter la séquence d’un peptide ou d’une protéine entière en N ou C terminal de la nanocage pour obtenir une protéine de fusion. Cette fonctionnalisation est généralement utilisée pour ajouter un système de reconnaissance à la surface d’une nanocage à ciblage passif. Cela a pour conséquence l’augmentation de la distribution de la molécule transportée au niveau du tissu cible, puis, après reconnaissance à la membrane, l’incorporation du nanovecteur dans les cellules tumorales et le relargage de la molécule thérapeutique [343].
Par exemple, la conjugaison de la séquence du peptide RGD à la surface d’une capside virale a permis l’adressage in vivo au tissu tumoral d’un siRNA confiné. En effet, le peptide RGD a une affinité pour les récepteurs aux intégrines surexprimés à la surface des cellules endothéliales tapissant les vaisseaux tumoraux et à la surface des cellules tumorales [379].

Fonctionnalisations chimiques

Comme vu précédemment avec le chargement de molécules par liaisons covalentes, les fonctionnalisations chimiques vont permettre l’introduction de groupements fonctionnels pour le chargement de molécules dans les nanocages, ainsi que l’accrochage de systèmes d’adressage sur les nanocages. Un groupe a greffé 180 acides foliques à la capside virale du Cucumber mosaic virus pour la délivrance ciblée de doxorubicine dans un modèle murin de cancer ovarien. Les acides foliques vont permettre l’adressage de la nanoparticule chargée en doxorubicine puisqu’ils vont se lier spécifiquement à leurs récepteurs surexprimés sur la plupart des cellules tumorales ovariennes [380]. Cette construction a permis de diminuer la cardiotoxicité de la doxorubicine et d’augmenter l’effet cytotoxique de la molécule comparé à la doxorubicine libre. Il est important de mentionner que dans cette étude en plus du potentiel d’adressage et de confinement du nanovecteur, l’administration de cette construction a été réalisée par voie intrapéritonéale. En effet, même seules, certaines molécules thérapeutiques, comme la doxorubicine, sont bien plus efficaces pour certaines applications quand elles sont administrées par une autre voie que la voie systémique classique. Ainsi, lors du développement de ce type de nanovecteur, en plus des nombreuses considérations à prendre en compte quant au choix du vecteur, de la molécule à véhiculer et des fonctionnalisations à effectuer, il ne faut pas se restreindre à des administrations systémiques in vivo. La voie sous-cutanée va par exemple être privilégiée pour l’injection de nanocages protéiques qui vont s’accumuler dans les ganglions lymphatiques par ciblage passif et interagir avec un grand nombre de cellules immunitaires. La nature potentiellement immunogène des nanocages protéiques est souvent discutée, pourtant elles sont particulièrement bien équipées pour la délivrance de molécules immunomodulatrices justement parce qu’elles vont interagir avec le système immunitaire [343].

Table des matières

Partie I : La lectine de Xerocomellus Chrysenteron : Un Nano-objet multifonctionnel
1. Découverte et Histoire des lectines
2. Les lectines : des outils biotechnologiques polyvalents
3. La lectine de Xerocomellus Chrysenteron
Partie II : Carcinoses péritonéales, Cancer épithélial ovarien, problématiques cliniques et marqueurs associés
1. Les carcinoses péritonéales
2. Le cancer épithélial ovarien
3. Le microenvironnement tumoral ovarien
4. Les biomarqueurs protéiques
5. Les biomarqueurs glycosidiques
6. Evaluations cliniques d’algorithmes prédictifs et de biomarqueurs
Partie III : Nanovectorisation, sondes diagnostiques et assistance chirurgicale
1. Nanovectorisation et délivrance ciblée de molécules thérapeutiques
2. Sondes diagnostiques et assistance chirurgicale intraopératoire
3. Administration et élimination des nanoparticules
4. La nanothéranostique
Partie IV : Projet de thèse
Résultats et Discussion
Partie I : Développement d’un test de viabilité cellulaire et d’un modèle murin de carcinose péritonéale ovarienne
1. Mise au point d’un test de viabilité basé sur la bioluminescence
2. Mise au point d’un modèle de carcinose péritonéale ovarienne
Partie II : Caractérisation biochimique de la protéine XCL, création de mutants et preuve de concept du confinement et de la délivrance ciblée de molécules thérapeutiques in vitro
1. Résumé de l’article, Nanoscale 2019
2. A protein nanocontainer targeting epithelial cancers: Rational engineering, biochemical characterization, drug loading and cell delivery
3. Docking et Dynamique Moléculaire de 72 molécules thérapeutiques
4. Délivrance ciblée de molécules thérapeutiques par le nanocontainer dans un modèle cellulaire du cancer épithélial ovarien
5. Bilan des résultats (partie II)
Partie III : Développement du mutant A38C de la protéine XCL comme nanosonde pour la détection de nodules submillimétriques in vivo et le repérage du marqueur associé sur des coupes histologiques
1. Résumé de l’article, Biomaterials 2020
2. Development of a near infrared protein nanoprobe targeting Thomsen-Friedenreich antigen for intraoperative detection of submillimeter nodules in an ovarian peritoneal carcinomatosis mouse model
3. Extension des applications de la nanosonde A38C-alexa647
4. Détection de l’antigène TF sur des coupes histologiques d’exérèses de chirurgies
5. Bilan des résultats (partie III)
Partie IV : Prévenir l’apparition des rechutes en exploitant la propriété anti-adhésive du nanocontainer
1. Mise en évidence de la propriété anti-adhésive de la lectine dans le modèle murin de carcinose péritonéale ovarienne (IGROV-1)
2. Influence des endotoxines
3. Détermination de la dose d’A38C nécessaire pour prévenir l’implantation de cellules tumorales in vivo
4. Bilan des résultats (partie IV)
Conclusions générales
Perspectives
Matériels et Méthodes
Protéines recombinantes
1. Production et purification
2. Marquage des protéines dans le proche infrarouge
Culture cellulaire : lignées, produits et réactifs
Chargement de molécules dans le nanocontainer A38C
Délivrance cellulaire et expériences de dose-réponse
Immunofluorescence
Cinétique d’entrée du nanocontainer dans les cellules par imagerie de fluorescence
Expériences d’endocytose et de dose/réponse
Quantification de l’endocytose et évaluation des modifications du cycle cellulaire en cytométrie en flux (FACS)
Evaluation de la viabilité cellulaire en bioluminescence
1. Vérification de l’influence des composés à tester sur la réaction enzymatique conduisant à l’émission de bioluminescence
2. AY-27 Luc
3. SKOV-3 Luc
1. Modèle IGROV-1 Luc GFP
2. Modèle SKOV-3 Luc GFP
3. Essai avec les cellules A-549 Luc GFP
Imagerie macroscopique de fluorescence sur les tissus tumoraux ex vivo
Evaluation de l’index péritonéal
1. Détermination de la surface des nodules implantés
2. Calcul de l’index péritonéal
Evaluation des ratios signal sur bruit de fond (SNR)
Microscopie confocale et traitements des images de coupes histologiques
Coloration Hématoxyline et Eosine (H&E) et imagerie
Microscopie multiphotonique
Immunohistofluorescence sur tissus tumoraux
Imagerie confocale : acquisitions et traitement des images
Marquage de coupes histologiques d’exérèse de chirurgie avec A38C-alexa6
Dissociation de nodules tumoraux et cytométrie en flux
Analyses statistiques
Bibliographie

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