Développement d’un support d’extraction sélective à base d’aptamères

La cocaïne

1. Origine, structure et mode d’action La cocaïne est un alcaloïde extrait de l’Erythroxylum Coca, plante couramment appelée coca et répandue au Pérou et en Bolivie. Psychotrope classé comme stupéfiant, la cocaïne est une drogue puissante qui stimule le système nerveux central. Plusieurs preuves archéologiques, dont la découverte de restes de feuilles de coca dans des tombes datant du VIIème siècle au Pérou et en Bolivie, montrent que la cocaïne était consommée par les peuples amérindiens. Les feuilles de coca étaient mâchées probablement pour augmenter les performances physiques ainsi que pour lutter contre la faim et la fatigue. Des produits à base d’extraits de feuilles de coca ont fait leur apparition à la fin du XIXème siècle pour des utilisations très diverses : anesthésiant local, produit dopant, traitement de la dépression ou même de certaines addictions. L’usage récréatif se développe et les cas de cocaïnisme se multiplient, une réglementation de l’usage et de la distribution de la cocaïne a donc été mise en place pour la première fois aux États Unis en 1914. La cocaïne, dont la structure chimique est présentée en Figure 1A, possède une fonction amine ionisable dont le pKa est 8,6 [1], et le logarithme de son coefficient de partage octanol/eau est de 2,43 [2]. Elle peut se présenter sous deux formes différentes (Figure 1 B et C) :
– le chlorhydrate de cocaïne : une poudre blanche hydrosoluble qui peut être insufflée (« sniffée »), fumée, ou injectée par voie intraveineuse après avoir été dissoute dans l’eau,
– le crack : cocaïne sous sa forme basique (freebase) qui est généralement fumée.
La durée des effets, liée à l’évolution de la concentration de cocaïne dans le sang, diffère quelque peu en fonction de la forme sous laquelle elle a été consommée. Lorsqu’elle est insufflée, la cocaïne produit son effet après 3 minutes environ, tandis que ce dernier se manifeste en quelques secondes lorsqu’elle est fumée ou injectée. Dans le cas où la cocaïne est insufflée, la phase d’euphorie dure en moyenne 30 minutes, contre 5 à 10 minutes si elle est fumée et moins encore si elle est injectée. Elle agit sur le système nerveux central en bloquant la recapture de dopamine dans l’espace synaptique comme l’illustre la figure 2. Ce neurotransmetteur, libéré pendant la transmission de l’influx nerveux, est normalement réabsorbé par le neurone émetteur via des protéines de transport. La cocaïne se fixant sur ces protéines de transport, elle entraîne l’accumulation de dopamine dans l’espace synaptique, ce qui a pour effet d’amplifier et de prolonger la transmission du signal nerveux provoquant un effet stimulant. La prise de cocaïne engendre une augmentation du rythme cardiaque, de la pression artérielle, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire. Les pupilles se dilatent et les sensations de faim et de sommeil disparaissent. Une consommation de fortes doses, un état de santé fragile, ou un mélange avec d’autres substances aggravantes peuvent causer la mort. En plus de sa toxicité intrinsèque, une interaction avec un produit de coupe peut en accroître les dangers. En effet, la cocaïne est la plupart du temps diluée (ou « coupée ») avec d’autres produits stimulants ou anesthésiants moins couteux (comme la lidocaïne, la procaïne, la benzocaïne, la caféine ou l’éphédrine) ayant des effets proches de ceux provoqués par la cocaïne pour tromper les consommateurs. Le coupage avec des sucres (lactose, saccharose, mannitol…) est également fréquent afin de conserver le même aspect à moindre coût.
2. Le métabolisme de la cocaïne La cocaïne se transforme très rapidement dans l’organisme, sa demi-vie dans le sang est évaluée entre 31 et 80 minutes [4].  La benzoylecgonine (BZE) en est son métabolite principal. Elle résulte de la cassure de la liaison methyl-ester à la fois par voie non enzymatique pour 20 % de la benzoylecgonine formée, via un mécanisme d’hydrolyse basique, et par voie enzymatique catalysée par des estérases pour les 80 % restants [4]. Bien que ce métabolite soit inactif d’un point de vue pharmacologique, il est d’un grand intérêt médico-légal et analytique de par sa longue demi-vie évaluée entre 2,6 et 5,1 heures dans le plasma et 7,5 heures dans les urines [6]. Le second métabolite majeur de la cocaïne est l’ecgonine methyl ester (EME), produit par hydrolyse enzymatique de l’ester de benzyle. Il est établi qu’environ 45% de la cocaïne consommée est métabolisée en benzoylecgonine et 40% en ecgonine methyl ester [5]. Ces deux métabolites sont ensuite hydrolysés en ecgonine. La norcocaïne est formée par Ndémethylation de la cocaïne. Elle est le premier métabolite ayant une activité pharmacologique. La norbenzoylecgonine est obtenue par le même mécanisme à partir de la benzoylecgonine, mais aussi par hydrolyse de la norcocaïne. D’autres métabolites sont très intéressants d’un point de vue médico-légal, car ils donnent des informations sur la façon selon laquelle la cocaïne a été consommée. Quand de l’alcool a été ingéré simultanément à la prise de cocaïne, le cocaéthylène (composé toxique résultant de la transestérification de la cocaïne en présence d’éthanol) est retrouvé. L’anhydroecgonine methylester et son produit de dégradation l’anhydroecgonine sont quant à eux des produits de pyrolyse de la cocaïne, synonyme de consommation de cocaïne fumée sous forme de crack [7].
3. Les matrices biologiques d’intérêt L’analyse de la cocaïne et de ses métabolites dans les matrices biologiques est très complexe du fait de leur courte demi-vie. Leur recherche dans le sang, le plasma ou le sérum est très répandue. La durée de détection de la cocaïne y est estimée entre 4 et 6 heures, alors que la benzoylecgonine peut être détectée jusqu’à 48 heures après la prise [8]. Même si le sang n’offre pas la plus longue fenêtre de détection, ce milieu biologique est très intéressant car il permet la meilleure interprétation du degré d’influence de la cocaïne sur le comportement. De plus, le dosage sanguin matérialise de façon indiscutable une consommation récente de stupéfiants. De plus, le sang, contrairement à l’urine, n’est pas adultérable [9]. L’urine reste cependant la matrice dans laquelle la cocaïne est le plus souvent recherchée. Ce milieu biologique présente l’intérêt d’être non invasif, disponible en grande quantité et facile à prélever. La benzoylecgonine y est détectable jusqu’à trois jours après une prise. La cocaïne quant à elle, n’y est présente qu’en très faible quantité, entre 1 et 9 % de la dose consommée [5]. Cependant, l’urine est le type d’échantillon le plus souvent falsifié. En effet, de nombreux moyens peuvent être mis en œuvre pour falsifier les tests de dépistage urinaire [10] : la dilution (rajout d’un liquide à l’urine émise au moment du recueil), la substitution (par le biais d’un réservoir souple dissimulé sur le corps contenant de l’urine exempte de drogue), l’adultération in vitro (ajout d’une substance sur l’urine émise) ou in vivo (absorption avant le prélèvement urinaire d’une substance médicamenteuse). L’analyse des cheveux a pris beaucoup d’importance ces dernières années pour la recherche de stupéfiants. La cocaïne est le composé majoritairement présent, elle représente entre 50 et 80% des cocaïniques retrouvés dans les cheveux [11]. Cette matrice est non invasive, difficilement falsifiable et peut être stockée ou transportée sans précaution particulière de par sa grande stabilité. Elle offre la fenêtre de détection la plus longue grâce à la grande stabilité de la cocaïne et de ses métabolites une fois incorporés dans les cheveux. Il a ainsi été possible d’identifier de la cocaïne dans les cheveux de momies péruviennes, vieilles de plusieurs centaines d’années [12]. En outre, sachant que le cheveu pousse environ d’un centimètre par mois, il est possible d’établir une évolution de la consommation mois après mois. Les interprétations sont cependant délicates sachant que la vitesse de croissance du cheveu n’est pas rigoureusement constante et que des phénomènes de migration à l’intérieur du cheveu sont possibles. De plus, certains traitements cosmétiques peuvent affecter les analyses. Une diminution de 60 à 70 % du contenu en cocaïne et de ses métabolites est observée dans les mèches de cheveux décolorés  par rapport aux cheveux de couleur naturelle de la même personne [12]. Il est également à noter qu’ils ne permettent pas de détecter un usage récent. Une autre matrice alternative non invasive est la salive. Différentes voies d’administration font apparaître rapidement la cocaïne dans la salive. La contamination de la cavité buccale suite à une consommation sous forme fumée ou insufflée est variable mais significative durant les premières heures consécutives à l’administration d’une dose unique ; la concentration salivaire en cocaïne représente 4 à 5 fois la concentration plasmatique [13]. Typiquement, la concentration de cocaïne est supérieure à celle des métabolites durant les deux premières heures, elle décline ensuite rapidement à des concentrations parfois inférieures à celles des métabolites dans les 4 à 6 heures [14]. Cette matrice s’avère donc intéressante pour détecter une consommation récente. La présence de stupéfiants peut également être recherchée dans la sueur. L’échantillon est recueilli la plupart du temps sur un patch porté par l’individu pendant 5 à 10 jours. Les drogues diffusent de manière passive du sang vers les glandes sudoripares. En ce qui concerne la recherche de cocaïniques, la cocaïne est la molécule majoritairement extraite par le patch [15]. La benzoylecgonine est également présente à des concentrations correspondant environ à 10 % de celle de la cocaïne. La fenêtre de détection est intéressante puisqu’elle permet de savoir si de la cocaïne a été consommée pendant le port du patch, soit une semaine en moyenne. D’autres matrices plus marginales sont analysées comme le méconium, premières selles d’un nouveau né, utile pour évaluer le degré d’exposition du fœtus durant la grossesse [16], les ongles pouvant proposer une alternative aux cheveux [17], ou encore, la bile ou le corps vitré [18] pour les analyses post mortem. Concernant les matrices environnementales, les concentrations de cocaïne et de ses métabolites peuvent être mesurées dans les eaux usées et dans les eaux de surfaces afin d’évaluer la consommation collective d’une ville ou d’une région
4. L’analyse chromatographique de la cocaïne Selon un arrêté datant de 2001, les seuils de détections légaux des cocaïniques dans le sang et l’urine sont respectivement de 50 et 300 ng/mL [9]. La chromatographie en phase gazeuse (CPG) était la méthode la plus populaire jusqu’il y a une dizaine d’années environ. Sa grande sensibilité ainsi que la facilité de son couplage avec la spectrométrie de masse ont fait de cette méthode un outil très performant. Elle reste encore très utilisée pour la recherche de cocaïne dans différentes matrices biologiques [7,17,18,22-24]. Bien que les détecteurs par ionisation de flamme (FID) [18] ou azote/phosphore (NPD) [25] puissent être employés, la spectrométrie de masse est de loin le détecteur le plus souvent associé à la CPG [6]. Cependant, la CPG n’est pas directement applicable aux métabolites de la cocaïne de par leur faible volatilité ; une dérivation préalable est nécessaire. La chromatographie en phase liquide (CPL), quant à elle, peut séparer une gamme de polarités plus large de composés sans dérivation. Cette technique a connu un important essor notamment grâce aux progrès de son couplage avec la spectrométrie de masse. L’analyse des cocaïniques par CPL est très majoritairement réalisée par partage à polarité de phases inversée. Une détection par absorbance ultraviolet [26- 35] ou par fluorescence [36,37] est possible pour une majorité des métabolites, excepté pour ceux ayant perdu le chromophore ester de benzyle : l’ecgonine methyl ester, l’ecgonine, l’anhydroecgonine methyl ester et l’anhydroecgonine. Cependant, le couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse en tandem est devenue la méthode de choix pour atteindre les sensibilités permettant la détection de faibles concentrations dans des matrices biologiques complexes [11,38-42]. L’apport en spécificité de cette méthode est aussi devenu essentiel étant donné le degré de certitude demandé dans l’identification et la quantification des composés dans le domaine médico-légal. L’agence mondiale anti-dopage (AMA) a imposé des règles concernant le nombre d’ions d’identification et les limites d’acceptabilité des intensités relatives de ces ions [43]. Au moins trois ions diagnostiques (dont un ion de quantification) doivent être présents avec des rapports signal-sur-bruit supérieurs à 3. Les rapports d’intensité entre ces ions doivent se trouver dans des limites strictes définies par l’AMA. Même si la spécificité de ce détecteur améliore considérablement la fiabilité des résultats, les étapes de traitement de l’échantillon ou de séparation chromatographique ne doivent pas être négligées au risque de provoquer la co-élution de composés possédant le même fragment ou la même transition en spectrométrie de masse [44]. Le développement et la démocratisation de la chromatographie liquide à ultra haute performance (ou UHPLC) ont permis l’emploi de cette technique pour le screening de substances illicites dans des échantillons biologiques [2,45-49]. L’utilisation de fines particules, dont le diamètre est inférieur à 2 microns, permet en effet d’accélérer la séparation sans pour autant nuire aux performances chromatographiques.

L’extraction sur phase solide

    Le développement d’une méthode analytique complète comprend de nombreuses étapes, depuis le prélèvement de l’échantillon jusqu’au traitement des données : la préparation de l’échantillon, la séparation des analytes, leur identification et enfin la quantification. De nombreux développements technologiques ont conduit à la mise à disposition d’instruments sophistiqués essentiellement dédiés à la séparation et la détection, laissant légèrement en retrait le traitement de l’échantillon. Pourtant, cette étape est considérée comme étant la plus longue, la plus fastidieuse et représentant la plus importante source d’erreurs de toute la méthode analytique. Les principaux objectifs de la préparation  de l’échantillon, pour une analyse chromatographique, sont l’élimination d’un maximum de composés interférents ainsi que la concentration des analytes, surtout dans le cas d’analyses de traces. Cette étape peut aussi permettre le transfert des analytes dans un solvant plus adapté à l’analyse, ou même fractionner l’échantillon en plusieurs groupes de composés. L’extraction liquide-liquide (Liquid-Liquid Extraction, LLE), basée sur la distribution d’un soluté entre deux phases liquides en fonction de son affinité pour chacune d’elles, a longtemps été la méthode la plus couramment employée bien que présentant quelques inconvénients. En effet, même si elle est simple et efficace, c’est une technique longue et fastidieuse. Elle nécessite des quantités importantes de solvants organiques toxiques ou inflammables, elle est sujette aux problèmes liés à la formation d’émulsions, elle est peu efficace pour l’extraction de composés organiques polaires et est difficilement automatisable lorsqu’elle est appliquée à des échantillons de grand volume. Les réglementations sur la réduction de l’usage de solvants organiques ainsi que le développement de nouvelles phases stationnaires ont participé à l’émergence de l’extraction sur phase solide (Solid-Phase Extraction, SPE), technique d’extraction la plus répandue aujourd’hui.

Extraction en différé

a. Principe On parle d’extraction en différé lorsque l’étape de SPE est totalement dissociée de l’analyse chromatographique. En effet, l’éluat de l’extraction est recueilli dans un flacon et peut éventuellement être évaporé à des fins de concentration ou de changement de solvant. Après reprise dans une solution appropriée, une fraction de l’éluat est injectée dans le système chromatographique. Le principal avantage de l’approche en différé est sa grande flexibilité. De nombreux paramètres peuvent être modifiés et optimisés : la quantité d’adsorbant, la nature et le volume de la solution d’élution ou le format du dispositif d’extraction. D’autre part, la simplicité de l’équipement requis en fait une méthode peu coûteuse. Des robots permettent l’automatisation de la procédure lorsque le nombre d’échantillons à manipuler est important. Cependant, les étapes manuelles d’évaporation, de reprise et d’injection peuvent constituer des sources de pertes, de pollutions et/ou d’incertitudes.
b. Formats
i. Les cartouches : La cartouche d’extraction en polypropylène avec ou sans réservoir (figure 6) est le format le plus utilisé. L’adsorbant est contenu entre deux frittés et sa granulométrie est généralement comprise entre 40 et 60 µm afin de permettre un écoulement facile des échantillons et des différentes solutions de la procédure d’extraction sans perte de charge trop importante. Les cartouches de 3 et 6 mL, contenant 500 mg de phase, sont les plus populaires. Cependant, l’amélioration de la sensibilité des systèmes analytiques permet de réduire les volumes d’échantillons nécessaires, donc les volumes d’adsorbant. Les cartouches de 1 mL, contenant moins de 100 mg d’adsorbant, sont donc de plus en plus répandues [84].
ii. Les disques : Les disques pour l’extraction sur phase solide sont constitués d’une membrane de PTFE d’environ 0,5 mm d’épaisseur dans laquelle des particules d’adsorbant sont incorporées. Ces particules représentent 90% de la masse du disque. L’importante surface de section permet l’emploi de particules de faible granulométrie (entre 8 et 12 µm) ainsi que l’utilisation de débits plus élevés que pour les cartouches (jusqu’à 200 mL/min). Ce format est particulièrement intéressant pour l’extraction de grands volumes d’échantillon en un temps court. Comme le montre la Figure 7, ils sont utilisés de la même manière qu’un papier filtre lors d’une filtration sous vide. Cependant, pour l’extraction de plus faibles volumes, un format miniaturisé est disponible intégrés dans cartouche de polypropylène. Dans ce cas, le PTFE est souvent remplacé par de la fibre de verre [87].
iii. Les plaques SPE à 96 ou 384 puits : Le format de plaques à 96 puits est apparu pour répondre aux besoins du haut débit d’analyse d’échantillons par un processus automatisé. Sur chacun des 96 puits se trouve une cartouche SPE de 1 ou 2 mL contenant 5 à 100 mg d’adsorbant. Les plaques à 384 puits permettent aujourd’hui de traiter plus d’échantillon par unité de temps, toutefois, des problèmes de contaminations de puits à puits ainsi que d’inhomogénéité de débit peuvent survenir [84].

Les adsorbants apolaires

   Les adsorbants à polarité de phases inversée sont les plus couramment utilisés pour les échantillons aqueux. Les analytes y sont retenus par interactions hydrophobes et élués par percolation d’un solvant organique. La silice greffée nalkyle (C8 ou C18) et les polymères hydrophobes (polystyrène-divinylbenzène principalement) sont les adsorbants les plus utilisés. Ces deux types de supports présentent l’avantage de résister à la pression et d’être utilisés avec des solvants compatibles avec les phases mobiles de la chromatographie liquide de partage à phases inversée, ce qui permet leur utilisation dans un système en ligne. La silice C18 souffre cependant de quelques limitations. En effet, elle ne peut être utilisée qu’entre pH 2 et pH 8 alors que les polymères sont stables sur toute la gamme de pH (0-14). De plus, les polymères hydrophobes possèdent un plus grand pouvoir rétentif pour les composés polaires. Néanmoins, la silice C18 reste de loin l’adsorbant le plus utilisé [93]. Elle permet par exemple l’extraction de la cocaïne du plasma ou de l’urine [26,94], ou encore l’extraction de l’OTA du vin ou de la bière [53,75,95].

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 – Analyse de traces en milieu complexe
I. Présentation des composés étudiés
A. La cocaïne
1. Origine, structure et mode d’action
2. Le métabolisme de la cocaïne
3. Les matrices biologiques d’intérêt
4. L’analyse chromatographique de la cocaïne
B. L’ochratoxine A
1. Origine, structure et mode d’action
2. L’analyse chromatographique de l’ochratoxine A
C. Conclusion
II. L’extraction sur phase solide
A. Principe
B. Méthode conventionnelle d’extraction sur phase solide
C. Paramètres clés de l’extraction sur phase solide
1. Le volume de fin de fixation
2. La capacité
D. Extraction en différé et extraction en ligne
1. Extraction en différé
2. Extraction en ligne
E. Les différents adsorbants utilisés
1. Les adsorbants polaires
2. Les adsorbants apolaires
3. Les échangeurs d’ions
4. Les supports mixtes
5. Limitations des supports conventionnels
6. Les supports biologiques à reconnaissance moléculaire : les immunoadsorbants
7. Supports biomimétiques à reconnaissance moléculaire : les polymères à empreintes moléculaires
F. Conclusion
Chapitre 2 – Les aptamères
I. Structure des aptamères
A. La structure primaire
B. La structure secondaire
1. Les paires de bases
2. Les motifs structuraux
C. La structure tertiaire
D. Fixation d’un aptamère à sa cible
II. L’identification d’aptamères : le procédé SELEX
A. Principe général du procédé
B. Complexité de la bibliothèque d’oligonucléotides
C. Étape de sélection
D. Amplification des oligonucléotides sélectionnés
E. Optimisation de la séquence des aptamères sélectionnés
F. Modifications pré et post-SELEX
G. Automatisation et miniaturisation du procédé
H. Limitations de la procédure SELEX
III. Propriétés et caractéristiques des aptamères
A. La taille
B. L’affinité
C. La spécificité
D. Comparaison avec les anticorps
IV. Applications
A. Les applications thérapeutiques [131]
B. Les applications analytiques
1. Les biocapteurs ou « aptasensors »
2. Les bioessais à base d’aptamères
3. Les aptamères pour le diagnostic
4. Les méthodes séparatives
5. L’extraction sur phase solide
Chapitre 3 – Synthèse et caractérisation d’oligoadsorbants
I. Présentation des aptamères étudiés
A. L’aptamère anti-cocaïne
B. L’aptamère anti-ochratoxine A
II. Supports d’immobilisation utilisés
III. Faisabilité de l’oligoextraction : caractérisation des oligoadsorbants anti-cocaïne synthétisés
A. Immobilisation sur de la sépharose activée thiol
B. Immobilisation sur de la silice activée glutaraldehyde
C. Immobilisation sur de l’agarose activée streptavidine
1. Développement de la procédure d’extraction : choix des conditions d’élution
2. Étude de stabilité
3. Capacité du support
4. Répétabilité de la synthèse
5. Conclusion
D. Immobilisation sur de la sepharose activée bromure de cyanogène
1. Evaluation de la rétention spécifique
2. Etude du volume de fin de fixation et développement de la procédure d’extraction
3. Capacité du support
4. Stabilité du support
5. Répétabilité de la synthèse
IV. Étude de l’influence de la longueur du bras espaceur
A. Influence sur la rétention non spécifique
B. Influence sur la rétention spécifique
C. Influence sur le greffage
1. Mise au point d’une méthode de dosage des aptamères
2. Étude du taux de greffage
D. Influence sur la capacité du support
E. Conclusions
V. Transposition des procédures de synthèse à l’oligoextraction de l’ochratoxine A 
A. Immobilisation sur de l’agarose activée streptavidine
1. Volume de fin de fixation
2. Optimisation du protocole d’extraction
3. Capacité du support
B. Immobilisation sur de la sépharose activée bromure de cyanogène
1. Volume de fin de fixation
2. Protocole d’extraction
3. Capacité du support
C. Comparaison des oligoadsorbants
VI. Influence de la composition du tampon sur la rétention
A. Données sur l’influence des ions divalents sur l’aptamère anti-OTA
B. Étude de l’influence des ions divalents sur l’aptamère anti-cocaïne
C. Commentaires sur les évolutions de la procédure de synthèse
D. Discussion
VII. Conclusion
Chapitre 4 – Application des oligoadsorbants à des échantillons réels
I. Oligoextraction de la cocaïne d’échantillons réels
A. Évaluation de la sélectivité du support
1. Particularités des aptamères constitués d’une jonction de trois tiges-boucles
2. Reconnaissance des métabolites de la cocaïne
3. Conclusions
B. Extraction de la cocaïne de fluides biologiques
1. Oligoextraction de la cocaïne de plasma et comparaison à la SPE conventionnelle
2. Développement de l’étape de précipitation des protéines
3. Oligoextraction de sang total
II. Oligoextraction de l’ochratoxine A du vin
A. Oligoadsorbant à base d’agarose activée streptavidine
B. Oligoextraction de vin sur le support à base de sepharose CNBr
1. Comparaison de l’oligoextraction à l’injection directe de vin
2. Optimisation de la procédure d’extraction
3. Comparaison à un support conventionnel et à un immunoadsorbant
III. Conclusion
Conclusion
Références bibliographiques

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