Développement du système CRISPR/Cas9 

Développement du système CRISPR/Cas9 

CRISPR/Cas9

Le système CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) est un système de défense immunitaire retrouvé dans plusieurs bactéries . Trois types de système CRISPR/Cas9 ont été découverts mais le type II est le plus étudié. Une courte séquence de l’ADN étranger est intégrée dans le chromosome au locus CRISPR . Ensuite, le locus CRISPR transcrit est maturé à l’aide du tracrRNA (trans-activating) qui se couple aux séquences répétées de crRNA (CRISPR RNA) permettant d’activer l’enzyme RNase III. Cette enzyme va couper le locus CRISPR transcrit pour former des petits ARNs.
L’endonucléase forme un complexe avec le crRNA et le trans-activating crRNA pour la conduire à la séquence cible de l’ADN étrangers par complémentarité. Un motif associé au protospacer (PAM) doit suivre immédiatement en 3’ de la séquence cible sur l’ADN étranger pour que le système reconnaisse l’ADN. Ce système est aujourd’hui utilisé pour l’ingénierie du génome en combinant
le crRNA et tracrRNA en un seul ARN guide appelé sgRNA . Il permet de générer une cassure des deux brins sur la séquence cible. Cette cassure, initie la réparation de l’ADN soit en joignant les bouts non-homologues .

Pseudomonas putida

Pseudomonas putida est une bactérie gram négative vivant dans le sol, l’eau, les plantes et les animaux. Elle est très intéressante pour l’agriculture, la biocatalyse et la production de bioplastiques. Elle a l’avantage d’être GRAS et résistante au stress ainsi que d’être accessible à manipuler génétiquement.
Le génome entier de cette souche a été séquencé et il fait 6’181’863 pb. Son chromosome contient le gène phaC1 et le gène phaC2 qui sont deux synthases impliquées dans la synthèse de la PHA. Ces deux gènes sont séparés par le gène phaZ codant pour la PHA dépolymérase .La PHA (acide polyhydroxyalkanoïque) est une chaîne de carbone accumulée par certaine bactérie lorsqu’elles sont sous des conditions de croissance limitées. Ce biopolymère possède de bonnes propriétés thermoplastiques, biodégradabilité, biocompatibilité et d’autres traits qui attirent un intérêt académique et industriel considérable . Mais la régulation du métabolisme de la PHA est complexe et très peu est connu sur la régulation de production de PHA au niveau physiologique et enzymatique .
Les bactéries Pseudomonas convertissent des intermédiaires d’acide gras ou de glucides en différents (R)-3-hydroxyacyl-CoAs à l’aide de la voie β-oxydation et la synthèse d’acide gras de novo. Ces métabolites sont ensuite utilisés par la PHA synthase pour les transformer en PHA composé d’acide gras (R)-3-hydroxy de 6 à 12 atomes de carbone .

Utilisation du système CRISPR/Cas9 chez E. coli

Une publication de 2015 par Yu Jiang et al.  a utilisé le système CRISPR/Cas9 dans E. coli pour réaliser des modifications précise du génome. Le système qu’ils ont développé a permis d’obtenir une efficacité de mutations élevée, c’est pourquoi il va être utilisé pour Pseudomonas.
Le système se base sur deux plasmides, le premier plasmide appelé pTargetF apporte le sgRNA et le deuxième appelé pCas apporte l’enzyme Cas9 .Le plasmide pCas contient les éléments génétiques suivant :
Le système λ-red (recombination-deficient) qui vient du génome du bactériophage λ et contient trois gènes : exo, bet et gam. L’exonucléase Exo coupe les nucléotides à l’extrémité 3’ d’un ADN double brin pour le rendre simple brin qui permet à Bet de se poser sur l’ADN simple brin et de le renaturer. Gam protège les produits intermédiaires de recombinaison contre les nucléases . Ce système est présent sur le plasmide puisqu’il a été montré qu’il augmente l’efficacité du système CRISPR/Cas9 .
Un sgRNA induit par arabinose qui guide l’enzyme Cas9 vers l’origine de réplication du pTargetF pour l’éliminer.
Le réplicon repA101 qui est sensible à la température et qui permet d’éliminer le plasmide après que les modifications du génome ont été obtenues. La température optimale pour que le plasmide se réplique est de 30°C et il faut une température de 37°C minimale pour l’éliminer.
La résistance à la kanamycine permettant de sélectionner les souches avec le plasmide.
Le gène codant pour l’endonucléase Cas9.
Le plasmide pTargetF contient le sgRNA qui guidera la Cas9, la résistance à la spectinomycine et l’origine de réplication pMB1.

Test de l’origine de réplication repA101ts

La résistance à la kanamycine du plasmide pCas fonctionne dans P. putida KT2440 ainsi elle a été transformée avec le plasmide pCas. La souche transformée a été ensuite incubée overnight à 30°C sur une plaque contenant 50 µg/ml de kanamycine. Ceci permettra de savoir si l’origine de réplication repA101ts du plasmide pCas fonctionne dans P. putida. La transformation a été faite aux mêmes conditions que faite durant le test de la méthode. La souche a été aussi transformée avec pBBR RESO comme contrôle positif et sans plasmide comme contrôle négatif.
12 colonies ont été comptées pour le contrôle positif et zéro colonie pour le contrôle négatif ainsi que pour la souche transformée.
Le nombre de colonies pour le contrôle positif est 10x plus bas que le test fait la première fois alors que les cellules compétentes sont les mêmes que utilisées durant le test. La seule différence, c’est que ces cellules compétentes ont été congelées plus longtemps. Le résultat montre aussi que l’origine de réplication du pCas ne fonctionne pas chez P. putida en n’obtenant aucune colonie. Pour être sûre que l’origine de réplication ne fonctionne pas dans cette souche et que ce n’est pas dû au fait que l’efficacité de la transformation est diminuée par la congélation des cellules compétentes, la transformation a été refait avec des cellules compétentes faites le jour même.

Transformation de P. putida KT2440 avec pSEVA551 et pSEVA521

Les plasmides pSEVA551 et pSEVA521 ont été transformés dans P. putida KT2440 afin de vérifier qu’ils fonctionnent dans cette souche. Les cellules électrocompétentes ont été réalisées le même jour que la transformation.
Deux contrôles négatifs ont été réalisés avec une plaque avec kanamycine pour le pSEVA551 et une autre avec tétracycline pour le pSEVA521.
Plus de 300 colonies ont été comptées pour le contrôle positif ainsi que les deux souches transformées. Aucune colonie n’a été observée sur les deux contrôles négatifs.
Le résultat obtenu montre que la transformation a fonctionné en obtenant plus de 300 colonies pour le contrôle positif. Les deux nouveaux plasmides fonctionnent dans P. putida en obtenant plus de 300 colonies. Il montre aussi qu’il n’y a pas eu de contamination en n’obtenant aucune colonie sur les contrôles négatif.

Table des matières

1 Introduction
1.1 CRISPR/Cas9
1.2 Pseudomonas putida
1.3 Utilisation du système CRISPR/Cas9 chez E. coli
1.4 But de ce travail de diplôme
2 Matériel et méthode
2.1 Souches, plasmides et primer utilisés
2.2 Conditions de croissances
2.3 Transformation de P. putida KT2440 par électroporation
2.4 Digestion avec des enzymes de restrictions
2.5 Polymerase chain reaction (PCR)
2.6 Electrophorèse
2.7 Purification sur gel d’agarose
2.8 Ligation
2.9 Transformation de E. coli TOP10 par heat shock
2.10 Extraction de plasmide
2.11 Substitution de nucléotide
3 Résultats 
3.1 Test de la transformation par électroporation de Pseudomonas putida KT2440
3.2 Test de la résistance à la kanamycine et à la spectinomycine dans P. putida KT2440
3.2.1 Digestion des plasmides pCas et pTargetF pour récupérer leur résistance et l’introduire dans
pVLT319
3.2.2 Transformation par électroporation dans P. putida KT2440
3.3 Test de l’origine de réplication repA101ts
3.4 Transformation de P. putida KT2440 avec pSEVA551 et pSEVA521
3.5 Construction du plasmide pTargetP
3.5.1 Digestion du pSEVA521 et pTargetF avec BamHI-HF et HindIII-HF
3.5.2 Transformation du pTargetP dans E. coli TOP10
3.5.3 Vérification du clonage par colonie PCR
3.5.4 Contrôle du plasmide pTargetP
3.5.5 Substitution des 20 nucléotides de pTargetP ciblant la PHA dépolymérase
3.5.6 Séquençage du plasmide pTargetP-∆phaZ
3.6 Construction du deuxième plasmide appelé pCasPd ou pCasPa
3.6.1 Première tentative de construction
3.6.2 Construction du plasmide pCasPd
3.6.3 Construction du plasmide pCasPa
3.6.4 Contrôle des deux nouveaux plasmides pCasPd et pCasPa
3.6.5 Substitution du N20 des deux nouveaux plasmides pCasPd et pCasPa
3.7 Transformation de P. putida KT2440 avec les plasmides construit dans ce travail
3.7.1 Transformation de P. putida KT2440 avec pCasPa et pCasPd
3.7.2 Transformation du P. putida KT2440 avec pTargetP-ΔphaZ
4 Discussion
5 Conclusion

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