Soutenance mémoire
Imagerie TEP de PD-L1 avec des anticorps IgGs radiomarqués
Les immunoglobulines ou anticorps G (IgGs, ~ 150 kDa) sont des protéines constituées de 2 chaines lourdes (H pour « heavy », ~ 50 kDa chacune) et de 2 chaines légères (L pour « light », ~ 25 kDa chacune) identiques, liées entre elles par des ponts disulfures (Schroeder and Cavacini, 2010) (Figure 4). Les chaines lourdes et légères sont divisées en 2 domaines fonctionnellement distincts : le domaine variable (V) qui confère à l’IgG sa spécificité pour l’antigène, et le domaine constant (C) qui permet notamment l’interaction de l’IgG avec divers composants du système immunitaire. Les domaines variables VH et VL constituent les 2 fragments variables (Fv, ~ 25 kDa) de l’IgG, formant ainsi 2 sites de fixation de l’antigène (bivalence). Les 2 fragments Fab (~ 50 kDa) de l’IgG comprennent le fragment variable Fv, et les domaines constants CL et CH1 des chaines légère et lourde. Enfin, le fragment cristallisable (Fc, ~ 50 kDa) est composé des domaines constants CH2-CH3 des 2 chaines lourdes de l’IgG. Les anticorps IgGs sont divisés en 4 classes (IgG1, IgG2, IgG3, et IgG4), différant dans leur structure (par ex. nombre de ponts disulfures) et dans leur interaction avec les autres composants du système immunitaire. Les anticorps IgGs monoclonaux radiomarqués ont été largement utilisés pour l’imagerie immunoTEP de PD-L1. L’intérêt de ces anticorps est leur spécificité, étant capables de reconnaitre leur cible (ici PD-L1) avec une grande précision. La majorité des études TEP précliniques et cliniques ont utilisé les anticorps thérapeutiques anti-PD-L1 atezolizumab ou avelumab. Le choix de ces anticorps est encouragé par le fait qu’ils sont déjà produits selon les « bonnes pratiques de fabrication » (BPF), qui s’appliquent à la fabrication des médicaments à usage humain. Cette assurance de qualité facilite la translation clinique des études d’imagerie réalisées avec les anticorps thérapeutiques radiomarqués. L’atezolizumab, l’avelumab, l’IgG C4 et d’autres anticorps ciblant la protéine PD-L1 humaine (hPD-L1), généralement radiomarqués au 89Zr (t1/2 = 3,3 jours) ou au cuivre-64 (64Cu, t1/2 = 12,7 h), ont permis de détecter l’expression de PD-L1 par TEP dans divers modèles de xénogreffes humaines. Ces modèles ont impliqué l’implantation hétérotopique (le plus souvent sous-cutanée), ou parfois orthotopique, de lignées cancéreuses humaines immortalisées dans des souris immunodéficientes (Tableau 4). Par exemple, l’IgG C4 radiomarqué au 89Zr a été utilisé pour visualiser l’expression de PD-L1 dans des souris immunodéficientes portant des xénogreffes humaines sous-cutanées de CPNPC PD-L1+ (Moroz et al., 2018; Truillet et al., 2018) (Figure 5). Des anticorps anti-hPD-L1 radiomarqués ont également été utilisés pour l’imagerie TEP de PDL1 dans des modèles de xénogreffes dérivées de la tumeur du patient (modèles PDX pour « patient-derived xenograft ») (Truillet et al., 2018; Vento et al., 2019; Wen et al., 2020). Contrairement aux modèles de xénogreffes humaines conventionnels, ces modèles PDX reflètent plus fidèlement les caractéristiques génotypiques et phénotypiques uniques de la tumeur originelle du patient. L’anticorps 89Zr-IgG C4 a par exemple permis de détecter l’expression de PD-L1 dans un modèle PDX de CPNPC. Ce modèle a été établi par implantation sous-cutanée dans des souris immunodéficientes de cellules d’une tumeur de CPNPC, juste après sa résection du patient (Truillet et al., 2018). Les anticorps « cross-species », ciblant à la fois les protéines PD-L1 humaine et murine (par ex. atezolizumab, avelumab, C4), sont particulièrement intéressants car ils ont également pu être employés pour des études immunoTEP dans des souris immunocompétentes portant des tumeurs murines syngéniques (Tableau 4). L’anticorps 89Zr-IgG C4 a ainsi permis de détecter l’expression de PD-L1 dans des souris portant des tumeurs murines sous-cutanées de mélanome (Moroz et al., 2018; Truillet et al., 2018). Des anticorps radiomarqués reconnaissant uniquement la protéine PD-L1 murine (mPD-L1) ont également été utilisés dans divers modèles syngéniques (Tableau 4). Les études d’imagerie TEP dans des souris immunocompétentes ont permis d’évaluer l’impact de l’expression endogène de PD-L1 dans les tissus sains sur la biodistribution de l’anticorps anti-PD-L1 radiomarqué. La toute première étude immunoTEP de PD-L1 clinique a été réalisée avec l’atezolizumab radiomarqué au 89Zr, chez 22 patients souffrant de CPNPC, de cancer de la prostate, et de cancer du sein triple négatif (CSTN) avancés, avant qu’ils ne soient traités avec cet anticorps thérapeutique (Bensch, van der Veen, et al., 2018) (Figure 6). Cette étude a mis en évidence l’hétérogénéité d’expression de PD-L1 au sein d’une même tumeur, et entre les différentes tumeurs d’un même patient. Temps d’acquisition optimal après administration du radioligand, permettant d’obtenir les images TEP de meilleure qualité en termes d’accumulation tumorale et de contraste tumeur/bruit. Abréviations : CETEC, carcinome épidermoïde de la tête et du cou ; CPNPC, cancer du poumon non à petites cellules ; CSTN, cancer du sein triple négatif ; PD-1, « programmed cell death protein 1 » ; PD-L1, « programmed cell death-ligand 1 » ; PDX, « patientderived xenograft » ; sc., sous-cutané ; 64Cu, cuivre 64 ; 89Zr, zirconium-89 ; 124I, iode-124. Les IgGs possèdent une longue demi-vie plasmatique (~ 21 jours), en raison de leur grande taille (> 60 kDa) empêchant leur filtration rénale, et de leur protection du catabolisme cellulaire via la voie de recyclage du FcRn (Figure 7). Cette circulation prolongée laisse le temps aux IgGs anti-PD-L1 radiomarqués de s’accumuler fortement dans les tumeurs PD-L1+ cibles, atteignant des valeurs comprises entre 5-30 % de la dose injectée par gramme de tissu (% ID/g). Cependant, leur longue persistance dans le sang associée à leur diffusion relativement lente dans les tissus impliquent qu’il faut généralement plusieurs jours pour atteindre une accumulation maximale dans la tumeur, et une élimination suffisante dans les autres tissus non cibles. Ainsi, le temps d’acquisition optimal pour obtenir des images TEP avec le meilleur contraste tumeur/bruit se situe généralement 2-7 jours après administration de l’IgG radiomarqué (Tableau 4). En pratique, cela signifie que les patients doivent retourner à l’hôpital plusieurs jours après l’injection du radiopharmaceutique pour pouvoir être imagés, ce qui reste complexe à organiser en routine clinique. Les complexes FcRn-IgG ainsi formés sont ensuite recyclés jusqu’à la surface de la cellule. Exposés au pH physiologique du sang, les complexes se dissocient alors et les IgGs sont finalement relargués dans la circulation sanguine par exocytose. Lorsque les récepteurs FcRn intracellulaires sont saturés, les IgGs non liés au FcRn sont dirigés vers les lysosomes pour être dégradés. Abréviations : FcRn, récepteur Fc néonatal. Compte tenu des limitations intrinsèques associées aux anticorps radiomarqués, diverses stratégies ont été investiguées dans le but de développer des radioligands avec des propriétés cinétiques plus désirables pour l’imagerie TEP de PD-L1. La stratégie d’optimisation la plus explorée a consisté à utiliser de plus petits formats de radioligands anti-PD-L1, comme des fragments d’anticorps ou des petites protéines (Figure 9).
Caractérisation de l’expression de PD-L1 par les lignées cellulaires de CPNPC par cytométrie de flux
Une fois les lignées cellulaires H1975 et A549 sélectionnées, l’expression de PD-L1 à leur surface a été vérifiée par cytométrie de flux (Annexe 1). Les suspensions de cellules individuelles ont été marquées avec un anticorps primaire anti-PD-L1 (clone 29E.2A3) ou avec son contrôle isotype, tous deux conjugués au fluorophore phycoérythrine (PE). Le contrôle isotype est un anticorps de la même espèce et du même isotype que l’anticorps anti-PD-L1, mais ne ciblant pas PD-L1. Ce contrôle permet ainsi de déterminer le bruit fluorescent lié à une fixation nonspécifique de l’anticorps anti-PD-L1 (par ex. liaison aux récepteurs Fcγ à la surface de certaines cellules immunitaires). Le niveau d’autofluorescence naturelle des cellules, provenant de divers composés (par ex. acides aminés aromatiques), a également été évalué en passant des cellules non marquées au cytomètre. Lors de leur passage dans le cytomètre, les cellules ont été frappées individuellement par un faisceau laser. La lumière diffusée par la cellule et le signal fluorescent émis par le fluorophore PE excité ont alors été collectés par une série de filtres, puis détectés par des tubes photomultiplicateurs (PMTs). Les PMTs ont ensuite converti les signaux lumineux en signaux électriques proportionnels. Les paramètres de chacune des impulsions électriques ainsi créées ont été enregistrés : la hauteur H du pic (V), la largeur W du pic (µs), et l’aire A du pic (V.µs). Enfin, ces signaux électriques ont été convertis en données digitales (‘AttuneTM NxT Flow Cytometer Basic Training’, 2018). La première étape dans l’analyse des résultats de cytométrie de flux (étape de « gating ») a consisté à distinguer les cellules tumorales en fonction de leurs propriétés de diffusion vers l’avant (« forward scatter », FSC) et de diffusion latérale (« side scatter », SSC) de la lumière. La diffusion de lumière vers l’avant est proportionnelle à la taille de la cellule, tandis que la diffusion de lumière latérale dépend de sa granularité. Les débris cellulaires présentent des niveaux de diffusion plus faibles par rapport aux cellules entières, et se retrouvent ainsi dans la partie inférieure gauche du graphique FSC-H = f(SSC-H) (Figure 13). Une fois la population de cellules tumorales définie, une seconde étape de gating a été effectuée afin d’exclure les évènements coïncidents. Ces évènements arrivent lorsque plusieurs cellules sont frappées par le laser en un temps trop rapproché (par ex. si elles sont collées ensemble). Il n’est alors pas possible de séparer leurs pics respectifs. Les évènements non coïncidents, représentant bien des cellules individuelles, se retrouvent dans la partie inférieure du graphique SSC-W = f(SSC-H) (Figure 13). Aucune étape de gating supplémentaire n’a été réalisée.
Caractérisation de l’expression de PD-L1 dans les tumeurs de CPNPC par immunohistochimie
En parallèle des expériences de cytométrie de flux, l’expression de PD-L1 au sein des tumeurs H1975 et A549 a également été évaluée par immunohistochimie (IHC) (Annexe 1). Les coupes de tumeur congelées ont été incubées avec un anticorps primaire anti-PD-L1, puis avec un anticorps secondaire ciblant l’anticorps primaire et conjugué à la HRP. L’activité de l’enzyme HRP a été détectée par ajout du substrat 3-3’-diaminobenzidine (DAB), formant un précipité marron à l’emplacement de la protéine cible PD-L1. Une contre-coloration des sections a ensuite été réalisée avec de l’hématoxyline pour colorer les noyaux cellulaires en bleu/violet. Les coupes de tumeur colorées ont été visualisées à l’aide d’un microscope optique à lumière transmise (Figure 19). Pour chaque coupe de tumeur analysée par IHC anti-PD-L1, une double coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a été effectuée sur une coupe adjacente (Figure 19, Annexe 1). Tandis que l’hématoxyline colore les noyaux cellulaires en bleu/violet, l’éosine colore le cytoplasme des cellules et les tissus conjonctifs en nuances de rose plus ou moins vif. La coloration H&E sur les coupes adjacentes a permis de bien visualiser les zones de nécrose, afin de sélectionner uniquement les régions viables sur les coupes IHC anti-PD-L1. Ces zones de nécrose, présentes dans la plupart des sections analysées, peuvent fixer les anticorps primaires et secondaires de manière non spécifique et mener ainsi à de faux signaux positifs. La fixation non-spécifique éventuelle de l’anticorps secondaire a aussi été contrôlée sur une coupe adjacente à la coupe IHC anti-PD-L1, en supprimant seulement l’étape d’incubation avec l’anticorps primaire (Figure 19). Un contrôle positif, consistant à analyser en parallèle une section de tissu dont l’expression de PD-L1 est avérée, n’a en revanche pas pu être réalisé. Dans le cas des analyses IHC anti-PD-L1 effectuées sur des biopsies tumorales de patients, ce contrôle positif peut par exemple être un échantillon prélevé sur les amygdales palatines exprimant PD-L1. L’IHC anti-PD-L1 sur les coupes de tumeur H1975 a révélé une expression de PD-L1, caractérisée par une coloration marron des membranes cellulaires dans certaines zones viables. Cette coloration associée à PD-L1 n’a en revanche pas été observée sur les coupes de tumeurs A549 (Figure 19). Aucune coloration marron n’a non plus été détectée sur les coupes contrôles sans anticorps primaire, montrant que l’anticorps secondaire ne s’est pas fixé de manière non spécifique. L’analyse de l’expression de PD-L1 par IHC sur les coupes de tumeurs congelées a ainsi confirmé les résultats obtenus par cytométrie de flux, avec une expression in vivo de PD-L1 positive pour le modèle H1975 et négative (ou très faible) pour le modèle A549. En parallèle de la mise en place et de la caractérisation des modèles de xénogreffes humaines de CPNPC PD-L1+ (H1975) et PD-L1- (A549), l’autre étape essentielle à la réalisation des études d’imagerie TEP a bien évidemment consisté à produire les radioligands C4 anti-PDL1.
Biodistribution sanguine des radioligands C4
Les 3 radioligands C4 ont montré des cinétiques d’élimination de la circulation sanguine bien distinctes. Le fragment 89Zr-Fab C4 a été éliminé du sang le plus rapidement, avec une activité < 1 % ID/cm3 dès 4 h après injection (Figure 29). Comme attendu, compte tenu de son incapacité à être recyclé par le FcRn, le 89Zr-IgG C4 mutant a aussi été rapidement éliminé du sang en comparaison du 89Zr-IgG C4 WT. En effet, l’accumulation du 89Zr-IgG C4 (H310A/H435Q) dans le VOI cœur était < 1 % ID/cm3 à partir de 48 h post-injection, tandis que celle du 89Zr-IgG C4 était encore de ~ 3 % ID/cm3 à 7 jours post-injection (dernière session d’imagerie) (Figure 29). Sur les images TEP/TDM obtenues à 48 h post-injection, le signal du 89Zr-IgG C4 dans le cœur était ainsi encore clairement visible, tandis que celui du 89Zr-IgG C4 (H310A/H435Q) était indétectable (Figure 29).
Accumulation des radioligands C4 dans le foie
Les 2 anticorps radiomarqués 89Zr-IgG C4 et 89Zr-IgG C4 mutant se sont accumulés dans le foie. L’activité du 89Zr-IgG C4 dans cet organe a progressivement diminué au cours du temps, passant de 12,66 ± 5,23 % ID/cm3 à 1 h post-injection à 5,12 ± 0,36 % ID/cm3 à 7 jours postinjection (Figure 37). Étonnamment, cette réduction progressive du signal radioactif n’a pas été observée avec le 89Zr-IgG C4 mutant. En effet, son activité dans le foie est toujours restée > 10 % ID/cm3 , même au bout de 7 jours après injection (Figure 37). L’accumulation hépatique du 89Zr-IgG C4 mutant sur la durée de l’expérience d’imagerie TEP/TDM longitudinale (du jour 0 au jour 7 post-injection) a ainsi été presque 2 fois plus importante que celle du 89Zr-IgG C4, avec une valeur moyenne d’aire sous la courbe Cfoie (% ID/cm3) = f(t) de AUC0-7 = 112 520 % ID*h/cm3 pour le 89Zr-IgG C4 (H310A/H435Q) contre seulement AUC0-7 = 60 355 % ID*h/cm3 pour le 89Zr-IgG C4. La rétention accrue du 89Zr-IgG C4 mutant dans le foie en comparaison du 89Zr-IgG C4 WT est d’ailleurs bien visible sur les images TEP/TDM (Figure 38). A l’opposé des 2 IgGs C4 radiomarqués, l’accumulation maximale du fragment 89Zr-Fab C4 dans le foie (observée à 1 h post-injection) était < 3 % ID/cm3.
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Table des matières
Introduction générale
I. Etude de la PK et de la biodistribution des radioligands C4 anti-PD-L1 par imagerie TEP dans des modèles précliniques de CPNPC humains
Introduction
1. Imagerie TEP de PD-L1 avec différents formats de radioligands
1.1. Imagerie TEP de PD-L1 avec des anticorps IgGs radiomarqués
1.2. Optimisation de l’imagerie TEP de PD-L1 avec des fragments d’anticorps et des petites protéines radiomarqués
1.3. Optimisation de l’imagerie TEP de PD-L1 par suppression de l’interaction entre les IgGs radiomarqués et le récepteur Fc néonatal
2. Mise en place des modèles précliniques de cancer du poumon non à petites cellules humain
2.1. Sélection des lignées cellulaires humaines de CPNPC par Western Blot
2.1. Caractérisation de l’expression de PD-L1 par les lignées cellulaires de CPNPC par cytométrie de flux
2.2. Production des modèles de xénogreffes humaines de CPNPC
2.3. Caractérisation de l’expression de PD-L1 dans les tumeurs de CPNPC par cytométrie de flux
2.4. Caractérisation de l’expression de PD-L1 dans les tumeurs de CPNPC par immunohistochimie
3. Production et caractérisation des radioligands C4
3.1. Production des ligands C4
3.2. Mesure de l’affinité des ligands C4 pour la protéine PD-L1 humaine par interférométrie bio-couche
3.3. Radiomarquage des ligands C4 au zirconium-89
3.4. Test de liaison des radioligands C4 aux cellules de CPNPC PD-L1+
4. Imagerie TEP/TDM de PD-L1 avec les radioligands C4 dans les modèles précliniques de CPNPC humain
4.1. Présentation des expériences d’imagerie TEP/TDM longitudinale réalisées
4.2. Pharmacocinétique sanguine des radioligands C4 dans le modèle préclinique de CPNPC PD-L1+
4.2.1. Biodistribution sanguine des radioligands C4
4.2.2. Modélisation de la PK plasmatique des radioligands C4
4.3. Accumulation des radioligands C4 dans les xénogreffes humaines de CPNPC PDL1+ 72
4.3.1. Accumulation du 89Zr-IgG C4 dans les xénogreffes H1975
4.3.2. Accumulation du 89Zr-IgG C4 (H310A/H435Q) dans les xénogreffes H1975
4.3.3. Accumulation du 89Zr-Fab C4 dans les xénogreffes H1975
4.3.4. Intérêt translationnel de l’utilisation du 89Zr-IgG C4 mutant et du 89Zr-Fab C4
4.4. Comparaison de l’accumulation des radioligands C4 dans les xénogreffes humaines de CPNPC PD-L1+ et PD-L1-
4.5. Expériences de blocking avec les radioligands C4 dans les modèles précliniques de CPNPC PD-L1+ et PD-L1-
4.6. Accumulation des radioligands C4 dans les tissus sains dans le modèle préclinique de CPNPC PD-L1+
4.6.1. Accumulation des radioligands C4 dans le foie
4.6.2. Accumulation des radioligands C4 dans les reins
4.6.3. Accumulation des radioligands C4 dans la rate
4.6.4. Accumulation des radioligands C4 dans les os
4.6.5. Impact de l’expression endogène de PD-L1 dans les tissus sains sur la biodistribution des radioligands anti-PD-L1
Conclusion
Références
II. Etude dosimétrique des radioligands C4 utilisés pour l’imagerie immunoTEP de PD-L1
Introduction
1. Concepts et définitions de base
1.1. Définitions de la dose absorbée, de la dose équivalente et de la dose efficace
1.2. Effets biologiques des rayonnements ionisants
1.3. Intérêt de la dosimétrie interne en médecine nucléaire
2. Calcul de dose interne
2.1. Equations pour le calcul de dose absorbée
2.2. Détermination de l’activité cumulée dans les organes sources
2.3. Calcul des facteurs S
3. Dosimétrie murine des radioligands C4
3.1. Présentation du calcul de dose avec le logiciel RODES
3.2. Calcul des activités cumulées dans les organes sources
3.3. Calcul des doses absorbées par les organes cibles
4. Dosimétrie humaine des radioligands C4
4.1. Présentation du calcul de dose avec le logiciel IDAC-Dose
4.2. Calcul des temps de résidence dans les organes sources
4.3. Calcul des doses absorbées par les organes cibles
Conclusion
Références
III. Suivi de la dynamique d’expression tumorale de PD-L1 dans des modèles de CPNPC humain
Introduction
1. Régulation dynamique de l’expression tumorale de PD-L1 et suivi des variations d’expression par imagerie TEP
1.1. Régulation de l’expression tumorale de PD-L1 par de nombreux mécanismes
1.2. Régulation de l’expression tumorale de PD-L1 par la voie mTOR
1.3. Régulation de l’expression tumorale de PD-L1 par les protéines BET
1.4. Suivi des variations d’expression tumorale de PD-L1 induites par divers traitements par imagerie TEP
2. Etude de l’effet de différents traitements sur l’expression de PD-L1 dans des lignées cellulaires humaines de CPNPC
2.1. Effet du traitement everolimus sur l’expression de PD-L1 par les cellules humaines de CPNPC
2.2. Effet du traitement JQ1 sur l’expression de PD-L1 par les cellules humaines de CPNPC
Conclusion
Références
Conclusion générale
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