Détermination des concentration minimales inhibitrices (CMI)

Détermination des concentration minimales inhibitrices (CMI)

Les huiles essentielles

Les huiles essentielles (H.E), Les molécules actives impliquées dans les mécanismes de défense des plantes, sont issues du métabolisme secondaire. Elles ne participent pas directement à la croissance des plantes, mais ont évolué pour leur fournir une protection naturelle contre les attaques de microbes ou d’insectes. Une partie de ces métabolites secondaires se concentre dans les sacs oléifères, qui sont des poches sécrétrices d’huiles essentielles (Guinoiseau, 2010).
Pour la 8e édition de la pharmacopée française (1965), les huiles essentielles (=essences=huiles volatiles) sont : « des produits de composition généralement assez complexe renfermant les principes volatils contenus dans les végétaux et plus ou moins modifiés au cours de la préparation » (Bruneton, 1993).Les huiles essentielles extraites des plantes par distillation comptent parmi les plus importants principes actifs des plantes. Elles sont largement employées en parfumerie. Les huiles essentielles contenues telles quelles dans les plantes sont des composés oxygénés, parfois d’origine trapénoïde et possédant un noyau aromatique (Iserin, 2001).

Répartition et localisation des huiles essentielles

Les huiles essentielles n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs qui sont répartis dans un nombre limité de familles. Les huiles essentielles peuvent être stockées dans tous les organes végétaux :
Fleurs bien sur (bergamotier, tubéreuse…) mais aussi feuilles (citronnelle, eucalyptus, laurier…) et, bien que cela soit moins habituel, dans des écorces (cannelier), des bois (bois de rose, santal…), des racines (vétier), des rhizomes (curcuma, gingembre…), des fruits (tout-épices, anis, badiane…), des grains (muscade…). La composition de ces huiles essentielles peut varier selon leur localisation (Bruneton, 1999).
La synthèse et l’accumulation des huiles essentielles sont généralement associes à la présence de structures histologiques spécialisées, souvent localisées sur ou a proximité de la surface de la plante :
– Cellules à huiles essentielles des Lauraceae ou des Zingiberaceae,
– Poiles sécréteurs des Lamiaceae,
-Poches sécrétrices des Myrtaceae ou des Rutaceae,
– Canaux sécréteurs des Apiaceae ou des Asteraceae (Bruneton, 1993).

Biosynthèse des huiles essentielles

Les huiles essentielles produits du métabolisme secondaire des plantes, se compose généralement de :
1. Les métaux volatils synthétisés via le précurseur isopentenyl pyrophosphate (IPP), consistent en des mélanges complexes se composants des mono-sesquiterpènes hydrocarbones et des matériaux oxygénés dérivé d’eux.
2. Phényl propanoides de la voie acide shikimique, et leurs produits de biotransformation (Hatanaka et al., 1987).

Biosynthèse des terpènes

Les terpènes constituent une famille de composés largement répandus dans le règne végétal (figure 01). Leur particularité structurale la plus importante est la présence dans leur squelette d’une unité isoprénique à 5 atomes de carbone (C5H8) reconnue par Wallach en 1953. Cet isqoprène (I) est la base du concept de la « règle isoprénique » énoncée en 1953 par Ruzika. Cette règle considère le diphosphate d’isopentényl(II), désigné sous le nom d’isoprène actif, comme le véritable précurseur de la mollécule terpénique (Mohammedi,
2006).

Biogénèse des monoterpènes

Site de biosynthèse

Les leucoplastes jouent un rôle primordial dans la biosynthèse des monoterpènes, selon un processus intense et bref (Figure 02). Le transport et l’accumulation de ces composés seraient assurés par le réticulum endoplasmique. Des structures d’association de type membranaire se mettent en place entre les leucoplastes et le réticulum endoplasmique. Les cellules sécrétrices vivantes mais inactives peuvent retrouver leur potentialité de synthèse terpénique après une blessure (Lamarti et al., 1994).

Élaboration et sécrétion

L’IPP est l’intermédiaire clé dans la formation des composés terpéniques. La première étape de la formation des diphosphates des prényles est l’isomérisation de l’IPP en diphosphate de diméthylallile (DMAPP). Cette réaction est catalysée par une enzyme hydrosoluble, l’isopentényl diphosphate isomérase (Lamarti et al., 1994 ; Dudariva et al., 2005).
La biosynthèse des terpènoides implique l’addition de l’unité isoprène avec son isomère pour former le géranyl diphosphate (GPP,C 10), condensé avec une autre unité IPP forme le diphosphate de farnesyl (FPP, C15) à l’origine des sesquiterpènes.
Les précurseurs parentaux compte tenu de la modification structurale par l’oxydation, la réduction, l’isomérisation, l’hydratation, la conjugaison et/ou d’autres transformations donnent une variété de terpènoides (Dubey et al., 2003).
Le diphosphate d’isopentényle (IPP), élaboré dans le cytoplasme, pénètre par un mécanisme encore inconnu dans le leucoplaste, où il subit dans le stroma l’isomérisation en diphosphate de diméthylallyle (DMAPP). MVA : acide mévalonique ; PT : prényltransférases (figure 03) (Dagan, 1988).

Composition chimique des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont de très complexes mixtures naturelle qui contient jusqu’à 60 composés à des concentrations différentes. Ils sont caractérisés par deux ou trois composés majoritaires avec des concentrations nettement élevées (20-70℅) par rapport aux autres composés présents en faible quantité. Généralement, les composés majoritaires déterminent les propriétés biologiques des huiles essentielles. Ces composés comprennent deux groupes de biosynthèse (figure 04). Le premier est un composé de terpènes et des terpénoides et le second de constituants aromatiques et aliphatiques (composés organiques à chaine carbonée ouverte) (figure 05) (Bakkali et al., 2008).
Les composés terpéniques et les composés aromatiques, dérivés du phénylpropane. Les composés terpéniques sont formés d’unités isopréniques (en C5) et comprennent les monoterpènes (C10), les sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20) et les tri terpènes (C30). Ces composés ont tous la même origine métabolique. Les composés aromatiques dérivés du phénylpropane ont une biogenèse différente de celle des terpènes.
La composition chimique des HE varie avec le milieu et l’époque de la végétation. Elle peut aussi se modifier au cours de l’extraction et durant la conservation (Chami, 2005).
Feuille de thym : trichomes glandulaires où sont synthétisés les mono et les sesquiterpènes qui sont responsable des arômes.

Méthodes d’extraction des HE

v Hydrodistillation simple :
La plante est mise en contact avec l’eau dans un ballon lors d’une extraction au laboratoire ou dans un alambic industriel. Le tout est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les HE se séparent de l’eau par différence de densité (Benayad, 2008).
v Entraînement à la vapeur d’eau
L’entraînement à la vapeur d’eau est l’une des méthodes officielles pour l’obtention des huiles essentielles. A la différence de l’hydrodistillation, cette technique ne met pas en contact direct l’eau et la matière végétale à traiter. De la vapeur d’eau fournie par une chaudière traverse la matière végétale située au dessus d’une grille. Durant le passage de la vapeur à travers le matériel, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ». Le mélange est ensuite véhiculé vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle. L’absence de contact direct entre l’eau et la matière végétale, puis entre l’eau et les molécules aromatiques évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile (Lucchesi, 2005).
v Extraction par les solvants
L’extraction par les solvants est précédée d’une division de la plante. Le choix du solvant est influencé par des paramètres techniques et économique .les solvants les plus utilisés, sous, réserve de législation restrictives particulières, sont les hydrocarbures aliphatiques : éther de pétrole, hexane mais aussi propane ou butane liquides .on a également recoures aux solvants hologènés et l’éthanol.
Après l’extraction, le solvant est distillé .en fin d’opération, le solvant qui imbibe la masse végétale est récupéré par injection de vapeur d’eau dans celle-ci (Bruneton, 1999).

Pouvoir antimicrobienne des huiles essentielles

Les huiles essentielles ont un spectre d’action biocide très large puisqu’elles inhibent la croissance de moisissures, levures et bactéries (De Billerbeck et al., 2002).Lorsque l’on parle d’activité antimicrobienne, on distingue deux sortes d’effets: une activité létale ou bactéricide et une inhibition de la croissance ou activité bactériostatique. Le plus souvent l’action des huiles essentielles est assimilée à un effet bactériostatique. Cependant, certains de leurs constituants chimiques semblent avoir des propriétés bactéricides. Plusieurs études ont ainsi montré l’apparition de fuites d’ions potassium dans les cellules microbiennes (Escherichia coli et Staphylococcus aureus) en contact avec de l’huile essentielle d’arbre à thé (tea tree). Cette fuite de potassium est la toute première preuve de l’existence de lésions irréversibles au niveau de la membrane de la bactérie. Le thymol, le carvacrol, des composants actifs d’huiles essentielles, rendent perméable la membrane des bactéries, un effet précurseur de leur mort. Les huiles essentielles ont donc bien des propriétés bactéricides (Zhiri, 2006).L’activité biologique d’une huile essentielle est liée à fonctionnels des composés majoritaires (alcools, cétoniques) et à leurs effets synergiques (Zhiri, 2006).

Propriétés et mode d’action des huiles essentielles

D’après Willem (2002), les molécules aromatiques se manifestent à différents niveaux ; en schématisant, on peut dire que les huiles essentielles ont une action directe et indirecte.
Ø Une action directe :
• sur un métabolisme (foie, reins…),
• sur les micro-organismes pathogènes,
• sur une fonction physiologique particulière (thyroïde, pancréas…),
• sur la régulation hormonale (plantes cortisone-like et folliculine-like),
• sur la stimulation des catalyses enzymatiques,
• sur la fonction émonctorielle de certains organes.
Cette action directe s’exerce dans trois domaines spécifiques :
– Pouvoir antiseptique : les huiles essentielles sont antibactériennes, antivirales, antiparasitaires.
– Pouvoir désintoxicant : un organisme malade est un organisme encrassé et affaibli, qui n’a pas pu résister à une agression extérieure. Toutes les thérapeutiques naturelles favorisent la dissolution et l’élimination des déchets du métabolisme qui s’accumulent dans le corps. Cette élimination s’effectue par l’un des grands « émonctoires » – circuits d’élimination – du corps : les poumons, les reins, les intestins, la peau, le carrefour ORL.
– Action sur les différents métabolismes : foie, pancréas, thyroïde, génital…
Ø Une action indirecte : par une approche scientifique du terrain biologique.
Elles agissent en intervenant sur les processus biologiques et par modification du terrain local et général grâce à leur activité énergétique.
Les modes d’action des huiles essentielles et de leurs principaux constituants, décrits jusqu’à présent, semblent tous affecter la paroi ou la membrane cytoplasmique. Cependant, la variabilité chimique des huiles essentielles laisse présager l’existence de molécules pouvant agir par de nouveaux mécanismes cellulaires (Guinoiseau, 2010)
Les huiles essentielles comprennent un grand nombre de composants et il est probable que leur mode d’action implique plusieurs cibles dans la cellule bactérienne. L’hydrophobie des huiles essentielles leur permet de partition dans les lipides de la membrane cellulaire et les mitochondries, les rendant perméable et conduisant à des fuites du contenu des cellules. Les conditions physiques qui améliorent l’action des huiles essentielles sont à faible pH, basse température et faible teneur en oxygène. La synergie a été observée entre le carvacrol et de son précurseur le p-cymène et entre cinnamaldéhyde et l’eugénol. Effets indésirables organoleptiques peuvent être limités par une sélection rigoureuse des huiles essentielles en fonction du type de nourriture (Figure 06) (Burt, 2004).
Les huiles essentielles possèdent plusieurs modes d’action sur les différentes souches de bactéries, mais d’une manière générale leur action se déroule en trois phases :
– attaque de la paroi bactérienne par l’huile essentielle, provoquant une augmentation de la perméabilité puis la perte des constituants cellulaires.
– acidification de l’intérieur de la cellule, bloquant la production de l’énergie cellulaire et la synthèse des composants de structure.
– destruction du matériel génétique, conduisant à la mort de la bactérie (Caillet et Lacroix., 2007).
Figure 06 : Action des huiles essentielles et de leurs constituants sur la cellule bactérienne
(Burt, 2004)

Toxicité des huiles essentielles

Les études scientifiques montrent que les huiles essentielles peuvent présenter une certaine toxicité. Il faut cependant remarquer que celle-ci varie selon la voie d’exposition et la dose prise.
Les huiles essentielles semblent n’être toxiques par ingestion que si celle-ci est faite en de grandes quantités et en dehors du cadre classique d’utilisation. Les huiles ne seront toxiques par contact que si des concentrations importantes sont appliquées (Degryse et al., 2008).Selon Englebin (2011), les huiles essentielles sont des substances très puissantes et très actives, c’est la puissance concentrée de la plante aromatique, il ne faux donc jamais exagérer les doses, quelque soit la voie d’absorption, car toute substance est potentiellement toxique à dose élevée ou répétée. Paracelse à dit : « Rien n’est poison, tout est poison, tout dépend de la dose » Il faut également savoir qu’une période trop prolongée provoque l’inversion des effets et/ou l’apparition d’effets secondaires indésirables.

Applications des huiles essentielles

Les huiles essentielles des plantes ont trouvé leur place en aromathérapie, en pharmacie, en parfumerie, en cosmétique et dans la conservation des aliments. Leur utilisation est liée à leurs larges spectres d’activités biologiques reconnues (Amarti et al., 2010). Leurs champs d’application s’articulent sur trois secteurs (Tableau 02) à savoir :
Ø En industrie agro-alimentaire
Les études faites à travers le monde, montrent que les huiles essentielles peuvent être ajoutées à peu près à tous les aliments. Ainsi, les huiles essentielles d’origan, de thym, de cannelle ou de coriandre sont efficaces pour les viandes, les volailles, les charcuteries et les légumes; l’huile essentielle de menthe pour les produits frais (salades, yaourts…); les huiles essentielles à base de cavarcrol ou de citral pour les poissons; les huiles essentielles de thym, de noix de muscade ou de gingembre pour les céréales (plus particulièrement celles riches en carvacrol pour le riz); et les huiles essentielles à base de carvacrol ou de cinnamaldéhyde,pour les fruits. Toutefois, quelques limites existent à l’utilisation des huiles essentielles comme agents de conservation dans les aliments, notamment le pouvoir aromatisant de certaines d’entre elles. Cependant des techniques de désaromatisation existent et sont de plus en plus efficaces (Caillet et Lacroix., 2007).
Tableau 02 : Exemples de la diversité des applications des huiles essentielles (Grysole, 2005).
D’autre part, les effets organoleptiques indésirables peuvent être limités en sélectionnant soigneusement l’huile essentielle selon le type d’aliment considéré, mais il est important de noter, que dans la plupart des cas, les concentrations d’huiles utilisées sont si faibles, qu’elles ne modifient pas les qualités organoleptiques de l’aliment. Un autre aspect à prendre en compte, c’est de vérifier que l’huile essentielle sélectionnée n’a pas d’effet antimicrobien contre les bactéries utiles, notamment les ferments d’acidification, d’aromatisation et d’affinage, indispensables à la fabrication des produits. Moyennant ces précautions d’usage, l’emploi des huiles essentielles lors de la transformation des aliments peut présenter un triple intérêt: aromatisant, antioxydant et antimicrobien (Caillet et Lacroix., 2007).
Certaines huiles essentielles sont également actives sur des champignons responsables de mycoses et sur des levures (candida). Les substances actives sont en générale faibles et celle qui sont déterminées par une expérimentations in vitro sont directement transposables pour une utilisation par voie externe ou, a fortiori, comme conservateur. Sarriette, cannelle, thym, girofle, lavande, eucalyptus sont au nombre des huiles essentielles les plus antiseptiques. Des composés comme le citral, géraniol, le linalol ou le thymol sont respectivement 5, 2, 7,1, 5 et 20 fois plus antiseptiques que le phénol (Bruneton, 1993).
Ø En parfumerie et cosmétique
L’utilisation des huiles essentielles comme base dans la fabrication de parfums constitue une pratique courante depuis des siècles dans la plupart des civilisations. Toujours d’actualité, cet usage a cours particulièrement en Europe et aux États-Unis. Ces régions ont d’ailleurs développé des industries importantes qui se démarquent par leur haut niveau d’exportations dans ce domaine (Grysole, 2005).
Ø En pharmacie
Dans leur grande majorité, elles sont utilisées en nature, en particulier pour la préparation d’infusions (menthe, mélisse, verveine, fleurs d’orange, etc.) et sous la forme de préparations galéniques simples. Elles sont également utilisées pour l’obtention d’huiles essentielles dont un petit nombre peut avoir un intérêt médicamenteux (en particulier dans le domaine des antiseptiques externes) mais qui, majoritairement, sont surtout destinées à l’aromatisation des formes médicamenteuses destinées à la voie orale. Les huiles essentielles constituent également le support d’une thérapeutique particulière : l’aromathérapie (Bruneton, 1993).

L’aromathérapie

L’aromathérapie, qui signifie littéralement « soin par les odeurs » est le terme que l’on utilise pour désigner la thérapie basée sur l’utilisation des huiles essentielles. Il s’agit donc de la capacité et de l’art de soigner avec les huiles essentielles (Buronzo, 2008).
L’aromathérapie est l’utilisation des huiles essentielles à des fins thérapeutiques. C’est une “biochimio-thérapie” naturelle sophistiquée qui repose sur la relation existant entre les composants chimiques des huiles essentielles et les activités thérapeutiques qui en découlent. Elle recourt à une méthodologie rigoureuse qui s’inspire de données scientifiques solides confirmées tant par la clinique que par le laboratoire. C’est une thérapeutique naturelle de qualité supérieure (Baudoux, 2008).

Contrôle de qualité des huiles essentielles

Selon la Pharmacopée française et européenne, le contrôle des huiles essentielles s’effectue par différents essais, comme la miscibilité à l’éthanol et certaines mesures physiques : indice de réfraction, pouvoir rotatoire et densité relative. La couleur et l’odeur sont aussi des paramètres importants. La meilleure carte d’identité quantitative et qualitative d’une huile essentielle reste cependant le profil chromatographique en phase gazeuse. Il permet de connaître très exactement la composition chimique et de rechercher d’éventuelles traces de produits indésirables tels des pesticides ou des produits chimiques ajoutés (Pibiri, 2006).
Une huile essentielle pure et naturelle est caractérisée par sa composition strictement « végétale », contrairement aux essences synthétiques ou « identiques naturelles » intégralement reconstituées à partir de composés chimiques de synthèse (Pibiri, 2006).

 Activité antioxydante des huiles essentielles

Les huiles essentielles commencent à avoir beaucoup d’intérêt comme source potentielle de molécules naturelles bioactives. Elles font l’objet d’étude pour leur éventuelle utilisation comme alternative pour la protection des aliments contre l’oxydation (Bouhdid et al., 2006).
Des études ont été menées sur le développement de nouvelles applications et l’exploitation des propriétés naturelles des huiles essentielles dans le domaine alimentaire. Les huiles essentielles et leurs composants sont connus pour posséder des activités anti oxydantes et pourraient donc servir d’agents de conservation alimentaire, ou approuvés comme additifs alimentaires (Caillet et Lacroix, 2007).

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 : Généralité sur les plantes médicinales et les huiles essentielles
1.Les plantes médicinales
1.1.Métabolisme secondaire
1.2.Récolte et conservation des plantes
2.Les huiles essentielles
2.1.Répartition et localisation des huiles essentielles
2.2.Biosynthèse des huiles essentielles
2.2.1.Biosynthèse des terpènes
2.2.2.Biogénèse des monoterpènes
2 .2.2.2.Elaboration et sécrétion
2.3.Composition chimique des huiles essentielles
2 .4.Méthodes d’extraction des H.E
v Hydrodistillationsimple
v Entrainement à la vapeur d’eau
v Extraction par les solvants
2.5.Pouvoir antimicrobienne des huiles essentielles
2.6.Propriétés et mode d’action des huiles essentielles
2.7.Toxicité des huiles essentielles
2.8.Application des huiles essentielles
Ø En industrie agroalimentaire
Ø En parfumerie et cosmétique
Ø En pharmacie
2.9.L’aromathérapie
2.10.Contrôle de qualité des huiles essentielles
2.11.Activité antioxydante des huiles essentielles
Chapitre 2 : La plante étudiée
2.1.Introduction
2.2.Classification botanique de la plante
2.3.Description de la famille
2 .4.Description de la plaante
2.5.Composition chimique de l’huile essentielle d’Ammoides verticillata
2.6.Usage thérapeutique d’Ammoides verticillata
Chapitre 3 : Matériels et méthodes
1.Matériel végétal
1.1.Provenance du matériel végétal
1.2.Parties utilisées
2.Méthodes
2.1.Extraction
2.1.1Procédés d’extraction et conservation de l’huile essentielle
2.1.2.Calcul du rendement en huile essentielle
2.2.Teste de l’activité antibactérienne
2.3.Microorganismes testées et préparation de l’inoculum
2.3 .1.Origine des bactéries
2.3.2.Conservation des souches
2.3.3.Milieu de culture
2.3.4.Préparation des inoculum
2.4.Evaluation de l’activité antibactérienne
2 .4.1.Méthode de diffusion en puits
2.4.2.Détermination de la concentration minimale inhibitrice par la méthode du contact direct en milieu solide
3.Evaluation de l’activité antioxydante
Chapitre 4 : Résultats et discutions
4.1.Propriétés organoleptiques de l’huile essentielle extraite
4.2.Rendement en huile essentielle
4.3.Etude de l’activité antibactérienne
4.3.1.Activité antibactérienne des huiles essentielles vis-à-vis Escherichia coli ATCC 25922
4.3.2. Activité antibactérienne des huiles essentielles vis-à-vis Escherichia coli ECL 3463
4.3.3.Activité antibactérienne des huiles essentielles vis-à-vis Escherichia coli ECL 6611
4.3.4.Activité antibactérienne des huiles essentielles vis-à-vis Staphylococcus aureus ATCC 25923
4.3.5. Activité antibactérienne des huiles essentielles vis-à-vis Staphylococcus aureus ATCC 43300
5 .Détermination des concentration minimales inhibitrices (CMI)
6.Evaluation de l’activité antioxydante
6.1.Activité antioxydante de l’huile essentielle d’Ammoides verticillata
6.2.Activité anttiooxydante de l’extrait aqueux d’Ammoides verticillata
6.3.Activité antioxydante de l’hydrodistillat d’Ammoides verticillata
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques

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