Détermination des acides gras volatils par automatisation en flux avec détection par fluorescence

Typologie de la Matière Organique Dissoute

Typologie selon la composition

La composition de la MOD est difficilement « classable » et très hétérogène du fait de la diversité de ses sources et des différents processus qui l’affectent. On peut néanmoins considérer qu’elle est constituée, de façon générale, d’atomes de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, d’azote, de soufre et de phosphore issus essentiellement des êtres vivants (champignons, racines et de l’activité métabolique des microorganismes) appelée biomasse (Baldock et Nelson, 1999). Parmi la MOD naturelle, on peut distinguer :
la « matière organique fraîche » : débris végétaux, cadavres et résidus animaux et microbiens à différents stades de décomposition, ils constituent la matière organique non vivante. Parmi les principaux composés de la MOD fraîche, on différencie les sucres, en particulier la cellulose -qui est le biopolymère le plus abondant-, les acides aminés, les protéines, les lipides et les lignines (Labanowski, 2004 ; Kögel-Knabner, 2002) .
les composés réfractaires, issus de la décomposition de cette MOD fraîche, connus sous le nom de substances humiques (SH): acides humiques, acides fulviques, humines, etc. (Dignac, 1998 ; McDonald et al., 2004). La transformation de la MOD, naturelle ou anthropique, est réalisée en partie par les organismes vivants et elle varie selon la température, le pH, le taux d’oxygène, la teneur en eau ou encore la teneur en nutriments. En effet, des composés, comme certains sucres ou polypeptides, sont facilement transformés par l’action des microorganismes (Stevenson, 1994). Cette transformation (minéralisation) consiste à dégrader en monomères les polymères tels que les protéines et les sucres, puis en nitrates, nitrites, ammoniac, orthophosphates et dioxyde de carbone. Par contre, d’autres molécules comme la lignine ou les organochlorés, sont à l’inverse plus réfractaires à une transformation naturelle (Kögel-Knabner, 2002 ; Jauzein et al., 1995) et servent de matériaux à l’édification de molécules nouvelles, de plus en plus complexes (processus d’humification), de nature colloïdale et de couleur foncée, dont l’ensemble constitue les substances humiques.

Typologie selon la réactivité

Compte tenu des différentes réactions influençant la formation et l’évolution de la matière organique et suite aux multiples processus de transformation de cette MOD, les éléments constituants la MOD sont très variables. Afin de mieux distinguer ces éléments, plusieurs classements ont été proposés par divers auteurs.
D’après Stevenson (1994), la matière organique est classée en deux pools, l’un actif et l’autre passif. Le premier contiendrait plutôt des débris végétaux et animaux, la biomasse du sol ainsi que les substances non humifiées, et serait une source d’éléments nécessaires et immédiatement utilisables par les plantes.
Le second pool, quant à lui, est composé principalement de substances humiques qui sont chimiquement récalcitrantes, réfractaires à la biodégradation et avec une très bonne stabilité physique, et qui constituent ainsi un stock d’éléments nutritifs, avec une utilité à plus long terme. D’autre part, Senesi et al. (1996) ont proposé une classification de la matière organique en trois pools :
un premier pool «actif» qui contient de la matière organique fraîche ainsi que des biomolécules représentant les produits des processus métaboliques avec des structures chimiques et activités biologiques connues ;
un deuxième pool appelé «intermédiaire», constitué de composés partiellement dégradés, susceptibles de subir des processus de transformation supplémentaires ; un pool «passif», essentiellement composé de substances humiques (SH).

Caractérisation de la Matière Organique Dissoute

La Matière Organique Dissoute (MOD) constitue une matrice particulièrement délicate à étudier mais surtout à identifier. Pourtant, une caractérisation précise est nécessaire pour essayer de comprendre ses origines, les mécanismes de sa genèse ainsi que pour déterminer ses différents rôles environnementaux au sein d’écosystèmes naturels ou artificiels. Plus précisément, une meilleure connaissance de sa structure et de ses fonctions chimiques contribue à améliorer les connaissances des processus de minéralisation, d’humification ainsi que de la biodisponibilité et de la capacité de mobilisation ou d’immobilisation des polluants organiques et des métaux par cette matrice. C’est pourquoi, la caractérisation de la matière organique repose sur l’analyse élémentaire, structurale et fonctionnelle des éléments qui la composent. Pour cela, plusieurs techniques de caractérisation permettant d’identifier les composés simples et les substances humiques ont été développées et peuvent être regroupées en trois catégories : caractérisation physico-chimique, caractérisation fonctionnelle et caractérisation structurelle.

Caractérisation physico-chimique

La caractérisation physico-chimique de la MOD peut être réalisée par l’étude de la taille des molécules, de la charge des molécules, du caractère hydrophile ou hydrophobe des molécules. Cette caractérisation passe par des étapes d’extraction puis de fractionnement de la MOD.
Les extractions des matières organiques conduisent à des solutions contenant des groupes de composés chimiques possédant au moins une propriété en commun, par exemple la taille ou la charge, selon les protocoles chimiques et/ou physiques appliqués. En effet, quel que soit le protocole utilisé, l’extraction conduira logiquement à un fractionnement de la matière organique. Les résultats obtenus vont dépendre de plusieurs facteurs tels que la teneur en métaux du milieu étudié et principalement de la concentration de réactifs utilisés (Calvet, 2003). Les techniques de fractionnement reposent sur différents critères physico-chimiques tels que la taille, la charge, l’hydrophobicité. Le fractionnement constitue donc une première étape de sa caractérisation et ne fournira qu’une description globale de l’intégralité de la MOD.

Caractérisation fonctionnelle

La caractérisation fonctionnelle comprend diverses méthodes (généralement non destructrices) qui permettent d’identifier différents types de structures et de fonctions chimiques et non pas des éléments chimiques ou des molécules constituants de la MOD. Cette caractérisation fonctionnelle est principalement basée sur l’utilisation de techniques spectroscopiques particulièrement intéressantes, puisqu’elles peuvent être appliquées soit directement à l’échantillon brut (sol, eaux, substances humiques ou matière organique dissoute), soit à l’issue d’une procédure de fractionnement, en n’utilisant que de faibles concentrations et/ou volumes d’échantillon.

Caractérisation structurelle

Les techniques de caractérisation structurelle, comme la pyrolyse couplée à la chromatographie en phase gazeuse et à la spectrométrie de masse (pyrolyse-CG-SM) (Dignac, 1998 ; Hatcher et al., 2001 ; Labanowski, 2004), et la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (CPL/SM, CPL/SM/SM) (Reemtsma, 2001) permettent d’étudier la composition structurelle de la MOD pour des composés à haut poids moléculaire (Dignac, 1998). Ces méthodes se caractérisent par leur précision et leur sensibilité, mais aussi par la difficulté de mise en œuvre et leur coût d’analyse élevé. La pyrolyse est une méthode de dégradation thermique non sélective, qui fournit de manière indirecte des informations sur les principales unités structurales des macromolécules, lesquelles seront ensuite isolées et analysées. Cette technique reste pour l’instant la plus utilisée dans l’étude structurelle de la matière organique (McDonald et al., 2004). Elle a été employée dans la caractérisation et le suivi du degré d’humification de sols (Almendros et al., 1996), dans l’étude de la matière organique fossile (Zegouagh et al., 1999) et dans le suivi de l’évolution de la matière organique en cours de compostage (Dignac et al., 2000). Cependant, l’ensemble des analyses moléculaires ne permet pas de caractériser la MOD dans sa totalité. Ainsi, une grande proportion de la MOD reste donc «irrésolue» par ce type d’analyse et cette proportion varie selon l’origine de la MOD, son âge et donc son degré de biodégradation et de transformation (Hedges et al., 2000).

Groupements d’intérêt environnemental

Parmi l’ensemble des groupements fonctionnels qui caractérisent la MOD, notre travail de recherche s’est plus particulièrement focalisé sur 3 fonctions présentant des réactivités élevées dans les écosystèmes, et dont le développement de méthodes analytiques alternatives spécifiques peut revêtir un intérêt pour la recherche mais également pour des applications industrielles.
Amines primaires et acides aminés :Les groupements aminés comprennent plusieurs classes de composés tels que les amines aliphatiques, les hexosamines et les acides aminés, formés naturellement par l’activité métabolique des microorganismes, des plantes et des animaux, dont les principales voies de formation comprennent, pour la formation des amines : la décarboxylation des acides aminés, l’amination des composés carbonylés et la dégradation des composés azotés (Billiet, 1992) ; la formation des acides aminés résulte principalement de l’hydrolyses de protéines. Thiols :Les thiols ont un pKa compris entre 9 et 11 et peuvent être facilement oxydés (par création de ponts disulfures, par exemple) et reconvertis en thiols selon différentes voies enzymatiques (Meister and Anderson, 1983). Ces caractéristiques font des thiols des éléments structuraux des protéines, agissant comme des systèmes de défense contre l’oxydation (antioxydants) (Gilbert, 1984), et des intermédiaires dans la formation de plusieurs composés sulfurés (Flock, 1997) .Les composés organiques comportant un groupement sulfhydryl ou thiols (R-SH), en particulier les composés hydrophiles de faible poids moléculaire (tels que la glutathione, la cystéine, l’acide thioglycolique, l’acide mercaptoéthanesulfonique et l’acide 3- mercaptopropionique), jouent un rôle très important dans différents processus biochimiques et environnementaux.
Acides carboxyliques :La présence des acides carboxyliques aliphatiques dans l’environnement résulte d’une multitude de sources biologiques, de processus géologiques, de réactions (bio)géochimiques et des émissions anthropiques. De nombreux organismes, y compris les bactéries, les champignons et les algues, ainsi que les plantes supérieures et les animaux, excrètent des acides organiques dans leur habitat. En outre, la dégradation et l’humification de la biomasse morte libère des quantités importantes d’acides organiques. Les principales sources d’émissions anthropiques sont les résidus et sous-produits de l’agriculture et la transformation des aliments, les déchets organiques et les divers produits issus de leur traitement et de leur élimination (par exemple boues d’épuration et lixiviats de décharge).

La spectrofluorimétrie UV – visible : Principe

La photoluminescence (fluorescence et phosphorescence) est une caractéristique que possèdent certains composés à émettre de la lumière lorsqu’ils sont soumis à une excitation par des photons. Ce phénomène a permis l’émergence de plusieurs techniques d’analyse sélectives et très sensibles. Parmi les techniques basées sur ces phénomènes photoluminescents figurent la spectrofluorimétrie qui permet de mesurer la fluorescence en solution de molécules et d’ions, et la phosphorescence, plus rarement employée du fait de la complexité de l’instrumentation.
La phosphorescence et la fluorescence sont deux phénomènes distincts. La phosphorescence représente une photoluminescence retardée, correspondant à l’émission lumineuse d’un objet plongé dans l’obscurité après avoir été exposé quelques temps auparavant à de la lumière ; l’émission lumineuse a donc une duré de vie beaucoup plus grande après la phase d’excitation. Par opposition, la fluorescence décroit de manière exponentielle dès que l’excitation cesse.
Les phénomènes photoluminescents, d’un point de vue fondamental, résultent de l’absorption de la lumière UV/VIS par des molécules ou espèces ioniques, générant des états électroniques excités entre les différentes orbitales moléculaires après un apport d’énergie sous forme de photons. Le diagramme de Jablonski(Jablonski, 1933) représente l’absorption et l’émission de la radiation luminescente entre les niveaux d’énergie d’une molécule photoluminescente typique. D’après la distribution de Boltzman, à température ambiante, les électrons se trouvent au niveau vibrationnel le plus bas, celui de l’état électronique fondamental (S0) ; ainsi, quand une molécule absorbe de l’énergie sous forme de photons, elle passe de son niveau électronique fondamental (S0) à un état électronique excité S1. Selon le principe de Franck-Condon, il n’y aura ni changement de la position nucléaire ni modification de l’orientation de spin, du fait que l’absorption du rayonnement se produit à très grande vitesse, de l’ordre de la fentoseconde (10-15 sec). Cette transition électronique ne peut se faire que si l’énergie fournie par le photon correspond à la différence d’énergie entre les deux niveaux S0 et S1.

La dérivation par fluorescence : Principe

Les méthodes par photoluminescence sont de deux types. Les méthodes indirectes qui dépendent de la diminution (ou de la désactivation) de la photoluminescence d’un réactif causée par sa réaction avec l’analyte, et les méthodes directes basées sur la réaction de l’analyte avec un agent chélatant pour former un complexe ou un dérivé photoluminescent.
Les méthodes de dérivation par photoluminescence permettent de transformer des échantillons faiblement ou pas du tout photoluminescents en produits fortement photoluminescents. L’intérêt de former ces dérivés est d’augmenter la sensibilité de détection de l’analyte. En effet, ces techniques présentent généralement des limites de détection qui sont de 10 à 1000 fois plus sensibles que les méthodes basées sur l’absorbance dans le domaine U.V.-visible, et leur domaine de linéarité est beaucoup plus étendu que celui des méthodes absorptiométriques. Un autre avantage des méthodes de luminescence par rapport à l’absorption est la sélectivité, car, les deux longueurs d’onde d’excitation et d’émission peuvent être choisies afin de maximiser la sélectivité. Cependant, du fait de leur grande sensibilité, les méthodes quantitatives de photoluminescence sont souvent sujettes à des interférences liées à la matrice de l’échantillon. C’est pourquoi les mesures de photoluminescence sont souvent combinées à des techniques de séparation par chromatographie ou électrophorèse capillaire.
La dérivation par photoluminescence inclut la fluorescence, la phosphorescence, mais la plupart des applications de dérivation est basée sur la fluorescence, car les phénomènes de phosphorescence sont rarement observés en solution.

Table des matières

Introduction Générale
CHAPITRE I : Etude Bibliographique
I.1. Typologie de la Matière Organique Dissoute
I.1.1. Typologie selon la composition
I.1.2. Typologie selon la réactivité
I.2. Caractérisation de la Matière Organique Dissoute
I.2.1. Caractérisation physico-chimique
I.2.1.1. Techniques de séparation par taille
I.2.1.2. Techniques de séparation par charge
I.2.1.3. Techniques de séparation par hydrophobicité
I.2.2. Caractérisation fonctionnelle
I.2.2.1. Spectroscopie d’absorbance UV/Vis
I.2.2.2. Spectroscopie Infrarouge
I.2.2.3. Spectroscopie de fluorescence
I.2.2.4. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire
I.2.3. Caractérisation structurelle
I.2.4. Caractérisation élémentaire
I.3. Groupements d’intérêt environnemental 
I.3.1. Amines primaires et acides aminés
I.3.2. Thiols
I.3.3. Acides carboxyliques
I.3.4. Méthodes classiques de détection
I.3.4.1. Titration acido-basique
I.3.4.2. Techniques chromatographiques
I.3.5. Méthodes alternatives
CHAPITRE II : Développement Méthodologique
II.1. La spectrofluorimétrie UV – visible : Principe
II.1.1. La fluorescence
II.1.2. La phosphorescence
II.2. Exploitation analytique de la spectrofluorimétrie
II.2.1. Facteurs internes
II.2.2. Facteurs externes
II.3. La dérivation par fluorescence : Principe
II.4. Choix des réactifs pour la dérivation et la détection par fluorescence des groupements fonctionnels
II.4.1. Groupement amine (-NH2)
II.4.2. Groupement thiol (-RSH)
II.4.2.1. Thiols réduits
II.4.2.1.1. Thiols réduits totaux
II.4.2.1.2. Thiols réduits individuels
II.4.2.2. Réduction des thiols oxydés
II.4.2.2.1. Les hydrures
II.4.2.2.2. Les thiols
II.4.2.2.3. Les phosphines
II.4.2.2.4. Les cyanures et les sulfites
II.4.3 Groupement carboxylique (-COOH)
II.5. Méthodes d’optimisation 
II.5.1. Plan de criblage
II.5.2. Plan d’expérience
II.6. Introduction aux techniques d’automatisation 
II.6.1. Technique d’analyse en microplaque
II.6.1.1. Généralités sur la technique en microplaque
II.6.2. Technique d’analyse en flux
II.6.2.1. Généralités sur les techniques en flux
II.7. Matériels et Méthodes
II.7.1. Matériels
II.7.1.1. Matériel pour les expériences en microplaques
II.7.1.1.1. Microplaques
II.7.1.1.2. Instrument de mesure de fluorescence pour microplaques
II.7.1.2. Matériel pour les expériences d’analyse en flux
II.7.1.2.1. Système d’analyse en flux
II.7.1.2.2. Instrument de mesure de fluorescence pour l’analyse en flux
II.7.2. Réactifs
II.7.3. Méthodes et procédures
II.7.3.1. Amines primaires et acides aminés
II.7.3.1.1. Méthode
II.7.3.1.2. Procédure
II.7.3.2. Thiols
II.7.3.2.1. Méthode
II.7.3.2.2. Procédure
II.7.3.2.3. Etape de réduction
II.7.3.2.4. Etape de dérivation
II.7.3.3. Acides carboxyliques à chaine courte
II.7.3.3.1. Méthode
CHAPITRE III : Résultats et Discussions
III.1. Détermination des amines primaires et acides amines par automatisation en microplaque avec détection par fluorescence 
III.1.1 Présentation des paramètres influençant la dérivation et la détection des composés aminés
III.1.2. Etude de sélectivité
III.1.3. Etude des interférences
III.1.4. Caractéristiques opérationnelles de la méthode pour la détection de composés aminés et de l’ammonium
III.1.5. Caractéristiques analytiques
III.I.6. Validation de la méthode
III.I.6.1. Validation de la procédure de dosage des composés aminés
III.1.6.2. Validation de la procédure de dosage de NH4+
III.1.7. Conclusion
III.2. Mise au point d’un kit microplaque pour la détection fluorimétrique des thiols
III.2.1. Présentation des paramètres influençant la dérivation et la détection des thiols
III.2.1.1. Optimisation de l’étape de dérivation
III.2.1.1.1. Plan de criblage
III.2.1.1.2. Plan d’expériences
III.2.1.1.2.1. Effet du pourcentage de méthanol
III.2.1.1.2.2. Effet de la concentration en aminoéthanol
III.2.1.1.3. Désirabilité
III.2.1.2. Optimisation de l’étape de réduction
III.2.2. Détermination des caractéristiques analytiques de la détection fluorimétrique
III.2.2.1. Limite de détection et limite de quantification
III.2.2.2. Etude des interférences
III.2.3. Validation de la méthode
III.2.3.1. Thiols réduits
III.2.3.1.1. Echantillons de sols et composts
III.2.3.1.2. Echantillons de station d’épuration
III.2.3.2. Thiols oxydés
III.2.4. Conclusion
III.3. Détermination des acides gras volatils par automatisation en flux avec détection par
fluorescence
III.3.1. Analyse en microplaque
III.3.2. Analyse en Flux
III.3.2.1. Automate développé
III.3.2.2. Présentation et optimisation des paramètres influençant la dérivation en flux des acides gras volatils
III.3.2.2.1. Optimisation de l’étape d’activation
III.3.2.2.2. Optimisation de l’étape d’amidation
III.3.2.2.3. Optimisation de l’étape d’extraction
III.3.2.2.4. Influence du débit d’extraction
III.3.2.3. Caractéristiques analytiques
III.3.2.3.1. Limites de détection et limites de quantification
III.3.2.3.2. Sélectivité
III.3.2.3.3. Interférences
III.3.2.4. Validation
III.3.2.5. Conclusion
Conclusion Générale
Références Bibliographiques

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