DETERMINATION DE L’EFFICACITE ANTIBACTÉRIENNE

DETERMINATION DE L’EFFICACITE ANTIBACTÉRIENNE

Les matériaux les plus utilisés pour fabriquer des emballages alimentaires sont les plastiques, les verres, les textiles, le fer-blanc, les alliages d’aluminium, les cartons et les papiers. Les deux derniers, soient les cartons et les papiers, issus des fibres biodégradables, renouvelables et largement abondantes, se présentent parmi les moins chers. L’ introduction de nouvelles propriétés ou « fonctionnalités» à ces matériaux, comme, par exemple le caractère antibactérien, permet d’augmenter leurs utilisations dans le domaine alimentaire tout en respectant, le mieux possible, les exigences environnementales. D’autre part, cette augmentation d’utilisation permet aussi de venir au secours de l’industrie des pâtes et papiers qui connaissent actuellement un recul majeur dû à la baisse de l’utilisation des papiers impression-écriture, et surtout du papier journal. En outre, le papier offre un avantage technique par rapport aux autres matériaux. En effet c’est un matériau solide, flexible, et facile à modifier lors des opérations de transformation, notamment l’état de surface par calandrage pour en modifier la porosité, ce qui permet [1] la fixation des agents antibactériens en surface.

LES BACTÉRIOPHAGES

Définition

Les bactériophages, communément appelés phages, sont des virus infectant les bactéries [16]. Les phages sont des commensaux· normaux de l’humain que l’on retrouve fréquemment dans le tractus gastro-intestinal, sur la peau, dans l’urine et dans la bouche. Ce sont les prédateurs naturels des bactéries. Ils identifient les surfaces auxquelles ils se lient grâce à des récepteurs spécifiques puis ils insèrent leur matériel génétique à l’intérieur des bactéries cibles. Comme tous les virus, ils se caractérisent par la possession d’un seul acide nucléique et par un parasitisme intracellulaire obligatoire. Une caractéristique unique des phages consiste dans une croissance « par cascade» après interactions avec les bactéries. En même temps, ils ont la particularité d’avoir une étroite spécificité d’espèce bactérienne ; ils attaquent des bactéries en particulier, à l’opposé des antibiotiques qui ciblent des spectres plus larges. De plus, les phages n’ont pas d’impact sur les tissus humains. Le domaine de la bactériophagie s’étend aux espèces bactériennes les plus diverses: Gram+, Gram-, acido-résistantes, sporulées ou non sporulées, aérobies ou non aérobies, saprophytes ou pathogènes.

Classification

Comme tous les virus, les phages sont classés en fonction de la nature de leur acide nucléique et de leur structure: type de symétrie, présence ou absence d’une enveloppe. Les Caudovirales Les phages classés dans l’ordre des Caudovirales sont les plus nombreux, soit plus de 80 % des bactériophages connus. Ils présentent une symétrie originale qualifiée de binaire. Les virions sont constitués d’une tête à symétrie cubique renfermant l’ADN (acide désoxyribonucléique) et d’une queue à symétrie hélicoïdale. La queue est constituée d’un cylindre central creux communiquant avec la tête et son extrémité distale présente une plaque terminale, pourvue de fibres caudales et de crochets. Le génome est non segmenté et il est constitué d’une molécule d’ADN bicaténaire et linéaire.

Les Myoviridae
Les représentants de la famille des Myoviridae ont une queue longue d’environ 100 nm. Ils possèdent une gaine contractile entourant le cylindre central de la queue; ce qui leur permet d’injecter leur ADN dans la cellule bactérienne. Certains de ces virus sont bien connus. C’est le cas de phages T2 (Enterobacteria phage T2), T4 (Enterobacteria phage T4), T6 (Enterobacteria phage T6) et Mu (Enterobacteria phage Mu).
Les Siphoviridae
Les Siphovirida ont une queue longue d’environ 100 nm et non contractile. Les phages Tl (Enterobacteria phage Tl), T5 (Enterobacteria phage T5) et À (Enterobacteria phage À) sont classés au sein de cette famille.
Les Podoviridae
Les Podoviridae ont une queue courte d’environ 20 nm et non contractile. Les bactériophages T3 (Enterobacteria phage T3), T7 (Enterobacteria phage T7) et P22 (Enterobacteria phage P22) sont quelques exemples de virus classés dans cette famille.

Sources 

Les sources naturelles de phages sont multiples. Ils sont extraits du sol, des eaux de rivières, de la mer, des eaux d’égout, etc. Ils sont présents chez la plupart des végétaux, dans le tube digestif et les déjections des animaux homéothermes (qui ont une température corporelle constante) ou poïkilothermes (qui ne contrôlent pas leur température corporelle) ainsi que chez les insectes. Le facteur essentiel de la dissémination de phages dans la nature est la fréquence des bactéries spontanément Iysogènes. Les phages sont considérés comme étant plus nombreux dans la biosphère que n’importe quel autre groupe d’organismes, les procaryotes inclus. Dans les eaux littorales, on trouve plus de 106 phages par millilitre et on estime à environ 1030 virions la population totale de phages classés dans l’ordre des Caudovirales.

Historique 

Les phages ont été découverts indépendamment par le bactériologiste anglais Frederick Twort [17] en 1915 et par le biologiste canadien Félix d’Hérelle [18] en 1917 qui les baptisa « bactériophages ». Frederick Twort avait remarqué que des colonies de microcoques, un genre de bactéries, prenaient parfois un aspect vitreux, dû à une destruction des cellules bactériennes, et que cette caractéristique était transmissible à des colonies normales par simple contact.

Félix d’Herelle fit une observation similaire en découvrant dans les selles de malades atteints de dysenterie bacillaire, un agent infectieux capable de détruire spécifiquement des cultures de Shigella dysenteriae. La première application de phages pour traiter des maladies infectieuses remonte à 1921 par Bruynogue et Maisin [19] qui les ont utilisés avec succès pour traiter des maladies de peau dues au Staphylococcus sp. Ils ont aussi été utilisés pour traiter la dysenterie, le choléra et la fièvre typhoïde. Dans les années 1930, plusieurs produits à base de phages qui ont été commercialisés aux Etats-Unis ont reçu des rapports positifs sur leur efficacité, particulièrement pour les infections dues aux Staphylococcus sp. et les maladies intestinales. En Géorgie, où les phages sont étudiés depuis 1934, des chercheurs ont rapporté que la thérapie phagique avait un taux de succès de 80% contre les infections d’entérocoques [19]. En Pologne, les médecins ont eu un taux de succès de 90% contre des cas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae et E. coli [20]. Cependant, l’enthousiasme de départ pour les phages a vite été remplacé par un scepticisme critique suite à des rapports négatifs sur l’inactivité de certaines préparations commerciales ainsi que la mort de patients traités [21,22]. Les résultats mitigés de la thérapie phagique, l’usage inapproprié de phages, le manque de connaissances sur la nature de phages, le manque de standards de pureté et les études incontrôlées ont eu pour effet que, avec la découverte des antibiotiques et l’éclatement de la deuxième guerre mondiale, la phagothérapie a été abandonnée dans les pays occidentaux. Toutefois, les phages ont toujours continué à être utilisés comme agents thérapeutiques avec succès en Europe de l’Est et dans l’ex-Union soviétique .

De nos jours, la technologie biomédicale est bien différente de ce qu’elle était aux premiers temps de la recherche sur la thérapie phagique. Nos connaissances sur les propriétés biologiques des phages et les mécanismes régissant l’interaction phage-bactérie se sont grandement améliorées et élargies. Ces avancées peuvent maintenant permettre le développement de préparations de phages thérapeutiques sécuritaires ayant une efficacité optimale envers leurs hôtes bactériens spécifiques afm d’intégrer la thérapie phagique à nos méthodes de prévention et de traitement des infections bactériennes.

Comparaison phages-antibiotiques

L’utilisation de phages, comme agents de lutte contre les bactéries et la formation de biofilm, présente de nombreux avantages par rapport aux antibiotiques . Les phages  sont déjà présents et actifs dans la nature. Ils sont relativement faciles à isoler et leur production est simple, rapide et peu coûteuse. De plus, ils possèdent la capacité d’évoluer en s’adaptant aux bactéries qu’ils infectent, c’ est-à-dire de muter en présence de bactéries résistantes aux phages. Cependant, les mutations qui causent la résistance bactérienne aux antibiotiques sont différentes de celles qui causent la résistance phagique car chaque traitement agit à différents niveaux de la bactérie [32]. Les phages peuvent malgré tout toujours évoluer naturellement en s’ adaptant aux mécanismes de résistance des bactéries.

La haute spécificité des phages envers une espèce et parfois même un genre, évite la destruction non spécifique des bactéries, donc de la flore normale des patients. Ainsi, l’équilibre de l’organisme est maintenu sans risque d’ infections secondaires opportunistes ou de diarrhées qui sont des effets secondaires fréquents avec l’emploi d’antibiotiques à large spectre. Comme ils n’ infectent que les bactéries et non les cellules des organismes pluricellulaires, ils sont de plus sans danger pour l’homme, les animaux ou les plantes.

Un autre avantage intéressant est leur capacité de croissance exponentielle rapide directement au site d’infection en suivant la croissance de l’hôte bactérien jusqu’ à la disparition des bactéries. Il y a donc une persistance à long terme du traitement. Ceci implique qu’une seule dose de phages peut théoriquement traiter une infection, i.e. limitant ainsi l’administration de plusieurs doses pendant la durée du traitement. Les traitements phagiques représentent donc un des rares traitements multiplicatifs, sinon le seul.

Limites d’utilisation de phages contre les bactéries 

Si un spectre d’ hôte très étroit confère aux phages un avantage de taille face aux antibiotiques, il peut aussi être considéré comme un inconvénient. Cette haute spécificité entraîne la nécessité d’ avoir une large banque de phages disponibles bien caractérisés et des méthodes pour déterminer rapidement quel phage serait efficace contre l’ infection. Même si aucun effet secondaire dommageable n’a été rapporté avec l’utilisation de phages, la pureté de la préparation reste un critère primordial voire critique. Les phages étant relâchés à partir des bactéries lysées, les préparations brutes peuvent contenir des lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycan ou autre composant toxique pouvant causer un choc septique. Cependant, les phages peuvent être facilement purifiés par différentes techniques comme la centrifugation haute vitesse ou la chromatographie qui permettent d’ éliminer les impuretés et de rendre les préparations de phages non toxiques. Le tableau 2 représente une comparaison entre les phages et les antibiotiques.

Études bibliographique de la dynamique

Plusieurs études existent sur les interactions entre phages et bactéries. Elles proposent des résultats prometteurs sur la possibilité de l’utilisation de phages dans la lutte contre les bactéries. En général, les phages détruisent les bactéries pour se reproduire. Néanmoins, quelques problèmes se développent au fur et à mesure que le temps d’interaction phagebactérie augmente. Par exemple, les bactéries développent progressivement des résistances contre les phages [37]. Le taux de développement de résistance aux phages est néanmoins dix fois plus faible que celui aux antibiotiques [38]. Une conséquence directe de la résistance bactérienne se traduit par une coexistence phages/bactéries. Cette coexistence de phages et de bactéries est reportée dans la littérature [39,40,41]. Levin et ses collaborateurs [39, 40] ont effectué une étude sur la modélisation d’interaction entre un phage T2 et une bactérie de type E. coli. Ils montrent une coexistence phages-bactéries en fonction du temps telle qu’illustrée à la Figure 8. Une population hétérogène est présente à un certain moment (moins de 100 heures), représentée par la destruction des bactéries par les phages mais une augmentation de la quantité de bactéries parallèlement aux phages est observée par la suite, à des cycles d’environ 30 minutes.

CONCLUSION

Le but de ce mémoire était l’étude de la dynamique de la zone de lyse des phages utilisés seuls et d’un cocktail de phages formé de phages T4 et d’EcomAGIO. Dans une première partie, nous avons montré que les phages appliqués directement sur un tapis bactérien, seuls et en cocktails, sont capables d’ éliminer ou de contrôler les bactéries E.co/i B. Nous avons montré que le temps d’apparition et l’aire de la zone de lyse dépendent d’une manière significative de la concentration de phages utilisés. Pour des concentrations élevées, le temps d’apparition est plus rapide. D’autre part, concernant les aires de la zone de lyse, pour un temps donné, une différence dans le temps d’apparition de la zone de lyse est observée pour les faibles concentrations et des résultats comparables ont été notés pour les grandes concentrations, i.e. les temps d’apparition et l’ aire de la zone sont comparables. Ceci est probablement dû à l’existence d’ un rapport optimal de coexistence entre les phages et les bactéries. Dans le cas des phages T4, l’aire de lyse est plus grande et l’apparition plus rapide que les phages EcomAGIO pour une même concentration de phages. D’autre part, nous avons montré que les cocktails de phages possèdent des propriétés antibactériennes mais donnent des résultats intermédiaires entre les deux phages.

Table des matières

1. INTRODUCTION 
1.1. INTRODUCTION GÉNÉRALE
1.2. PROBLEMATIQUE GENERALE:
1.3. ApPROCHE DE PROJET (SENTINEL): EMBALLAGES ANTIBACTÉRIENS
lA. OBJECTIF DE PROJET DE MAITRISE
2. ETUDE BmIOGRAPHIQUE 
2.1. GÉNÉRALITÉS
2.2. LES BACTERIOPHAGES
2.2.1. Définition
2.2.2. Classification
2.2.3. Sources
2.2.4. Historique
2.2.5. Comparaison phages-antibiotiques
2.2.6. Limites d ‘utilisation de phages contre les bactéries
2.2.7. Les phages de l’étude: T4 et EcomAG10
2.3. DYNAMIQUE DE L’ACTION DE PHAGES
2.3.1. Interaction phages bactéries
2.3.2. Le cas de phages T4
2.3.3. Études bibliographique de la dynamique
2.3.4. Vers des suifaces bioactives
3. MATERIELS ET METHODES 
3.1. CULTURES BACTERIENNES
3.1.1. Préparation de TSB
3.1.2. Préparation de TSA
3.1.3. Préparation de la culture bactérienne
3.1.4. Détermination de la concentration de la culture bactérienne
3.1.5. Formation d’un tapis bactérien (Double couche agar)
3.2. BACTERIOPHAGES
3.2.1. Productions
3.2.2. Dilution de phages
Détermination de la concentration de phages
DETERMINATION DE L’EFFICACITE ANTIBACTÉRIENNE
Ensemencement direct de phages
Adsorption de phages sur papiers
Caractérisation des papiers
4. RESULTATS & DISCUSSIONS 
4 .1. CARACTERISATION DES BACTERIES
4.2. CONCENTRATION DES BACTERIES
4.3 . CONCENTRATION DES PHAGES
4.4. ZONE DE LYSE SANS PAPIER
4.4.1. Efficacité des phages
4.4.2. Dynamique de la zone de lyse: le cas de phages T4
4. 4.1. Dynamique de la zone de lyse: le cas de phages EcornA G 10 ..
4.4.2. Comparison T4 et EcornAG10
4.4.3. Dynamique de la zone de lyse: le cas de cocktail de phages (/’4 et EcornAG10)
4.5. ZONE DE LYSE AVEC PAPIER
4.5.1. Influence de la concentration de phages:
4.5.2. Analyse et discussion
CONCLUSIONS

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