Détermination de la taille moléculaire des bactériocine par SDS-PAGE

Détermination de la taille moléculaire des bactériocine par SDS-PAGE

Résultats et Discussion

Les souches isolées des laits crus appartiennent au genre Enterococcus sauf la souche LO3.1 qui a été identifiée à L. lactis ssp lactis. Cette souche est atypique puis qu’elle a été isolée à partir d’un milieu sélectif pour les entérocoques (bouillon de Rothe). Les résultats de l’identification montrent que le lait cru contient parmi sa flore des souches d’Enterococcus dont deux espèces ont été identifiées à E. durans (2 souches) et E. faecium (4 souches). Le profil biochimique des autres souches ne nous a pas permis de déterminer l’espèce des isolats et ont été identifiées à Enterococcus sp. L’intérêt croissant que connait l’étude de quelques propriétés des souches d’Enterococcus, nous mena à les isoler à partir du lait cru. Nous avons considéré que le lait cru est la meilleure source d’isolement. Les genres de bactéries lactiques les plus communs dans le lait sont Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus et Enterococcus (Quigley et al., 2013). Enterococcus est le troisième grand genre de bactéries lactiques après Lactobacillus et Streptococcus (Franz et al., 2011). Le lait cru est l’exemple de niche écologique contenant une population microbienne complexe et diverse.
Dans la littérature les ferments utilisés pour l’obtention du beurre sont L. lactis ssp lactis, L.lactis ssp cremoris, L. lactis ssp lactis boivar diacetylactis et Leuconostoc mesenteroides. La composition de la flore bactérienne des 2 échantillons de beurre est différente. La majorité des isolats du beurre BRA sont L. lactis ssp lactis. Quant à l’espèce L. lactis ssp cremoris et L. garvieae chacune a été représentée par un isolat. Les isolats du beurre BRC se répartissent à part égale en 4 isolats d’E. faecalis et 4 isolats de L. lactis ssp lactis. Chacune des deux espèces L. lactis ssp cremoris et E. durans a été représentée par un isolat. L’identification phénotypique des isolats révèle que dans le cas des beurres de fabrication traditionnelle la fermentation est spontanée. Par conséquent la composition du microbiote du beurre dépend du microbiote du lait cru mais aussi des micro-organismes de l’environnement de production. L’isolement d’entérocoques à partir du beurre BRC résulte certainement de la présence de ces bactéries dans le lait cru utilisé pour sa fabrication, ou d’une contamination du lait ou du beurre par les outils de la traite ou de transport du lait, ou par les ustensiles de préparation du beurre.
Un aliment de fabrication artisanale de par sa composition bactérienne est complexe. Cependant l’évolution de populations bactérienne est fonction des interactions entre bactéries. La présence des entérocoques qui sont considérées comme indicateur de contamination fécale peut avoir plusieurs origines. De par sa riche composition le lait cru peut contenir une grande variété d’espèces bactériennes et fongiques. Les microorganismes contaminants peuvent provenir d’animaux en lactation, de l’environnement de la traite ou de l’alimentation des Résultats et Discussion animaux ou même des humains. Les espèces d’Enterococcus sont omniprésentes, elles sont retrouvées dans le sol, sur les plantes et en grand nombre dans les produits laitiers où, dans certains cas, ils prévalent sur les lactobacilles et les lactocoques (Franz et al., 1999). Environ
la moitié des espèces d’Enterococcus ont été décrites relativement récemment (Franz et al., 2011). L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris, présentes naturellement dans le lait cru, assurent la fermentation spontanée des produits de fabrication traditionnelle. Elles sont utilisées dans le processus de fabrication du beurre. Des ferments du genre Lactococcus sont ajoutés à la crème pour la fermenter. Quant à la souche L. garvieae, c’est une espèce de lactocoque isolée de produits laitiers issus du lait cru. Cette souche s’est retrouvée dans le beurre par contamination. Fortina et al. (2003) et Alegria et al. (2009) rapportèrent que cette espèce est retrouvée dans plusieurs produits laitiers de ferme fabriqués à partir de lait cru.
La présence d’entérocoques dans le lait cru et ses dérivés est appréciée. En effet, ces dernières années les entérocoques ont fait l’objet de plusieurs études. Cet intérêt croissant est dû à l’importance des propriétés technologiques et antimicrobiennes des entérocoques. Beaucoup d’aliments contiennent naturellement un nombre variable d’entérocoques, en particulier les deux espèces E. faecalis et E. faecium. De faibles concentrations de entérocoques/g sont généralement retrouvées dans une grande variété d’aliments, et certaines variétés de fromages et de saucisses fermentées occasionnellement peuvent contenir plus de 106 entérocoques / g (Hartman et al., 2001).

Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques

Nous avons évalué l’activité inhibitrice des bactéries lactiques par la méthode de Fleming et al. (1975). L’activité inhibitrice des 21 bactéries lactiques isolées du lait cru a été évaluée visà-vis de 4 bactéries indicatrices, Staphylococcus aureus ATCC 25925, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et E coli ATCC 25922. Les autres bactéries lactiques ont été testées pour leurs activités inhibitrices vis-à-vis de 6 bactéries indicatrices, Staphylococcus aureus HB1, Proteus vulgaris HB10, Proteus mirabilis HB3, Pseudomonas. sp HB2, E coli EC3 et Enterococcus sp H3. Cette dernière H3 est utilisée comme indicatrice car elle est sensible à l’activité antibactérienne de plusieurs espèces bactériennes du souchier du laboratoire LBMB.
L’activité inhibitrice des bactéries se manifeste par l’apparition d’un halo d’inhibition autour des touches. Un exemple de résultats obtenus est montré dans la Figure 7. Les diamètres des halos d’inhibitions des bactéries cibles inhibées par les isolats du lait cru sont présentés dans la Figure 8.
On peut faire les remarques suivantes :
• On observe une activité inhibitrice chez 57% des isolats de lait cru vis-à-vis des 4 bactéries indicatrices testées. 43% des isolats ne présentent pas d’inhibition. • 86% des interactions sont des inhibitions présentant un diamètre du halo clair compris entre 2 et 12 mm. • Nous avons réparti les inhibitions en fonction des diamètres des halos clairs. Les inhibitions obtenues se répartissent en 32% d’inhibition dont le diamètre du halo clair est ≤ 3 mm et 54% dont le diamètre d’inhibition est ˃ 3 mm. Selon Simsek et al. (2006), les inhibitions dont les diamètres sont ˃ 3 mm sont qualifiées d’effet inhibiteur élevé. • Les cas d’inhibitions dont les diamètres des halos clairs sont ˃ 3 mm sont les suivants :
• 90% des isolats inhibent Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Staphylococcus aureus ATCC 25925 et E coli ATCC 25929 sont inhibés par 86% des isolats et Staphylococcus aureus ATCC 43300 est inhibé par 81% des isolats. • E. faecium LO12.1 a inhibé Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 est apparue comme la souche la plus sensible puisqu’elle a été inhibée par 19 bactéries sur 21 testées avec un diamètre d’inhibition compris entre 2 et 11 mm.
La Figure 9 regroupe les résultats des inhibitions des bactéries cibles par les souches isolées du beurre et de la collection du laboratoire. Les remarques suivantes peuvent être faites : • 13% des bactéries lactiques testées présentent une activité inhibitrice vis-à-vis des 6 bactéries cibles. • 42% des interactions sont des inhibitions dont les diamètres des halos clairs varient de 2 à 16 mm. Ces cas d’inhibition se répartissent en 18% d’inhibition avec des diamètres ≤ 3 mm et 24% d’inhibition avec des diamètres ˃ 3 mm. • Les cas d’inhibition dont les diamètres sont ˃ 3 mm sont les suivants  -inhibition d’E. coli EC3 par E. faecium LO4 -inhibition de Proteus vulgaris HB10 par L. lactis et E. faecium  -inhibition de Proteus mirabilis HB3 par E. faecalis BRC2 et L. lactis BRC4 E. durans BRC6 et E. faecium (BRO2, LO4 et LO12) -inhibition de Staphylococcus aureus HB 1 par L. lactis (BRA3, BRA5, BRC4)Résultats et Discussion

• Les fréquences d’inhibition des souches cibles se répartissent comme suit : – 21% des isolats ont inhibé E. coli EC3, – 47% des isolats ont inhibé Proteus vulgaris HB10, – 43% des isolats ont inhibé Proteus mirabilis HB3, – 52% des isolats ont inhibé Staphylococcus aureus HB1, – 30% des isolats ont inhibé Pseudomonas sp HB2 – 56% des isolats ont inhibé E. faecium H3.
• Certaines bactéries lactiques inhibent une seule bactérie cible sur les 6 testées, comme par exemple, E. durans BRC6 et L. lactis ssp lactis BRC8 qui n’inhibent que P. mirabilis HB3 avec un diamètre d’inhibition respectivement de 4 et 3 mm ou L. lactis ssp lactis BRC9 qui présente un effet inhibiteur contre E. coli avec un diamètre d’inhibition de 3 mm ou encore E. faecalis BRC10 qui manifeste une activité inhibitrice vis-à-vis de P. vulgaris HB10 avec un diamètre d’inhibition de 3 mm .

Résultats et Discussion

• Nous avons remarqué que 10 bactéries lactiques sur les 23 testées n’ont pas inhibé E. faecium H3. Cette souche H3 est la souche la plus sensible aux inhibitions car elle a été inhibée par 56% des isolats. Elle est suivie par Staphylococcus aureus HB1 (52%) et Proteus vulgaris HB10 (47%).
A l’issue de ce test, nous avons retenu les bactéries lactiques présentant des diamètres d’inhibition ≥ 10 mm. Il a été rapporté par Cardinal et al. (1997) et Tahiri (2007) que les isolats générant des diamètres d’inhibition ˃ 10 mm sont considérés comme souches inhibitrices.
avons également retenu les souches E. durans LO1.5, E. faecium (LO4.4, LO12) et Enterococcus sp LO12.2. Ces bactéries lactiques ont été retenues pour leur pouvoir inhibiteur (diamètre d’inhibition ˃ 3 mm) vis-à-vis de plus de 50% des bactéries cibles testées. La souche L. lactis BRA5 a été choisie car elle inhibe Staphylococcus aureus HB1 et Proteus vulgaris HB 10 (6 mm). Les autres bactéries lactiques inhibitrices n’ont pas été retenues en raison de leur faible effet inhibiteur (diamètres des halos clairs ≤ 3 mm).
Au final de cette sélection de souches inhibitrices, nous avons retenu pour la suite de l’étude 17 bactéries lactiques. Les isolats lactiques des échantillons de beurre et de lait cru ainsi que les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 montrèrent que les bactéries lactiques sont douées d’activité inhibitrice vis-à-vis de bactéries à Gram+ et à Gram-. Le potentiel inhibiteur semble varier d’une souche à une autre par les diamètres d’inhibition, le nombre et le type de Gram des bactéries cibles testées. Ces bactéries inhibitrices sont des souches de L lactis ssp lactis, L lactis ssp cremoris, Ces inhibitions peuvent être dues à une variété de produits inhibiteurs. Huttunen et al. (1995), rapportèrent que les propriétés antibactériennes des bactéries lactiques dépendent de plusieurs critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances antibactériennes comme les bactériocines, les acides organiques, les acides gras et le peroxyde d’hydrogène.
Les bactéries sélectionnées peuvent être utiles pour inhiber des bactéries telles que Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris et E. faecium. Ces bactéries lactiques sont douées. d’activité inhibitrice dirigée contre des bactéries de même groupe, des bactéries à Gram+ et/ou des bactéries à Gram -. Le métabolite antibactérien que produisent toutes les bactéries lactiques lors de leur croissance est l’acide lactique. Ce métabolite modifie le pH du milieu et peut avoir une influence sur la croissance des bactéries cibles testées. Ces dernières sont des bactéries pathogènes ou indésirables fréquemment rencontrées dans les aliments tels que Staphylococcus aureus et E coli. D’après Jay et al. (2005), il a été établi que la plupart des micro-organismes ont une croissance optimale à pH 7. Il a été démontré que l’action bactéricide des acides organiques est le résultat d’une diminution du pH dans la cellule bactérienne. Par exemple, Malicki et al.(2004) observèrent que le pH de la farine de poisson diminue directement après addition d’acide qui résulte en une réduction de la population d’E.
coli O157 :H7. Les inhibitions des souches de Staphylococcus aureus peuvent aussi être attribuées à la production d’acide lactique. En effet, il a été confirmé par Hicks et Goepfert (1968) que l’acide lactique et l’acide acétique produits par les bactéries lactiques participent à l’inhibition de Staphylococcus aureus. L’acide lactique est capable d’inhiber la croissance de nombreux types de bactéries d’altération d’aliments, y compris des espèces de bactéries Gram– des familles des Enterobacteriaceae et Pseudomonaceae (Doores, 1993). L’action antibactérienne de l’acide lactique est en grande partie, mais pas totalement, attribuée à la capacité de sa forme non dissociée de pénétrer la membrane cytoplasmique, entraînant une réduction de pH intracellulaire et la perturbation de la force motrice transmembranaire de protons (Ray et Sandine, 1992). Alakomi et al. (2000) démontrèrent que l’acide lactique possède une propriété antimicrobienne grâce à l’abaissement du pH, mais aussi comme un agent perméabilisant de la membrane externe des bactéries Gram négatif.

Table des matières

Introduction 
1- Synthèse Bibliographique
1-1 Lait et Beurre traditionnel
1-1-1 Lait
1-1-2 Microbiologie du lait cru
1-1-3 Beurre traditionnel
1-1-4 Microbiologie du beurre
1-2 Bactéries lactiques
1-2-1 Définition
1-2-2 Caractéristiques générales
1-2-3 Habitat
1-2-4 Taxonomie et habitats des lactocoques et entérocoques
1-2-4-1 Lactococcus
1-2-4-2 Enterococcus
1-2-5 Propriétés métaboliques d’intérêt technologie des entérocoques
1-2-5-1 Production d’acide
1-2-5-2 Activité Protéolytique
1-2-5-3 Activité lipolytique et estérasique
1-2-5-4 Métabolisme du citrate et pyruvate
1-2-6 Application des entérocoques comme probiotiques
1-3 Activité antimicrobienne
1-3-1 Acides organiques
1-3-2 Peroxyde d’hydrogène
1-3-3 Diacétyle, acétaldéyde et acétoïne
1-3-4 Dioxyde de carbone
1-4 Bactéricocines et Entérocines
1-4-1 Classification
1-4-4 Immunité
1-4-5 Mécanisme d’action
1-4-6 Spectre d’activité
1-5 Facteurs influençant la production de bactériocines
1-5-1 Souche bactérienne
1-5-2 Influence du pH
1-5-3 Influence de la température
1-5-4 Influence des milieux de culture
1-6 Application des bactériocines dans l’industrie alimentaire
2 Matériel et Méthodes
2-1 Bactéries
2-2 Milieux de culture, conditions de croissance et conservation des bactéries
2-3 Isolement des bactéries lactiques
2-3-1 Isolement de bactéries lactiques à partir du beurre traditionnel
2-3-2 Isolement des entérocoques à partir des échantillons de laits crus
2-4 Identification phénotypique des bactéries lactiques
2-4-1 Caractérisation morphologique
2-4-2 Caractérisation physiologique
2-4-3 Caractérisation biochimique
2-5 Caractérisation moléculaire des bactéries
2-5-1 Extraction de l’ADN
2-5-2 Amplification de l’ADN des entérocoques par PCR
2-5-3 Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la PCR
2-5-4 Analyse phylogénétique des bactéries
2-6 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques
2-7 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogenes
2-8 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens
2-8-1 Sensibilité aux enzymes
2-8-3 Effet au pH
2-9 Influence des milieux de cultures sur la production de métabolites antibactériens
2-9-1 Influence du tampon du milieu M17
2-9-2 Influence de différentes concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17
2-9-3 Influence des sucres
2-9-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés
2-10 Cinétique de croissance et de production de métabolites antibactériens
2-11 Purification des bactériocines
2-11-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium
2-11-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25
2-11-3 Chromatographie échangeuse d’ions
2-11-4 Electrophorèse SDS-PAGE
3-Résultats et discussion
3-1 Isolement des bactéries lactiques
3-2 Identification phénotypique des bactéries lactiques
3-3 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques
3-4 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogènes
3-5 Caractérisation moléculaire des bactéries
3-5-1 Amplification de l’ADN des entérocoques
3-5-2 Analyse phylogénétique
3-6 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens
3-6-1 Mise en évidence de l’activité inhibitrice dans le surnageant de culture
3-6-2 Sensibilité aux enzymes
3-6-3 Traitement par la chaleur
3-6-4 Effet de différents pH
3-7 Influence des milieux de culture sur la production de métabolites antibactériens
3-7-1 Influence du tampon du milieu de culture
3-7-3 Influence des sucres
3-7-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés
3-8 Cinétique de croissance et de production de bactériocines
3-9 Purification des bactériocines
3-9-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium
3-9-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25
3-9 -3 Chromatographie par échanges d’ions
3-9-4 Détermination de la taille moléculaire des bactériocine par SDS-PAGE
4 Conclusion 
5 Références Bibliographiques
Annexe I
Annexe II

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