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Modèle de transmission de la prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire et gènes utiles au diagnostic
Les facteurs de risques génétiques sont variés. Certaines susceptibilités génétiques induisent un faible risque de cancer nettement influencé par les risques environnementaux tandis que d’autres susceptibilités génétiques induisant un risque fort répondent au modèle mendélien de transmission autosomique dominante. Par exemple, des variations pathogènes des gènes BRCA1 et BRCA2 induisent un risque fort de prédisposition au cancer du sein tandis que les variants pathogènes des gènes « Checkpoint kinase 2 » (CHEK2) ou « ataxia telangiectasia mutated » (ATM) induisent un risque plus modéré. De même, le risque génétique peut répondre à un modèle monogénique, c’est-à-dire conféré par une mutation germinale d’un seul gène ou répondre à un modèle multigéniques dû à l’action conjointe de plusieurs gènes provoquant un risque à partir d’un certain seuil. Actuellement, dans le cadre du diagnostic, seuls les facteurs de risque génétique monogéniques élevés sont pris en compte aujourd’hui. Ceci correspond donc plutôt à des modèles mendéliens répondant à une transmission autosomique dominante dont la pénétrance est forte mais néanmoins incomplète. En 2017, le GGC a établi un panel de 13 gènes reconnus d’utilité clinique dans le contexte de prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire.
Description générale des mécanismes de transmission de la prédisposition et d’apparition du cancer
Le mode de transmission de cette prédisposition par les différents gènes étudiés actuellement en routine diagnostique est de type autosomique dominant. Ainsi, étant donné que chaque individu transmet la moitié de son patrimoine génétique, une femme ou un homme porteur de la mutation a un risque sur deux de la transmettre à sa descendance.
L’ensemble des gènes testés dont les résultats sont utiles au conseil génétique, c’est-à-dire que le niveau de risque de cancer induit par les variants pathogènes de ces gènes est suffisamment élevé pour les mesures de prise en charge adaptée soit jugée comme bénéfique, sont des gènes dits « suppresseurs de tumeurs ». Les mutations décrites sont généralement rares ayant une fréquence inférieure à 0,1 % dans la population générale et sont des mutations inactivatrices, de type perte de fonction telles que des mutations « frameshift » ou « non-sens » entrainant l’apparition d’un codon stop prématuré ou des mutations ponctuelles « faux sens » dans des domaines importants pour la fonction de la protéine et suffisantes pour aboutir à une perte de fonction de la protéine. Il existe aussi des évènements de plus grandes tailles dit CNV (« Copy Number Variation ») pouvant entrainer la délétion ou la duplication de tout ou une partie du locus génique.
De manière assez générale, le mécanisme d’apparition du cancer répond au modèle « 2 hits » de Knudson (26). Pour rappel, chaque gène est présent en double au sein de notre patrimoine génétique provenant pour moitié de la mère et pour moitié du père. Dans le syndrome HBOC, la personne prédisposée possède une altération génétique située au niveau d’un gène parmi ceux impliqués dans le syndrome HBOC à l’état hétérozygote. Ainsi, l’ensemble des cellules de l’individu atteint de ce syndrome possède un allèle portant le gène BRCA1 muté et un allèle porteur du gène BRCA1 non muté dit sauvage. Si une cellule acquiert par malchance une altération du gène BRCA1 sauvage, elle ne produira plus de protéine BRCA1 fonctionnelle contribuant à l’apparition du cancer. On parle de modèle « 2 hits ».
Dans le cadre de ces syndromes de prédisposition, l’apparition du cancer est initiée par l’inactivation du second allèle non muté, dit sauvage, le plus souvent par perte d’hétérozygotie soit en anglais le terme « lost of heterozygoty » (« LOH ») lié à un remaniement chromosomique. L’inactivation du second allèle peut être due à l’apparition d’une seconde mutation inactivatrice (« second hit ») entraînant ainsi une perte totale de la fonction de la protéine dans la cellule impliquée, favorisant le processus de cancérogénèse (Figure 1) (27).
BRCA1 et BRCA2
Les gènes BRCA1 et BRCA2 sont les deux gènes les plus fréquemment impliqués dans le syndrome de prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire. Ils ont été découverts par étude de liaison génétique (« Linkage ») dans des familles très évocatrices de prédisposition au cancer du sein. Ainsi, le locus du gène BRCA1 en 17q21 a été mis en évidence en 1990 (28). Puis, le locus du gène BRCA2 en 13q13 a été mis en évidence en 1994 (29). Ces études sont basées sur la ségrégation concomitante des allèles portant des marqueurs polymorphes avec le locus du gène responsable de la maladie, dans plusieurs familles.
Les deux gènes ont fait l’objet à l’origine d’un dépôt de brevet par la société Myriad Genetics (30) engendrant des coûts d’analyses colossaux mais de nombreuses controverses ont conduit à l’invalidation de ces brevets en mars 2010 par la Cour Fédérale des Etats Unis (31). Ce sont aujourd’hui les gènes les plus séquencés dans le monde. Dans la population générale, approximativement une personne sur 400 présentent une mutation du gène BRCA mais cette prévalence peut atteindre le ration 1/200 dans certaines populations (32). Les protéines BRCA1 et BRCA2 sont connues pour être impliquées dans la réparation des cassures doubles brins de l’ADN par recombinaison homologue, mais ces protéines interagissent avec de nombreuses autres protéines impliquées dans diverses fonctions telles que la progression du cycle cellulaire, la régulation des gènes de transcription et l’ubiquitinylation (33). Cela fait d’eux de véritables gardiens de l’intégrité du génome.
Les mutations pathogènes des gènes BRCA1 et BRCA2 prédisposent principalement au risque de cancers du sein et de l’ovaire. Le risque cumulé de cancer du sein à l’âge de 80 ans est de 72 % pour les patientes ayant une mutation du gène BRCA1 et de 69 % pour les patientes ayant une mutation du gène BRCA2. L’incidence des cancers du sein chez les porteuses de mutations BRCA1 et BRCA2 sont majeures entre 30 et 60 ans. Concernant le cancer de l’ovaire, le risque cumulé à 80 ans a été estimé à 44 % pour les porteuses de mutations du gène BRCA1 et 17 % pour les patientes mutées BRCA2 (34). Dans une moindre mesure, le gène BRCA2 principalement et le gène BRCA1 induisent aussi un risque beaucoup plus faible néanmoins de cancer de la prostate (35) et du pancréas (36) (37). Aussi, un porteur homozygote ou hétérozygote composite du gène BRCA2 nommé aussi FANCD1 (« Fanconi anemia complementation group D1 ») présentera un syndrome de Fanconi sévère caractérisé notamment par des signes malformatifs ainsi qu’une prédisposition aux hémopathies et à certaines tumeurs solides (38).
PALB2
Le gène PALB2 (« partner and localizer of BRCA2 ») ou FANCN (« Fanconi anemia complementation group N ») code pour une protéine ayant un domaine de liaison à la protéine BRCA2 et permet notamment sa stabilisation intranucléaire et son accumulation en cas d’erreur de dommage à l’ADN (39). L’occurrence des mutations du gène PALB2 varie de 0,1 % à 1,5 % selon les populations. Plusieurs études ont estimé que le risque de cancer du sein conféré par les mutations du gène PALB2 à l’état hétérozygote sont voisines de celles dues aux mutations des gènes BRCA1 et BRCA2 (40) (41) (42). En revanche, ce gène n’a pas montré de surrisque significatif de prédisposition au cancer de l’ovaire (40) (43).
RAD51C ET D
La protéine RAD51 possède un rôle majeur dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue. Les gènes RAD51C (ou FANCO) et RAD51D codent pour des paralogues de RAD51 qui sont des protéines médiatrices de RAD51 qui favorisent son activité. Les mutations constitutionnelles de ces gènes confèrent un risque augmenté de cancer de l’ovaire du même ordre que celui conféré par les mutations du gène BRCA2 avec un risque relatif (RR) estimé à 5,88 (IC = 2,91-11,88 p=7,65 x 10-7) pour le gène RAD51C (44) et un odds ratio (OR) à 6,3 (IC = 2,89-13,85 p=4,8 x 10-6) pour le gène RAD51D (45). En revanche, la surveillance mammaire n’est pas recommandée à l’heure actuelle pour ces deux gènes même si le gène RAD51C est associé à un surrisque de cancer du sein (46).
CDH1
Le gène de la cadhérine 1 (CDH1) (NM_004360.3) code pour la E-cadhérine, une protéine d’adhésion cellulaire qui agit comme suppresseur de tumeur en inhibant l’invasion cellulaire (47). Les mutations germinales de CDH1 sont à l’origine du cancer gastrique diffus héréditaire et du syndrome du cancer du sein lobulaire (CSL) (OMIM 137215). Pour les porteurs d’altérations pathogènes, le risque estimé au cours de la vie de développer un cancer gastrique diffus atteint 70% pour les hommes et 56% pour les femmes. Les femmes ont également un risque de CSL à vie d’environ 42 % (48).
PTEN
Le gène PTEN (« Phosphatase and TENsin homolog ») agit comme suppresseur de tumeur en régulant négativement la voie PI3K(phosphoinositide-3-kinase)-AKT – impliquée notamment dans la prolifération, la survie et la croissance cellulaire. Les mutations constitutionnelles du gène PTEN (« Phosphatase and Tensin homolog ») à l’état hétérozygote sont responsables d’un syndrome appelé maladie de Cowden (49). Les critères majeurs d’indication à la recherche d’une mutation constitutionnelle du gène PTEN selon les « National Comprehensive Cancer Network » (NCCN) guidelines version 1.2014 sont les suivants :
– Les lésions cutanéo-muqueuses multiples telles que des trichilemmomes par exemple c’est-à-dire des proliférations des follicules pileux
– La macrocéphalie
– Les hamartomes multiples gastro-intestinaux
– La maladie de Lhermitte Duclos provoquée par une lésion hamartomateuse de la fosse postérieure
– La survenue d’un cancer du sein, de l’endomètre et/ou de la thyroïde
L’inclusion de ce gène dans le panel HBOC est justifiée parce qu’il induit un risque très élevé de cancer du sein avec un risque cumulé à 70 ans supérieur à 75 % (50) (51) même si l’inclusion des cas index dans les études réalisées tend à surestimer ce risque. De plus, ce syndrome augmente le risque de cancer de l’endomètre et de la thyroïde. Dans une moindre mesure, une augmentation du risque de cancer du rein et du colon a aussi été rapportée pour les porteurs de ce syndrome (50).
Les gènes MMR
Les gènes MMR (« Mismatch repair ») soit les gènes MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2 sont impliqués dans la réparation des mésappariements de l’ADN. Les mutations constitutionnelles à l’état hétérozygotes de ces gènes sont responsables du syndrome de Lynch qui est la cause de 2-4 % des cancers colorectaux. Ce syndrome prédispose à différents cancers dont le cancer colorectal sans contexte de polypose, le cancer de l’endomètre, le cancer urothélial et le cancer de l’intestin grêle. Il prédispose aussi à d’autres cancers si l’on considère le spectre tumoral élargi comme le cancer gastrique, le cholangiocarcinome, le cancer de l’ovaire, le glioblastome et le carcinome sébacé. Le syndrome de Lynch est souvent évoqué chez un patient lors du diagnostic de cancer colorectal lorsque le contexte clinique est évocateur et que ce dernier répond notamment aux critères d’Amsterdam et de Bethesda basés en grande partie sur les antécédents personnels et familiaux de cancers du spectre.
Les gènes MMR ont été inclus dans le panel car des études ont montré que les porteurs de mutation hétérozygote d’un de ces gènes avaient un risque cumulé de cancer de l’ovaire à 80 ans de 8 % à 15 % selon le gène responsable (52). Le gène conférant le plus de risque est le gène MSH2. L’âge moyen au diagnostic de ces cancers est de 45 ans. Par ailleurs, la prévalence des tumeurs à composante endométrioïde et mucineuse est importante dans ce syndrome (16).
Concernant le cancer du sein, les femmes porteuses de mutations d’un des gènes MMR ont un risque proche de celui de la population générale. Cependant, ces évaluations du risque de cancer ont été réalisées dans le cadre d’une recherche de syndrome de Lynch et non dans les familles de cancers du sein. Des données sur les familles de cancer du sein vont permettre à l’avenir d’affiner l’estimation de ces risques.
TP53
Le gène TP53 est un facteur de transcription d’importance majeure impliqué dans la régulation de nombreux gènes ayant un rôle dans le cycle cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose. Les mutations constitutionnelles du gène TP53 à l’état hétérozygote sont responsables du syndrome de Li Fraumeni (LFS) dominé par l’apparition de tumeurs précoces du jeune adulte et de l’enfant. Les tumeurs du spectre sont les cancers du sein pré-ménopausique, sarcome des tissus mous, ostéosarcome, tumeur du système nerveux central, corticosurrénalome.
La protéine TP53 agit en formant un tétramère. Dans ce syndrome, les mutations décrites sont en majorité des mutations ponctuelles à type de mutations faux sens (66 %) dont certaines sont dominantes négatives. Ces mutations dominantes négatives sont responsables d’une protéine non fonctionnelle du fait de la formation d’un tétramère non fonctionnel responsable d’un phénotype plus sévère et plus précoce chez les individus porteurs. Au contraire, les mutations perte de fonction telles que les mutations « frame shift » ou non-sens entrainent souvent un phénotype moins sévère (53).
Le spectre tumoral du syndrome de LFS est détaillé dans les critères de Chompret version 2015 (53). Il s’agit des critères d’indication d’analyse du gène TP53. Ces critères sont les suivants :
(1) La présentation familiale
Probant avec une tumeur du spectre du LFS ci-décrits avant 46 ans et au moins un apparenté au premier ou au deuxième degré ayant développé une tumeur du spectre LFS (sauf le cancer du sein si le probant a aussi développé un cancer du sein) avant 56 ans ou avec des tumeurs multiples
(2) Des tumeurs multiples primitives
Probant avec des tumeurs multiples du spectre LFS (sauf les cancers du sein multiples) dont l’un est diagnostiqué avant 46 ans.
(3) Des tumeurs rares
Patient avec un corticosurrénalome, une tumeur du plexus choroïde, un rhabdomyosarcome de sous-type embryonnaire anaplasique, indépendamment de l’histoire familiale.
(4) Le cancer du sein précoce
Un cancer du sein avant 31 ans.
Les enfants atteints de ce syndrome développent principalement des ostéosarcomes, des corticosurrénalomes, des tumeurs du système nerveux central et des sarcomes des tissus mous. En revanche, chez l’adulte se développe en grande majorité des cancers du sein et des sarcomes des tissus mous. Concernant l’histologie des cancers du sein développés dans ce syndrome, 55
% sont de type HER2+ et 37 % sont des tumeurs triple positifs soit RH+ (récepteur hormonal +) HER2+ (53). Il est important de connaitre le statut TP53 des patientes porteuses car cela peut modifier la prise en charge de ces dernières. En effet, les patients porteurs d’un variant
pathogènes de TP53 développent très souvent des tumeurs secondaires en cas de traitement par radiothérapie, au niveau du champs d’irradiation (53). De même, la plupart des chimiothérapies sauf les poisons du fuseau ont entrainé une génotoxicité sur des modèles de souris LFS (54). La chirurgie est donc à privilégier chez eux en cas de développement d’un cancer.
Il s’agit d’un syndrome à pénétrance élevée mais incomplète et le risque actuel de développer un cancer dans le cadre d’une mutation TP53 est probablement surestimé du fait d’un biais de sélection dû au fait que les tests génétiques sont réalisés dans des familles au phénotype évocateur. En effet, une étude réalisée chez 63 983 contrôles a montré que la prévalence des mutations pathogènes et probablement pathogènes de TP53 dans la population générale est de 0,2 % (55). Il est important de tenir compte du contexte familial lorsqu’un variant pathogène de TP53 a été mis en évidence dans le cadre d’un test en panel de plusieurs gènes.
Détection des individus à risque génétique et prise en charge spécifique
Pour l’ensemble des 13 gènes inclus dans le panel GGC-unicancer, lorsque le variant causal est identifié chez le cas index, un test prédictif est possible chez les apparentés afin de préconiser une surveillance adaptée selon le gène concerné. Ainsi différents référentiels recommandent un suivi spécifique et parfois une chirurgie prophylactique afin de réduire considérablement le risque d’apparition de cancer.
Par exemple, en ce qui concerne les gènes BRCA1 et 2, les référentiels de l’HAS 2014 et de l’INCa 2017 recommandent tout d’abord la réalisation d’un suivi gynécologique annuel à partir de 20 ans. Ils préconisent aussi la réalisation d’une IRM et d’une mammographie mammaire annuelle de 30 à 65 ans (à partir de 65 ans, l’IRM est remplacée par la mammographie seule). En outre, une chirurgie mammaire prophylactique de réduction du risque peut être proposée après validation en réunion de concertation pluridisciplinaire (RCP). Concernant le risque de cancer de l’ovaire, aucun suivi n’a montré d’efficacité. Ainsi, seule l’annexectomie prophylactique est fortement encouragée à partir de 40 ans mais à adapter selon l’histoire familiale et le gène concerné, après validation en RCP (56). Concernant le gène PALB2, seul le suivi mammaire est préconisé et identique aux gènes BRCA1 et BRCA2 tandis que pour les gènes RAD51C et RAD51D seule l’annexectomie prophylactique est préconisée.
Pour le gène TP53, il n’a pas été mis en évidence de surrisque de cancer de l’ovaire. En revanche, les femmes porteuses d’une mutation TP53 ont un risque élevé de cancer du sein précoce et l’IRM mammaire est préconisée dès 20 ans avec une échographie. La mammographie est en effet, à éviter dans cette prédisposition du fait de la radiosensibilité augmentée. La chirurgie mammaire de réduction du risque peut être proposée. Concernant les autres risques de cancer, le suivi doit se faire selon le référentiel Li Fraumeni (56) qui comporte un suivi lourd avec notamment la réalisation d’une IRM annuelle du corps entier. Cependant, la découverte incidente de mutations TP53 dans des familles dont l’histoire est non évocatrice amène à des discussions sur la surveillance qui pourrait évoluer dans les prochaines années.
En ce qui concerne les autres gènes du panel, en plus de la surveillance gynécologique recommandée, une surveillance spécifique est préconisée selon le gène atteint par des référentiels variés (selon le référentiel du Lynch pour les gènes MMR, selon le référentiel de la maladie de Cowden pour PTEN…)
Diagnostic moléculaire chez les cas index : Le séquençage à haut débit
Historique des techniques antérieures
Jusqu’à très récemment, seuls les gènes BRCA1 et BRCA2 étaient analysés pour le diagnostic des prédispositions aux cancers du sein et de l’ovaire. La recherche de mutations était principalement effectuée par séquençage Sanger, technique inventée par Frédérick Sanger en 1977 en Angleterre. Cependant, l’inconvénient de cette technique est qu’elle nécessite beaucoup de temps et de réactifs pour séquencer ces deux gènes. En effet, cette technique de séquençage par synthèse de nucléotide permet de séquencer des fragments de 400 à 900 paires de bases. Or, la région codante du gène BRCA1 et BRCA2 comporte respectivement 7,2 kb et 10,98 kb, ce qui représente de nombreux fragments à séquencer. Les plus performants des séquenceurs Sanger comme le 3130xL, techniques NGS (« Next Generation Sequencing ») de première génération sont considérés comme techniques de haut débit car ils sont capables de paralléliser 96 électrophorèses en utilisant 96 capillaires. Ils permettent ainsi l’analyse de 96 x 800 nucléotides lus en 1 heure. L’offre diagnostic était néanmoins très limitée en nombre de cas et de gènes séquencés et les délais de rendu des résultats longs d’autant que la détection des CNV était souvent réalisée en parallèle par des techniques dédiées, MPLA (« multiplex ligation-dependent probe amplification ») ou en QMPSF (« quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments »). L’utilisation de méthode de pré-criblage (DHPLC (« Denaturing High Performance Chromatography » ) (57), HRM (« High Resolution Melt ») (58), EMMA (« Enhanced Mismatch Mutation Analysis ») (59) par exemple), dont certaines pouvaient détecter simultanément les mutations de petites tailles et de grandes tailles, ont permis d’améliorer les conditions de réalisation de ces analyses mais sans commune mesure avec le séquençage à haut débit de deuxième génération.
Le principe du séquençage à haut débit : exemple de la technique Illumina
Le développement des techniques de séquençage à haut débit de deuxième génération depuis à peine une quinzaine d’années a révolutionné la génétique. Le séquençage à haut débit aussi appelé NGS permet le séquençage de plusieurs centaines de milliers de bases par l’utilisation d’approche massivement parallèle. Cette nouvelle technologie a permis d’augmenter considérablement le débit d’analyse tout en réduisant les coûts. Les séquenceurs NGS de deuxième génération sont capables de lire des fragments de 150 à 300 paires de bases (pb) mais jusqu’à plusieurs milliards de fragments à la fois. Ainsi, ces nouvelles technologies sont capables de générer l’analyse de plusieurs génomes complets de 3,2 milliards de paires de bases en moins de 48h.
Plusieurs techniques de séquençage à haut débit de deuxième génération existent mais celle utilisée pour l’étude est la technologie Illumina qui est une technique de séquençage par synthèse et qui sera donc la seule détaillée ci-après.
La première étape du séquençage consiste à préparer la librairie, c’est-à-dire les fragments d’ADN à séquencer (Figure 2). L’ADN de chaque patient analysé est fragmenté soit par sonication ou soit par l’utilisation d’enzymes de restriction puis sélectionné de manière à obtenir des fragments d’une taille d’environs 200 pb. Ces fragments vont subir une étape de réparation appelée End-repair d’adénylation afin d’éviter la ligation de ces derniers entre eux. Ensuite, des adaptateurs vont être ajoutés aux extrémités des fragments. Ces adaptateurs sont des fragments d’ADN simple brin qui vont permettre plus tard l’étape de séquençage par hybridation de l’amorce. Dans le cadre d’un re-séquençage ciblé comme proposé pour le diagnostic moléculaire des maladies génétiques aujourd’hui, l’étape d’après consiste à enrichir les régions d’intérêt soit par amplification soit par capture. La technique par capture nécessite l’utilisation de sondes nucléotidiques biotinylées d’une centaine de paires de bases complémentaires des régions d’intérêts. Ces dernières vont se lier aux fragments d’ADN ciblés et vont pouvoir venir se fixer à des billes magnétiques qui seront elles même récupérées par des aimants. Après avoir récupéré et purifié les fragments capturés, des index nucléotides spécifiques (ou barre code moléculaire) à chaque patient vont être ajoutés aux fragments afin de pouvoir réunir (multiplexage) l’ensemble des échantillons à séquencer sur la même lame de séquençage (dites « Flow Cell »), qui seront donc séquencés simultanément (Figure 2).
Les défis de l’interprétation des variants par NGS
Avec le NGS, des nombreux variants sont détectés chez les patients et la difficulté actuelle est de les interpréter. Un guide de recommandation consensuel publié par l’ACMG (« American College of Medical Genetics and Genomics ») en 2015 est utilisé au niveau international pour l’interprétation et la classification des variants (65) En pratique, le guide de l’ACMG permet une traçabilité des décisions et doit être adapté à chaque pathologie et se décline parfois par des versions adaptées par pays ou syndrome. Ce guide tend à standardiser l’interprétation des variants et se base sur un modèle de catégorisation permettant de stratifier les variants en 5 classes. L’introduction de cette classification en 5 classes a premièrement été proposée par S.E. Plon en 2008 et rapidement utilisée dans une approche de classification basée sur un calcul de probabilité de pathogénicité dans un modèle multifactoriel (66).
– Classe 1 : bénin
– Classe 2 : probablement bénin
– Classe 3 : variant de signification inconnue
– Classe 4 : variant probablement délétère
– Classe 5 : variant délétère
Les principaux outils permettant cette classification sont :
– Les bases de données : Les bases de données en population générale telles que ExAC (« Exome Agregation Consortium ») ou dbSNP (« Single Nucleotide Polymorphism database ») (67) et maintenant gnomAD permettent de connaître la fréquence du variant dans la population générale. Un variant de fréquence > 1% est un polymorphisme. De manière générale, plus un variant est fréquent, plus il a de chance d’être bénin. Il existe aussi des bases de données de variants recensant les différentes interprétations et pour certaines les phénotypes des patients correspondants. Elles ne sont pas forcément toute de la même qualité et certaines ne sont pas ouvertes à l’ensemble de la communauté. Par exemple, pour le cancer du sein, il existe UMD (« Universal Mutation Database ») (68), BRCAshare (69), BRCA exchange Global alliance (70) et plus récemment la nouvelle initiative française de base multigénique de partage de connaissances promue pour les laboratoires d’oncogénétique sous l’égide d’UNICANCER et de l’INCa : FrOG (« the French OncoGenetic database »).
– Les logiciels de prédictions bioinformatiques permettant de prédire les effets délétères ou non des variants sur la protéines (Align GVGD (66), SIFT (71), Polyphen, CADD par exemple) en tenant compte de la conservation du nucléotide entre les différentes espèces, l’écart physico-chimique entre l’ancien et le nouvel acide aminé et la localisation de la variation sur un site fonctionnel ou non de la protéine.
– Le logiciel de prédiction de l’effet du variant sur l’épissage tels que SSF (72), MES (73), SpiCE (74)
– Les études de coségrégation du variant avec la pathologie
– Les diverses études fonctionnelles.
Ainsi, ces divers arguments alimentent la classification du variant. Seuls les variants de classe 4 et 5 sont utilisables au titre du conseil génétique aujourd’hui c’est-à-dire qu’ils entrainent la réalisation de tests pré-symptomatiques chez les apparentés. Les apparentés porteurs du variant bénéficient d’un suivi rapproché tandis que pour les non-porteurs du variant, le suivi recommandé est celui de la population générale.
La détection et l’interprétation des variants présentant des VAF faible
L’analyse HBOC réalisée dans un cadre diagnostique au laboratoire est validée selon la norme ISO15189. Elle comporte un panel de 12 gènes recommandés par le GGC dans ce cadre. Le panel effectué au laboratoire du CFB est en fait composé de 34 gènes mais seuls les 12 gènes rendus au titre du diagnostic font l’objet d’une interprétation par les biologistes à chaque série de patients. Depuis, la mise en place de ce panel de 12 gènes il y a un peu plus d’un an et notamment l’inclusion du gène TP53, les biologistes sont de plus en plus confrontés à la détection de variants de faible fréquence allélique difficiles à interpréter. En effet, ces variants ne sont pas présents par définition à l’état hétérozygote chez l’individu. Ils peuvent tout de même être constitutionnels mais apparus durant les étapes post zygotiques au tout début de l’embryogénèse ou être le reflet de mutations somatiques tumorales ou pré-cancéreuses détectées dans le sang des patients. Ces diverses causes n’ont pas les mêmes conséquences pour la prise en charge des patients et de leurs familles d’où la nécessité de connaître leur signification. C’est un des challenges d’aujourd’hui auquel notre étude veut contribuer à répondre.
Les néomutations
Rappels de principes généraux : mutations héritées / mutations de novo / mosaïques
Une mutation constitutionnelle est une mutation présente avant la fécondation ou apparaissant lors des premières divisions du zygote. Une mutation constitutionnelle sera présente dans toutes les cellules somatiques de l’individu et également dans ses cellules germinales si elle est héritée ou apparue avant la première division cellulaire. Si elle apparait après la première division cellulaire alors l’ensemble des cellules de l’individu ne sera pas atteint. On parle dans ce cas de mosaïque constitutionnelle. Toute mutation nouvellement apparue, en mosaïque ou non, est aussi appelée mutation « de novo » ou « néomutation ». Les études d’exomes en trio par séquençage haut débit ont permis d’estimer la proportion de néomutations chez l’homme à 1,58 par exome (75).
Les néomutations constitutionnelles en pathologie humaine
En biologie, le terme mosaïque désigne l’état d’un organisme dans lequel cohabitent plusieurs populations de cellules de génotype différent. Ainsi, un être vivant comportant un phénotype en mosaïque possède des différences génotypiques entre certains de ses tissus qui ne répondent pas aux lois de l’hérédité mendélienne.
La détection d’un variant en mosaïque chez un individu implique l’émergence d’une mutation dite « de novo », ayant eu lieu précocement en postzygotique lors de l’embryogenèse. Plus la néomutation est précoce dans le développement, plus la proportion de cellules atteinte par la néomutation sera importante. A l’origine, les variants constitutionnels d’origine postzygotique ont montré leur implication dans plusieurs maladies monogéniques d’expressivité variable telles que la neurofibromatose de type 1 et 2 par exemple (76) (77). La néomutation peut toucher les cellules de la lignée germinale, les cellules de la lignée somatique ou les deux (78) (79). Il est nécessaire de connaître cette distinction car seul un individu porteur d’un variant atteignant les cellules germinales aura un risque de transmettre la néomutation à sa descendance. Cependant, en pratique, il est impossible à l’heure actuelle de s’assurer de manière certaine de l’absence de variant en mosaïque germinale en particulier chez la femme dont les gamètes sont difficilement accessibles pour des tests génétiques (78). Néanmoins, une néomutation postzygotique atteignant les cellules germinales peut être diagnostiquée chez un parent asymptomatique dont plusieurs enfants présentent une même maladie génétique avec un mode de transmission dominante, en particulier s’il s’agit d’une maladie à pénétrance complète.
En cancérologie, on parle aussi de mosaïque tumorale pour désigner l’hétérogénéité génotypique au sein d’une tumeur. En effet, Theodor Boveri en 1929 proposa un modèle selon lequel le cancer est originaire d’une modification génétique acquise au sein d’une cellule. On sait actuellement que le cancer est dû à une accumulation de mutations au cours du temps conférant un avantage sélectif à la cellule par une amélioration de ses capacités de division cellulaire, de résistance à l’apoptose, de migration… Par ailleurs, les tumeurs sont composées de plusieurs sous-populations de cellules qui ont acquis au fil du temps des néomutations indépendamment les unes des autres expliquant ainsi l’hétérogénéité tumorale. Cette hétérogénéité tumorale explique d’ailleurs en partie la réponse incomplète des patients aux divers traitements thérapeutiques, certaines cellules tumorales ayant acquises des mutations leur conférant une résistance au traitement.
Certains gènes impliqués dans les prédispositions aux cancers sont depuis longtemps décrits avec des taux rapportés important de mutation de novo et de mosaïques. C’est le cas de la neurofibromatose segmentaire de type 1 décrite pour la première fois en 1936 (80) qui est due à une mutation en mosaïque du gène NF1 (« Neurofibromin 1 »). La neurofibromatose, en plus de prédisposer aux neurofibromes, se caractérise par la présence de lésions cutanées à type de taches café au lait. Dans les formes en mosaïque, les signes cutanés ne sont pas répartis sur l’ensemble du corps mais localisés (81). Dans la neurofibromatose de type 2, qui est un syndrome causé par une mutation perte de fonction du gène NF2 (« Neurofibromin 2 ») et prédisposant aux schwannomes qui sont des tumeurs nerveuses bénignes, 50 % des mutations apparaissent de novo (82) et parmi elles selon une étude récente, 22 % sont à l’état de mosaïque (83). Enfin, concernant le gène RB1 (« retinoblastoma 1 »), dont les mutations perte de fonction à l’état hétérozygote prédisposent chez l’enfant jeune au rétinoblastome, une tumeur maligne de la rétine, de nombreux cas de mutations de novo ont été rapportés. La fraction d’évènements postzygotiques parmi les cas sporadiques de rétinoblastome a été évalué à 15 % (84). Le point commun de ces gènes est leur pénétrance importante, sauf pour le gène RB1 pour lequel quelques rares mutations sont moins pénétrantes. De plus, ces trois syndromes de prédispositions se manifestent par des pathologies spécifiques et facilement diagnosticables sans risque de phénocopie. Ainsi, les mosaïques sont parfois diagnostiquées avant même le séquençage du gène comme le cas de la neurofibromatose segmentaire de type 1.
Néomutations dans les gènes impliqués dans le syndrome de prédisposition au cancer du sein et de l’ovaire.
Mutations de novo et néomutations postzygotiques de BRCA1 et BRCA2
Depuis la découverte des gènes BRCA1 et BRCA2 dans le milieu des années 90, des milliers de mutations ont été rapportées pour ces gènes, mais la grande majorité des cas concerne des mutations héritées. Seuls des cas exceptionnels de mutations de novo ont été décrits. En effet, 9 cas de mutations de novo du gène BRCA1 ont été rapportés dans la littérature et 6 cas de mutations de novo du gène BRCA2 (85).
Lisa Golmard et al. ont déterminé les taux de mutations de novo des gènes BRCA1 et BRCA2 sur 12805 patientes non apparentées ayant présenté un cancer du sein et/ou de l’ovaire. Ainsi, sur les 1527 patientes porteuses d’une mutation BRCA1 ou BRCA2 (12 %), seules 3 patientes présentaient une mutation de novo du gène BRCA1 dont un cas en mosaïque et une patiente présentait une mutation de novo du gène BRCA2 soit des taux de mutation de novo calculés de 0,4 % (0,1 % ; 1,1 %) pour le gène BRCA1 et de 0,1% (0,02 % ; 0,8 %) pour le gène BRCA2 (85). Ce taux était probablement légèrement sous-estimé car l’ensemble des parents n’avaient pas pu être séquencés. Cependant, dans la plupart des cas, un apparenté porteur de la mutation permettait de confirmer son caractère hérité. De manière intéressante, un des facteurs majeurs pouvant expliquer un taux élevé de mutation de novo pour un gène est dû à l’effet péjoratif que la mutation délétère de ce gène entraine sur la santé du sujet (86) et en particulier sur la fertilité. Ainsi, plusieurs études ont montré que les mutations BRCA1 et BRCA2 n’entrainaient pas de diminution de la fertilité (87) mais au contraire pourraient accroitre cette dernière (88). Concernant les mosaïques constitutionnelles, seuls trois cas de mosaïques BRCA1 ont été rapportées dans la littérature. Il s’agissait dans tous les cas de femmes ayant présenté un cancer du sein (89) (90) (85). Aucun cas de mutation constitutionnelle en mosaïque du gène BRCA2 n’a été rapporté.
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Table des matières
INTRODUCTION
I. Le cancer du sein et de l’ovaire
Le cancer du sein
a. Données épidémiologiques
b. Diagnostic et marqueurs pronostiques
c. Prise en charge
Le cancer de l’ovaire
a. Données épidémiologiques
b. Diagnostic et histologie
c. Prise en charge
Cancer évocateur ou non d’une prédisposition héréditaire
II. Indication à la recherche d’une prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire
Organisation de la consultation d’oncogénétique
Les critères d’indication de recherche de prédisposition au cancer du sein et de l’ovaire
III. Modèle de transmission de la prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire et gènes utiles au diagnostic
Description générale des mécanismes de transmission de la prédisposition et d’apparition du cancer
IV. Détection des individus à risque génétique et prise en charge spécifique
V. Diagnostic moléculaire chez les cas index : Le séquençage à haut débit
Historique des techniques antérieures
Le principe du séquençage à haut débit : exemple de la technique Illumina
Le traitement des données par analyse bioinformatique
Les défis de l’interprétation des variants par NGS
La détection et l’interprétation des variants présentant des VAF faible
VI. Les néomutations
Rappels de principes généraux : mutations héritées / mutations de novo / mosaïques
Les néomutations constitutionnelles en pathologie humaine
Néomutations dans les gènes impliqués dans le syndrome de prédisposition au cancer du sein et de l’ovaire
a. Mutations de novo et néomutations postzygotiques de BRCA1 et BRCA2
b. Mutations de novo et mosaïques constitutionnelles du gène TP53
c. Mutations de novo et mosaïques constitutionnelles du gène PTEN
d. Les autres gènes du panel
VII. NGS et mutation somatique acquise : sources d’un diagnostic différentiel difficile
Les mutations tumorales
a. Mutations somatiques tumorales testées dans le cancer du sein et de l’ovaire
b. Définition de l’ADN tumoral circulant
c. Techniques de détection de l’ADN tumoral circulant
d. Applications en cancérologie
L’hématopoïèse clonale
a. Définition de l’hématopoïèse clonale
b. Recommandations en termes de diagnostic et de suivi
VIII. Objectifs de la thèse
PATIENTS ET METHODE
Population étudiée
Recherche de variant constitutionnel par séquençage à haut débit
Sélection des variants à partir des données de séquençage
Analyse par séquençage à haut débit des blocs tumoraux
Détermination de la taille des ADN extraits et purification des ADN des hauts poids et bas poids moléculaire
Analyse Sanger
Technique Snapshot
Analyse statistique
RESULTATS
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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