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Caractères bactériologiques
Caractères morphologiques [1, 13, 26]
Les staphylocoques se présentent sous forme de cocci à Gram positif qui mesurent entre 0,5 et 1,2 μm, groupés en petits amas, en diplocoques ou en très courtes chaînettes.
Le mode de groupement en amas (plus caractéristique après culture sur milieu gélosé) s’explique par le mode de division cellulaire des staphylocoques. Ils sont immobiles, non sporulés, généralement non capsulés.
Caractères culturaux
Les staphylocoques sont des bactéries aéro-anaérobie facultatives. La culture peut être obtenue sur milieux ordinaires mais aussi, sur milieu Chapman à 7,5% de NaCl.
La température de croissance est comprise entre 30°C et 45°C avec un optimum à 37°C. Le pH varie entre 4,8 à 9,4 avec un optimum de 7,5 [10].
En bouillon ordinaire, la culture est rapide et les staphylocoques se multiplient en quelques heures, formant un trouble homogène ou un dépôt [13].
Sur gélose, les colonies de staphylocoque sont arrondies, mesurant 1 à 2 mm de diamètre, humides, opaques, luisantes et crémeuses, à surface lisse et brillante et aux bords réguliers. Toutes les espèces produisent un pigment insoluble dans l’eau dont la couleur peut varier de la blanche porcelaine (S. epidermidis) au jaune doré (S. aureus) [1, 13].
En milieu gélosé au sang, on peut observer une zone claire dite d’hémolyse bêta autour des colonies, due aux hémolysines produites par certaines espèces de staphylocoque, en particulier S. aureus [8, 13].
Caractères biochimiques [8, 13, 26]
Les staphylocoques sont catalase positive et sont dépourvues d’oxydase en dehors de S. lentus, S. sciuri et S. caseolyticus. Elles possèdent une enzyme (coagulase) coagulant le plasma qui permet l’identification de 99 % des souches de S. aureus.
S. aureus est habituellement capable de fermenter le mannitol, et possède une DNAse thermostable, qui est une enzyme non toxique. Elle est un facteur de destruction des noyaux cellulaires, cette DNAse est spécifique de S. aureus. Les staphylocoques possèdent également une uréase, d’une acétoïne, de décarboxylase, de la β-galactosidase et du nitrate réductase.
Caractères antigéniques [1, 18]
Il existe trois groupes d’antigènes somatiques chez S. aureus :
– Les antigènes pariétaux caractéristiques de l’espèce (le peptidoglycane, la protéine A et les acides téichoïques) ;
– Les antigènes pariétaux de type ;
– Les antigènes de surface.
Les antigènes pariétaux
– Le peptidoglycane
Le peptidoglycane est constitué d’un enchaînement linéaire de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique. Il possède une activité adjuvante et mitogène sur les lymphocytes B et pourrait induire les cellules immunosuppressives. Il est reconnu comme étant responsable d’effets toxiques semblables à ceux observés avec l’endotoxine.
– La protéine A
Elle est une holoprotéine élaborée par 90 % des souches de S. aureus d’origine humaine, mais également par toutes les souches coagulase négative possédant une thermonucléase.
Sa structure est subdivisée en deux régions fonctionnellement distinctes dont la région N-terminale qui se fixe sur les IgG au niveau de leur fraction Fc. Cette propriété lui permet d’interférer avec le système immunitaire, ce qui explique son utilisation en thérapeutique pour réduire le taux des complexes immuns circulants.
Elle active le complément, déclenche la réaction inflammatoire et induit l’hypersensibilité retardée et immédiate. Elle est mitogène et cytotoxique.
– Les acides teichoïques
Ce sont des polymères linéaires de ribitol ou de glycérol, unis par des liaisons phosphodiesters et substitués. Les acides glycérols teichoïques sont retrouvés chez tous les staphylocoques à l’exception de S. aureus et S. saprophyticus chez lesquels on retrouve l’acide ribitol teichoïque.
Les antigènes pariétaux de type
Toutes les souches de staphylocoque possèdent des antigènes pariétaux de type ; ce sont ces antigènes qui sont recherchés lors des réactions d’agglutination.
Les antigènes de surface ou antigènes capsulaires
Les souches de S. aureus peuvent posséder soit une vraie capsule, soit une pseudocapsule ou microcapsule. La capsule vraie, visible en microscopie optique après coloration négative par l’encre de Chine est retrouvée chez certaines souches.
La pseudocapsule qui est une fine couche polysaccharidique externe dénommée « Slime » n’est pas visible en microscopie optique. Il s’agit d’une substance amorphe entourant la bactérie, lui conférant une propriété d’adhésion aux surfaces extérieures. Elle se distingue de la capsule tant sur le plan morphologique que sur le plan chimique.
Cette capsule lorsqu’elle est présente peut empêcher la phagocytose.
Substances élaborées
Les staphylocoques, particulièrement S. aureus produisent une grande variété de protéines antigéniques dans le milieu extra cellulaire. Ces protéines sont douées soit d’une activité toxique, soit d’une activité enzymatique et contribuent à la pathogénicité des staphylocoques.
Enzymes staphylococciques [7, 15]
– Coagulase libre
C’est une exo-enzyme provoquant la coagulation du plasma de l’homme ou de lapin prélevé sur tube contenant du citrate, d’oxalate, d’héparine ou d’EDTA. L’action de cette coagulase est indépendante du calcium et du fibrinogène mais nécessite la présence d’un facteur appelé « coagulase-reacting-factor » qui est une globuline voisine de la prothrombine.
La coagulase libre est produite par S. aureus, mais également par d’autres espèces (S. intermedius, S. hyicus, S. delphini et S. schleiferi).
– Coagulase liée ou « clumping factor »
C’est une enzyme fixée à la surface des germes. Elle se lie au fibrinogène et est responsable de l’agrégation sur lame des staphylocoques en présence de sérum.
Ce facteur d’affinité pour le fibrinogène peut être mis en évidence par contact de la souche à étudier avec des hématies de mouton ou des particules de latex recouvertes de fibrinogène. Une agglutination apparaissant en quelques secondes, est trouvée chez 98 % des souches de S. aureus.
Ce clumping factor ne dégrade pas le fibrinogène en fibrine. Cependant, ce test peut être positif pour certaines espèces de staphylocoque coagulase négative (S. lugdunensis et S. schleiferi).
– La fibrinolysine ou staphylokinase
Substance thermolabile et antigénique, la fibrinolysine métabolise le plasminogène en plasmine. Elle provoque la dislocation des caillots et pourrait jouer un rôle dans la formation d’emboles septiques.
– Autres enzymes
D’autres enzymes sont aussi produites par les staphylocoques : lipases, estérases, phosphatases, protéases, hyaluronidase, nucléase, lysozyme, β-lactamase.
Caractères bactériologiques
Caractères morphologiques
Ce sont des cocci à Gram positif, d’aspect ovoïde en diplocoques ou en courtes chaînettes, acapsulés et immobiles [25].
Caractères culturaux
Milieux de culture [1]
Ce sont des bactéries non exigeantes qui peuvent pousser sur des géloses ordinaires. Leur culture est plus aisée et plus abondante que celle des streptocoques.
Elles présentent un trouble en bouillon et des colonies légèrement opalescentes de plus ou moins 1,5 mm sur gélose.
Sur gélose au sang, les colonies peuvent être non hémolytiques ou alpha-hémolytiques.
Sur milieu bile-esculine, les entérocoques se développent en hydrolysant l’esculine (halo noir). Leur croissance est possible dans des conditions hostiles (NaCl 6,5 % ; bile ; 45°C).
Des milieux sélectifs contenant des antibiotiques (acide nalidixique ou colistine) permettent d’isoler les entérocoques dans un échantillon polymicrobien.
Conditions de culture [14, 19]
E. faecalis se comporte en culture comme une bactérie aéro-anaérobie facultative et tolère l’oxygène. L’eau oxygénée, produite lors du métabolisme respiratoire est nuisible pour cette espèce dépourvue de catalase.
E. faecalis peut se multiplier à pH = 9,6 et à des températures comprises entre 10°C à 45°C et résister à un chauffage à 60°C durant 30 minutes.
Pouvoir pathogène [10, 25]
Les infections à entérocoque occupent une place très importante dans les infections nosocomiales.
E. faecalis et E. faecium sont les espèces les plus fréquemment rencontrées en pathologies humaines et peuvent être à l’origine d’infections chez les patients fragilisés. Ce sont des bactéries pathogènes opportunistes.
Les affections les plus courantes sont :
– les infections urinaires et les abcès abdominaux où on les retrouve seules ou en association avec les colibacilles ;
– les péritonites ;
– les infections secondaires des plaies chirurgicales surtout abdominales responsables d’abcès ;
– les endocardites lentes ou subaiguës (5 à 10 % surtout chez l’homme âgé) pouvant entraîner des bactériémies et des septicémies.
Classification [4, 13, 22]
Les β-lactamines
Leur structure chimique comprend un cycle β-lactame responsable de l’activité antibactérienne. On distingue 4 familles principales : les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes. Elles bloquent la synthèse du peptidoglycane, qui est un constituant de la paroi des bactéries.
– Les pénicillines Elles sont constituées d’un cycle bêta-lactame accolé à un cycle thiazolidine. Dans cette sous famille, les groupes les plus importants sont : les pénicillines naturelles (les groupes G et V), les pénicillines du groupe M (exemple : cloxacilline), les aminopénicillines (exemple :
amoxicilline), les carboxypénicillines (exemple : ticarcilline), les acyl-ureidopénicillines (exemple : pipéracilline) et les amidinopénicillines (exemple : pivmécillinam). – Les céphalosporines Elles sont constituées d’un cycle bêta-lactame accolé à un cycle dihydrothiazidique. Elles sont constituées de 5 générations : 1ère génération (exemple : céfalotine), 2ème génération (exemple : céfoxitine), 3ème génération (exemple : céftriaxone), 4ème génération (exemple :
cefpirome) et 5ème génération (exemple : ceftaroline).
– Les monobactames Ils sont caractérisés par une structure monocyclique et la présence d’un groupement sulfonyle.
Le chef de file est l’aztreonam. – Les carbapenèmes
Ce sont des antibiotiques bactéricides à large spectre qui, à la différence des pénicillines, possèdent un atome de carbone au lieu d’un soufre en position 1, et une liaison insaturée en C2-C3. Elles comprennent actuellement 4 molécules : imipénème, méropénème, doripénème et ertapénème. II.2.2. Les aminosides Ce sont des antibiotiques bactéricides à large spectre possédant une structure aminoglycosidique. Les aminosides inhibent la synthèse protéique des bactéries en se fixant sur la sous-unité 30 S du ribosome. Les aminosides sont divisés en 3 générations : 1ère génération (exemple : kanamycine), 2ème génération (exemple : amikacine) et 3ème génération (exemple : netilmicine). Figure 4 : Structure chimique des aminosides (http://rover.ebay.com/rover).
Macrolides, lincosamides et streptogramines (MLS)
Les macrolides (exemple : érythromycine), les lincosamides (exemple : lincomycine) et synergistines (exemple : pristinamycine) ont un spectre limité comprenant les bactéries à Gram positif, les cocci à Gram négatif, les mycoplasmes et les bacilles à Gram négatif anaérobies. Ils inhibent la synthèse protéique en se fixant sur la sous-unité 50 S du ribosome.
Les cyclines
Les principales molécules sont : la tétracycline, la minocycline et la doxycycline. Elles inhibent la synthèse protéique en se fixant sur la sous-unité 30s. Les cyclines ont une activité bactériostatique à large spectre.
Matériel pour le réisolement
Boîtes de Pétri
Anse de platine
Four à micro-onde
Etuve bactériologique
Matériel pour la conservation
Tubes nunc
Portoirs
Tubes stériles à vis
Congélateur
Matériel pour l’étude de la sensibilité
Antibiotiques en poudre et en disque :
– Pénicilline G
– Amikacine
– Ciprofloxacine
– Tétracycline
– Erythromycine
– Gentamicine
Boîtes de Pétri
Eau physiologique stérile
Contrôle de qualité
Contrôle de stérilité des milieux
Avant leur utilisation, les milieux BMH + glycose, BMH + pyruvate et BMH + glucose + pyruvate étaient incubés sans inoculum pendant 24 heures à 37°C.
Les milieux étaient considérés comme stériles en absence de virage du rouge de phénol (indicateur coloré).
Contrôle d’efficacité des milieux
Ce contrôle était réalisé sur chaque lot de bouillon MH préparé. Une souche de référence était ensemencée sur du bouillon MH incubé à 37°C pendant 24 heures. Ainsi, pour chaque microplaque, deux cupules témoins contrôles (TC) étaient utilisées en absence d’antibiotique dont l’un contient 100 μl de l’inoculum et l’autre 100 μl du bouillon nutritif. Les milieux étaient considérés comme efficaces en cas de changement de coloration.
Contrôle du pH
Le pH de chaque milieu préparé était vérifié à l’aide d’un pH-mètre et devait être compris entre 7,4 ± 0,2.
Détermination de la sensibilité par ABG standard
Un inoculum a été préparé à partir d’une culture pure de 18 h à 24 h, dans 2 ml d’eau physiologique pour chaque souche testée. Cette suspension était ajustée à 0,5 Mac Farland à l’aide d’un densitomètre.
L’ensemencement était réalisé par écouvillonnage (méthode de Kirby Bauer). Les boites étaient ensuite séchées à température ambiante pendant 15 mn.
Les disques d’antibiotique étaient déposés à l’aide d’un distributeur de disques.
Les boites étaient ensuite incubées à 37°C à l’étuve pendant 18 à 24 h, pour mesurer ensuite les diamètres d’inhibition. L’interprétation des diamètres a été réalisée suivant les règles édictées par le CA-SFM (version 2016).
Macrométhode d’étude in vitro de la sensibilité
Cette méthode permettait d’observer les profils de sensibilité des souches au plan macroscopique. La macrométhode avait permis de tester les trois milieux de BMH dans le but de valider le milieu d’étude sur les microplaques.
Pour chaque souche, 1 ml de bouillon Mueller-Hinton et 100 μl de l’inoculum bactérien (1,5 McF pour E. faecalis et de 4 McF pour S. aureus) étaient distribués dans 2 tubes secs de concentrations critiques supérieure et inférieure de l’antibiotique à tester.
Les tubes étaient ensuite incubés dans l’étuve à 37°C. Un changement de l’indicateur coloré correspondant à une croissance bactérienne était recherché chaque 2 heures pendant une durée de 6 heures.
Discussions
L’objectif de notre travail était d’étudier la faisabilité de la réduction du délai de lecture de la détermination de la sensibilité aux antibiotiques de S. aureus et E. faecalis sur microplaques CSB®.
Notre étude portait uniquement sur 2 souches de référence (S. aureus ATCC 29213 et E. faecalis ATCC 29212), constituant ainsi un faible échantillonnage.
Notre choix pour le bouillon MH supplémenté en ions (Ca2+ et Mg2+) pour mener cette étude reposait sur des recommandations faites par différents auteurs [2, 12], dans le cadre de la détermination de la sensibilité aux antibiotiques en milieu liquide. Cette méthode utilisait un indicateur coloré (le rouge de phénol) pour détecter la croissance des bactéries assimilant le glucose contenu dans les cupules des microplaques, en présence d’une CCS et d’une CCI de chaque antibiotique à tester.
La préparation de l’inoculum bactérien constituait une étape importante dans l’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Le choix de standardiser la concentration finale de l’inoculum était impératif comme l’a montré une étude antérieure [21]. En effet, il y a une variation importante de la sensibilité en fonction de l’inoculum.
Une gamme de dilution de la suspension bactérienne (0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2.5 ; 3 ; 3,5 et 4 McF) a été préparée avant d’être diluée au 10ème à l’aide du BMH à tester pour obtenir l’inoculum final. Pour cette étude, des inocula de très forte densité (1,5 McF pour E. faecalis ATCC 29212 et 4 McF pour S. aureus ATCC 29212) ont été retenus pour obtenir des résultats fiables. En effet, une suspension de densité plus faible ne permettait pas une lecture des microplaques après 6 h d’incubation lors de notre étude.
L’effet inoculum avait fait l’objet de plusieurs études antérieures [5, 26].
Les antibiotiques étaient choisis selon les recommandations de CA-SFM/EUCAST (2016).
L’utilisation du glucose et/ou du pyruvate par les micro-organismes conduit à la production d’acide lactique qui peut être mise en évidence par l’indicateur coloré. Ainsi, la croissance bactérienne est décelée grâce au virage de l’indicateur coloré du rouge au jaune. La zone de virage du rouge de phénol doit correspondre aux variations de pH du milieu compris entre 6,8 et 8,4.
L’assimilation du glucose par les bactéries étudiées (S. aureus et E. faecalis) passe d’abord par la glycolyse avec production du pyruvate. Ainsi, pour l’optimisation des microplaques, nous avions étudié trois milieux de culture distincts : BMH + glucose ; BMH + pyruvate et BMH + glucose + pyruvate.
Les résultats obtenus avec la macrométhode ont montré que seul le milieu BMH + glucose permettait de déterminer le profil de sensibilité aux antibiotiques des souches étudiées, après 6 h d’incubation.
Par contre, aucune lecture n’était possible, avec le milieu BMH + pyruvate après 6 h d’incubation pour les 2 souches étudiées. L’utilisation du milieu BMH + glucose + pyruvate ne permettait pas également, la détermination du profil de sensibilité aux antibiotiques, après 6 h d’incubation.
Ceci pourrait s’expliquer par la non assimilation du pyruvate par les bactéries testées, retrouvé dans ces deux milieux de culture. L’absence de virage sur le milieu BMH + glucose + pyruvate, après 6 h d’incubation pourrait s’expliquer par la faible quantité de glucose, qui était inférieur au seuil de détection de la croissance bactérienne. En effet, un milieu contenant une faible quantité de glucose ne permettait pas de déterminer le profil de sensibilité aux antibiotiques des souches testées, après 6 h d’incubation.
C’est la raison pour laquelle, nous avons utilisé le milieu BMH + glucose, pour étudier la faisabilité de la réduction du délai de lecture du profil de sensibilité aux antibiotiques des souches de S. aureus et E. faecalis, après 6 h d’incubation sur microplaques-CSB®.
La microméthode d’étude de la sensibilité a été validée par deux études antérieures, avec des durées d’incubation qui étaient respectivement de 16 h et de 8 h [6, 17].
En 1985, Robert et al avaient montré une concordance de 96 à 99 % entre les tests de sensibilité par méthode de diffusion des disques d’antibiotiques sur gélose et ceux effectués sur microplaques sur des souches de staphylocoques [24]. En 1986, il a été découvert un nouveau système de lecture rapide (ATB rapide) mais automatisé permettant de déterminer le profil de sensibilité des bactéries au bout de 4 à 5 heures d’incubation à 37°C [23].
Les résultats obtenus durant notre étude sur les microplaques étaient comparables à ceux observés par la macrométhode sur le milieu BMH + glucose.
Après 4 heures d’incubation, aucune lecture n’était possible, même pour les témoins. Ce qui correspondait à la « phase de latence » où la croissance bactérienne était nulle, il y avait une adaptation enzymatique des bactéries à l’environnement.
Après 6 heures d’incubation des microplaques, nous avons obtenu le profil de sensibilité aux antibiotiques de la souche S. aureus ATCC 29213 testée sur milieu BMH + glucose. Cette dernière était sensible à tous les antibiotiques étudiés. Elle présentait une excellente corrélation vis-à-vis des résultats obtenus avec l’antibiogramme standard. Cependant, la p-value n’avait pas pu être déterminée, car la souche était sensible aux différents antibiotiques testés (souche sauvage). Pour déterminer cette valeur (p-value), il est préférable de tester une souche présentant des profils de sensibilité variables aux différents antibiotiques testés (sensible, résistant et intermédiaire).
La souche E. faecalis ATCC 29212 présentait une bonne corrélation des résultats obtenus avec les deux techniques (microméthode et antibiogramme standard), avec p-value = 0,016.
Une étude avait montré que le profil de sensibilité des Cocci à Gram positif pouvait être déterminé sur des microplaques contenant du bouillon AM3 (Antibiotic Medium 3) après 8 h d’incubation [6]. Les microplaques présentent néanmoins des limites, seules les bactéries non exigeantes et à croissance rapide peuvent être étudiées par cette méthode. De plus, le nombre d’antibiotiques à tester est limité par le nombre de cupules présentes dans la microplaque. En effet, pour chaque antibiotique, il faut deux cupules (CCS et CCI).
Malgré ces limites, les microplaques présentent néanmoins des avantages. Leur coût est peu élevé. Elles nécessitent de petites quantités de réactifs. Enfin, la lecture des résultats est facile à l’oeil nu, avec une interprétation directe des résultats.
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Table des matières
Première partie : Revue bibliographique
I Généralités sur les cocci à Gram positif
I 1 Les staphylocoques
I 1 1 Historique
I 1 2 Taxonomie
I 1 3 Habitat
I 1 4 Caractères bactériologiques
I 1 4 1 Caractères morphologiques
I 1 4 2 Caractères culturaux
I 1 4 3 Caractères biochimiques
I 1 4 4 Caractères antigéniques
I 1 5 Substances élaborées
I 1 5 1 Enzymes staphylococciques
I 1 5 2 Toxines staphylococciques
I 1 6 Pouvoir pathogène
I 2 Les entérocoques
I 2 1 Historique
I 2 2 Taxonomie
I 2 3 Habitat
I 2 4 Caractères bactériologiques
I 2 4 1 Caractères morphologiques
I 2 4 2 Caractères culturaux
I 2 4 3 Caractères biochimiques
I 2 4 4 Caractères antigéniques
I 2 5 Pouvoir pathogène
II Rappels sur les antibiotiques
II 1 Définition
II 2 Classification
II 2 1 Les β-lactamines
II 2 2 Les aminosides
II 2 3 Macrolides, Lincosamides et Streptogramines (MLS)
II 2 4 Les cyclines
II 2 5 Les phénicolés
II 2 6 Les quinolones
II 2 7 Les polypeptides
II 2 8 Les sulfamides
II 2 9 Les glycopeptides
Deuxième partie : Travail expérimental
I Objectif de l’étude
II Cadre d’étude
III Souches bactériennes étudiées
IV Matériel
IV 1 Matériel pour le réisolement
IV 2 Matériel pour la conservation
IV 3 Matériel pour l’étude de la sensibilité
IV 4 Milieux de culture et réactifs
V Méthodologie
V 1 Préparation des milieux de culture
V 2 Préparation des microplaques
V 3 Contrôle de qualité
V 4 Détermination de la sensibilité par antibiogramme standard
V 5 Macrométhode d’étude in vitro de la sensibilité
V 6 Microméthode d’étude in vitro de la sensibilité
V 7 Validation de la méthode
VI Résultats
VI 1 Profils de sensibilité de Staphylococcus aureus
VI 1 1 Résultats obtenus avec l’ABG standard
VI 1 2 Résultats obtenus avec la macrométhode
VI 1 3 Résultats obtenus sur microplaques CSB ®
VI 2 Profils de sensibilité d’Enterococcus faecalis
VI 2 1 Résultats obtenus avec la méthode d’antibiogramme standard
VI 2 2 Résultats obtenus avec la macrométhode
VI 2 3 Résultats obtenus sur microplaques CSB ®
VI 3 Corrélation entre la microméthode et la méthode standard
VII Discussion
Conclusion
Références bibliographiques
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