Detections d’interactions biologiques par imagerie de resonance plasmonique de surface

Au cours de cette introduction, seront présentées les techniques utilisées au cours de ce travail de recherche. Ainsi, dans un premier temps, le procédé général de production des biopuces au laboratoire est décrit. Ensuite, seront abordées les méthodes physiques de lecture de ces dernières.

Conception des biopuces

Un biocapteur se définit comme un support fonctionnel capable de détecter un ou plusieurs types des substances biologiques. Les biopuces correspondent quant à elles à une version miniaturisée d’une multitude de biocapteurs individualisés sur un support commun, autorisant ainsi la détection simultanée de plusieurs analytes ; c’est qu’on appelle communément la notion de détection multiparamétrique. Au laboratoire, les biopuces fabriquées sont obtenues grâce à la chimie du polypyrrole, un polymère conducteur ?-conjugué obtenu par électrosynthèse ou simple oxydation chimique.

Propriétés du pyrrole

Le pyrrole est un hétérocycle azoté hydrosoluble oxydable et capable de polymériser facilement dans l’eau à pH neutre lorsqu’un potentiel supérieur à + 0,7 V / ECS est appliqué à l’électrode de travail [1] ; le mécanisme radicalaire de polymérisation du pyrrole . Au cours de leur élongation, les oligomères de pyrrole deviennent de plus en plus insolubles jusqu’à précipiter à l’électrode de travail. L’accrochage du polymère à la surface est alors relativement puissant puisqu’il résiste à l’action de détergents, d’acides ou de bases. De plus, lors de la réaction d’électropolymérisation, l’anion du sel support, c’est-à-dire l’anion servant de conducteur de charge dans la solution entre les électrodes, vient s’insérer dans la matrice de polymère pour contrecarrer les charges positives naissantes . Au laboratoire, les anions classiquement employés dans le milieu de polymérisation sont le Clainsi que le couple H2PO₄⁻ / HPO₄²⁻ . La concentration minimale en pyrrole nécessaire pour obtenir un dépôt de polymère est de 20 mM.

Dans l’optique de fabriquer un biocapteur, une entité biologique ou chimique appelée « sonde » doit être incorporée dans ce film de polymère. Pour se faire, il s’agit de munir cette sonde d’un noyau pyrrole à l’une de ses extrémités. Au laboratoire, le pyrrole est donc modifié au niveau de l’hétéroatome d’azote pour accueillir ladite sonde, ce qui ne modifie que de manière négligeable le potentiel d’oxydation du pyrrole ainsi fonctionnalisé . Afin de rendre davantage accessible la sonde pour son partenaire biologique, un « bras espaceur » est inséré entre l’unité pyrrole et ladite sonde ; après électropolymérisation, ce bras permet d’écarter et de fournir un meilleur degré de liberté de déplacement à la sonde vis-à-vis de la surface de polymère.

Ces composés n’étant pas disponibles commercialement, différentes stratégies de couplage entre le pyrrole-bras espaceur et la sonde ont été mises au point au laboratoire [3]. Ainsi, selon ce principe, plusieurs catégories de sondes d’intérêt biologique ont été modifiées : les oligodésoxyribonucléotides ou ODNs  [4], les peptides [5], les oligosaccharides [6] et les protéines .

Ainsi, en contrôlant le rapport de concentration pyrrole-sonde / pyrrole dans le milieu à polymériser, il est possible de gérer la densité de sonde immobilisée à la surface de l’électrode. Classiquement, ce rapport est de 1 pour 2 000 pour la production de puces à ADN. Or, celui-ci peut différer suivant le type de sonde envisagée .

Electrospotting

Comme indiqué précédemment, l’application d’un potentiel supérieur à + 0,7 V / ECS induit la polymérisation du pyrrole en milieu aqueux à l’électrode de travail. Différentes méthodes électrochimiques peuvent être employées pour engager ce processus : la voltamétrie cyclique, la chronoampérométrie, la chronopotentiométrie,… Au laboratoire, une méthode électrochimique dérivée de la chronoampérométrie a été mise au point : l’électrospotting. A la différence des montages classiques, compte-tenu de la miniaturisation importante de la cellule électrochimique où se tient la réaction, le montage ne contient pas d’électrode de référence. Concrètement, pour obtenir la polymérisation du pyrrole, l’application séquentielle de deux voltages entre la contre-électrode en platine et l’électrode de travail en or a été fixée . Dans un premier temps, le potentiostat délivre une tension de + 0,4 V, tension pour laquelle le courant est nul dans le milieu de polymérisation. Ensuite, une impulsion de + 2,4 V est appliquée durant un temps bien défini, variant généralement entre 50 ms et 500 ms ; c’est durant cette phase que le potentiel de polymérisation du pyrrole est atteint. Enfin, de nouveau une tension de + 0,4 V est appliquée pour engager une réduction partielle du film de polymère. L’enregistrement de l’intensité passant dans le système peut être lue en temps réel par le potentiostat ; c’est le chronoampérogramme .

L’avantage de cette technique à potentiel imposé est qu’elle limite la suroxydation du polymère néoformé à l’électrode d’or, ce qui pourrait endommager la structure du film et par conséquent la qualité de son accroche à la surface. D’autre part, elle permet de moduler facilement l’épaisseur des films de polymère qui peuvent avoir des épaisseurs inférieures à 5 nanomètres.

Appareillages

Ce procédé d’immobilisation des sondes sur support étant très rapide – 2 secondes par séquence impulsionnelle – et effectué en une seule étape, l’extension de cette technique pour fabriquer des biopuces a été envisagée au laboratoire. Ainsi, une cellule électrochimique constituée d’un cône de micropipette se déplace successivement aux différentes zones de d’immobilisation de la matrice de plots à former via une interface informatique développée au laboratoire. Le principe d’utilisation est relativement simple ; après avoir chargé le cône de micropipette en mélange pyrrole / pyrrole-sonde à immobiliser, l’embout de celui-ci est amené au contact de la surface dorée (50 nm d’épaisseur). Le circuit électrique étant « fermé », la séquence impulsionnelle est alors délivrée afin que la polymérisation ait lieu, le diamètre de l’embout déterminant la taille de la zone de polymère créée. Dans un dernier temps, la cellule revient à sa position initiale pour être purgée du liquide ayant déjà servi et pour accueillir une nouvelle solution contenant éventuellement une autre sonde. D’autre part, une goutte du liquide reste sur le support à l’endroit où s’est tenue la polymérisation.

Par itérations successives, ce procédé permet d’obtenir rapidement des biopuces comportant respectivement jusqu’à 81 zones (9 x 9) et 36 zones (6 x 6) pour une étude par microscopie de fluorescence et en imagerie SPR. L’étude des interactions entre les sondes immobilisées dans le polymère et les agents biologiques à détecter est effectuée selon plusieurs techniques au laboratoire. Parmi elles figurent une technique dite « avec marqueur » [9], la microscopie de fluorescence et une technique « sans marqueur », l’imagerie SPR.

Détection d’interaction entre sondes et cibles

La microscopie de fluorescence

Principe de la fluorescence

La fluorescence correspond à un phénomène d’émission de lumière par un atome ou une molécule suite à leur irradiation par une onde électromagnétique incidente. Plus précisément, d’un point du vue atomistique, sous l’effet de la lumière, les électrons de ces atomes ou molécules absorbent une quantité d’énergie pour passer d’un état fondamental à un état excité de plus haute énergie . Le niveau d’énergie de chacun des états précités dépendant de l’atome ou de la molécule, la différence d’énergie nécessaire pour effectuer la transition, c’est-à-dire par extension la longueur d’onde d’absorption, est par conséquent une propriété intrinsèque au fluorophore. Dans un deuxième temps, les électrons à l’état excité viennent se placer successivement à des niveaux d’énergie intermédiaires correspondant à des états dégénérés liés aux rotations et vibrations du fluorophore. Dans un dernier temps, les électrons reviennent brutalement à l’état fondamental tout en léguant l’énergie libérée au milieu extérieur sous la forme de photons dont l’énergie, et donc la longueur d’onde, est supérieure à celle initialement absorbée.

En biologie, les fluorophores utilisés font appel soit à des petites molécules chimiques possédant des liaisons ?-conjuguées, la forte délocalisation électronique contribuant à l’absorption, soit à des protéines connues pour leurs propriétés fluorescentes. Parmi les fluorophores chimiques, figurent par exemple la fluorescéine, les composés de la série Cy, les Alexa, etc. Pour les fluorophores protéiques, les plus connus sont les dérivés de la Green Fluorescent Protein (GFP) pour qui l’ingénierie moléculaire a parmi d’établir une large gamme de spectre d’absorption / émission, et la R-phycoérythrine. Au laboratoire, de par sa grande taille limitant les phénomènes de « quenching » du support doré, c’est sur cette dernière molécule que reposent les essais de révélation par microscopie de fluorescence.

Application aux biopuces à ADN

Historiquement, le premier protocole de révélation des biopuces à ADN a reposé sur le principe . Concrètement, le support fonctionnalisé réagit dans un premier temps avec un oligonucléotide biotinylé à son extrémité 5’. Après hybridation avec la séquence sonde complémentaire immobilisée, la protéine de fusion streptavidine / R- phycoérythrine va reconnaître spécifiquement via sa partie streptavidine les emplacements où se trouvent la biotine. Le support peut alors être disposé dans un microscope par épifluorescence où le signal fluorescent est recueilli suite à l’illumination par une lampe au mercure.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
1. Conception de puces
1.1. Propriétés du pyrrole
1.2. Electrospotting
1.3. Appareillages
2. Détection d’interactions entre sonde et cible
2.1. La microscopie de fluorescence
2.1.1. Principe physico-chimique
2.1.2. Application aux puces à ADN
2.1.3. Limites de la technique
2.2. La résonance de plasmons de surface (SPR)
2.2.1. Principe de la résonance de plasmons de surface
2.2.2. L’imagerie SPR
2.2.3. Applications déjà mises au point
PARTIE I : DES PUCES POUR LE CRIBLAGE PHARMACEUTIQUE
I. CONTEXTE SCIENTIFIQUE
1. L’antibiothérapie
1.1. Rappels historiques
1.2. Les cibles pharmacologiques
1.2.1. L’homéostasie des folates
1.2.2. L’ADN bactérien
1.2.3. L’ARN polymérase bactérienne
1.2.4. Le ribosome
1.2.5. La membrane plasmique
1.2.6. La synthèse du peptidoglycane
1.3. Les problèmes de résistance
1.3.1. Les différents mécanismes
1.3.2. Conséquences cliniques
2. A la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques
2.1. La chimie combinatoire
2.1.1. Synthèse en mélange
2.1.2. Synthèse en parallèle
2.2. Les méthodes de criblage in vitro
2.2.1. Tests par mise en culture
2.2.2. Tests moléculaires
3. Les puces à petits ligands
3.1. Les chimies de greffage existantes
3.1.1. Synthèse in situ
3.1.2. Adressage non covalent
3.1.3. Adressage covalent par chimie « classique »
3.1.4. Adressage covalent par photochimie
3.2. Les systèmes de détection
3.2.1. La microscopie de fluorescence
3.2.2. La résonance de plasmon de surface
4. Cribler des chimiothèques par imagerie SPR
4.1. Choix de la cible pharmacologique
4.1.1. L’ARN polymérase II bactérienne
4.1.2. Les systèmes biologiques de régulation
4.1.3. Les molécules actives
4.2. Description de la chimiothèque
4.2.1. Les 2,5-dicétopipérazines
4.2.2. Les quinazoline-2,4-diones
4.3. La criblage biologique par imagerie SPR
4.3.1. Application des principes de la SPR
4.3.2. La stratégie d’immobilisation
4.3.3. Les tests d’interaction par SPRi
II. DEVELOPPEMENT D’UNE PUCE A PETITS LIGANDS
1. Etude de systèmes « modèles » de petits ligands
1.1. Etude initiale de faisabilité
1.1.1. Validation par microscopie de fluorescence
1.1.2. Validation par imagerie SPR
1.2. Choix du bras espaceur pour la chimiothèque
1.2.1. Série n°1
1.2.2. Série n°2
1.2.3. Bilan des essais
1.3. Formulation d’un nouveau milieu de polymérisation
1.3.1. Critères chimiques
1.3.2. Critères physiques
1.3.3. Les sondes utilisées
1.3.4. Influence des solvants organiques
1.3.5. Incorporation d’additif
1.3.6. Sels supports
1.3.7. Validation finale par SPRi
1.4. Densification des puces
1.4.1. Problèmes posés
1.4.2. Fonctionnalisation par alcane-thiols
1.4.3. Limites de la cellule électrochimique en cône
1.4.4. L’automate à aiguilles
1.4.5. Procédés en cours de développement
1.5. Etude finale de faisabilité
1.5.1. Comparatif de sensibilité
1.5.2. Essais de dosage de la cible
1.5.3. Essais de dosage de la sonde
2. Etude d’un système connu rifampicine / ARN polymérase
2.1. Validation par SPRi de la cible pharmacologique
2.1.1. L’ARN polymérase « sonde »
2.1.2. L’ARN polymérase « cible »
2.2. Propriétés chimiques de la rifampicine
2.2.1. Structure et dérivés
2.2.2. Stabilité chimique
2.2.3. Réactivité électrochimique
2.3. Caractérisation électrochimique de la rifampicine
2.3.1. Etude préliminaire par voltamétrie cyclique
2.3.2. Etudes voltamétriques sur des analogues structuraux simples
2.3.2. Etudes voltamétriques de la rifamycine SV
2.3.3. Etudes voltamétriques finales de la rifampicine
2.3.4. Approches chronopotentiométriques
2.4. Analyse de l’interaction rifampicine / ARN polymérase par SPRi
2.4.1. Stratégie d’ancrage
2.4.2. Acquisition cinétique
3. Immobilisation et criblage d’une chimiothèque par SPRi
3.1. Immobilisation de la chimiothèque
3.1.1. Synthèse combinatoire
3.1.2. Production et caractérisation de biopuces à « petits ligands»
3.2. Acquisition cinétique par imagerie SPR
3.2.1. Interactions directes
3.2.2. Caractérisation par compétition
3.2.3. Analyse structure / activité
III. EVOLUTION FUTURE DU PROJET
1. A court terme
1.1. Détermination fine de la structure active 115
1.2. Localisation du site de fixation
1.3. Test d’activité en solution
1.4. Autres cibles pharmacologiques
2. A long terme
2.1. Extension de la chimiothèque
2.2. Couplage avec la spectrométrie de masse
PARTIE II : UN OUTIL POUR DETECTER LES TOXINES
I- CONTEXTE SCIENTIFIQUE
1. Le bioterrorisme
1.1. Les agents utilisés à des fins bioterroristes
1.2. Les méthodes et les voies de contamination des populations
1.3. Les instances luttant contre le bioterrorisme
1.4. Les outils préexistants pour la détection de substances nocives
2. La ricine : une protéine toxique
2.1. L’origine biologique
2.2. Le mécanisme d’action
2.2.1. Caractérisation moléculaire
2.2.2. Stratégies de traitement
2.2.3. Utilisation à des fins thérapeutiques
2.3. Les données toxicologiques
2.3.1. Symptomatologie
2.3.2. Toxicocinétique
2.4. Les cas d’intoxication
2.5. La ricine, agent du bioterrorisme
2.6. Les méthodes de détection de la ricine
2.6.1. Avantages des biopuces
2.6.2. Principes analytiques
3. Détecter des traces de toxines par imagerie SPR
3.1. Vers une approche « multitoxines »
3.1.1. Avantages des biopuces
3.1.2. Principes analytiques
3.1.3. Intérêt pratique
3.2. Contraintes associées au projet
3.2.1. Sensibilité et rapidité
3.2.2. La ricine
II- MISE AU POINT D’UNE METHODE ANALYTIQUE POUR LA DETECTION DE LA RICINE
1. Fabrication d’un immunocapteur
1.1. L’anticorps utilisé pour l’immunocapteur
1.2. Le choix des références
1.3. Le milieu expérimental
2. L’imagerie SPR à haute sensibilité
2.1. Faisabilité sous un format de détection « classique »
2.1.1. Réglages optiques pour l’imagerie SPR
2.1.2. Traitement de l’échantillon
2.1.3. Acquisition cinétique
2.1.4. Détermination de la sensibilité
2.2. Mise en place d’un mode « sandwich »
2.2.1. Choix du type d’anticorps secondaire
2.2.2. Acquisition cinétique
2.2.3. Evaluation de la sensibilité
2.3. L’amplification par nanoparticules d’or
2.3.1. Choix du type de nanoparticule
2.3.2. Les nanoparticules saturées à la BSA
2.3.3. Les nanoparticules non saturées à la BSA
2.3.4. Optimisation de la régénération du capteur
2.3.5. Sensibilité finale de la méthode analytique
2.3.6. Mode d’emploi pour l’utilisateur
2.4. Améliorations du procédé de détection
2.4.1. Evolution du procédé de synthèse du capteur
2.4.2. Quantification de l’apport du marqueur SPR
2.4.3. Caractérisation de la cinétique d’amplification par billes d’or
2.4.4. Effets cumulatifs
2.4.5. Effets d’encombrement en surface
2.4.6. Amélioration de la capture de l’échantillon
III- DEVELOPPEMENTS FUTURS
1. Amélioration de la détection de l’analyte
1.1. Le système fluidique
1.2. L’analyte
1.3. Différents types de prélèvements envisagés
2. Autres applications possibles
2.1. Les médicaments & polluants de l’environnement
2.2. Un système embarqué
CONCLUSION
PARTIE EXPERIMENTALE
I- FABRICATION DES PUCES
1. Préparation des solutions d’immobilisation
1.1. Cas des sondes ODN
1.1.1. Milieu de polymérisation « classique »
1.1.2. Nouveau milieu de polymérisation
1.2. Cas des sondes « petits ligands »
1.2.1. Etude initiale de faisabilité
1.2.2. Immobilisation de la rifampicine et de la chimiothèque
1.3. Cas des sondes protéiques
2. Etudes voltamétriques
2.1. Solutions analysées
2.2. Appareillage
2.2.1. Montage à 3 électrodes
2.2.2. Montage à 2 électrodes
3. Electrospotting
3.1. Fonctionnalisation par les alcane-thiols
3.2. Séquences appliquées
3.2.1. Cas général
3.2.2. Cas particulier de la rifampicine
3.3. Automates
3.3.1. Polypotter II
3.3.2. Omnigrid
II- ANALYSE PAR MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE
1. Par type de puce
1.1. Puce à ADN
1.2. Puces à petits ligands
1.2.1. Révélation directe
1.2.2. Révélation indirecte
2. Lecture et analyse des données
III- ANALYSE PAR IMAGERIE SPR
1. Appareillage
1.1. Optique
1.2. Microfluidique
2. Suivi des interactions
1.1. Acquisition des courbes de plasmon
1.2. Acquisition cinétique et traitement des données
3. Analytes
3.1. Préparation
3.2. Injection
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

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