Détection spécifique ultra-sensible et rapide d’espèces chimiques et biochimiques

LA MOLECULE D’ADN

DESCRIPTION GENERALE Il existe deux formes d’acide nucléique : l’acide désoxyribonucléique (ADN) et l’acide ribonucléique (ARN). Ce dernier, moins stable que l’ADN, est utilisé par les cellule pour la synthèse des protéines, et peut intervenir dans le métabolisme cellulaire. L’ARN existe dans certains virus dits virus à ARN [1]. Les molécules d’acides nucléiques sont des molécules présentes dans presque toutes les cellules vivantes. Elles sont essentielles à la vie car elles permettent de coder les informations génétiques. En effet, le génome, c’est-à-dire l’information génétique d’un individu, se trouve codé dans l’ADN et en partie dans l’ARN. Dans les cellules eucaryotes (cellules possédant un noyau), l’information génétique est stockée dans le noyau sous forme de chromosomes, qui présentent une macrostructure composée de protéines histones, de protéines non histones et d’ADN. L’ARN peut présenter trois fonctions principales. Il peut servir en tant qu’ARN messager, en transportant l’information génétique du noyau jusqu’aux ribosomes où sont élaborées les protéines. Il peut jouer le rôle de catalyseur de la biosynthèse des protéines. Enfin, certains ARN sont des régulateurs de l’expression génétique. Un des principes fondamentaux de la biologie moléculaire repose sur le fait que des sections de l’ADN codant l’information génétique sont transcrites en ARN messager par l’intermédiaire d’une enzyme, l’ARN polymérase. L’ARN est ensuite traduit en chaînes polypeptidiques au niveau des ribosomes comme représenté sur la figure 1 .L’ADN se trouve généralement sous forme bicaténaire, c’est-à-dire avec deux brins liés par des liaisons hydrogène. Chaque brin est un polymère linéaire, constitué de la répétition d’un monomère appelé nucléotide composé d’un sucre, le désoxyribose, et d’un phosphate auquel est liée une base azotée. L’ADN comprend quatre bases azotées différentes : l’adénine, la thymine, la guanine et la cytosine, qui sont représentées sur la figure 2. Dans l’ARN la base azotée thymine est remplacée par l’uracile, de structure très proche de celle de la thymine, mais sans groupement méthyle. Cette base est moins stable que la thymine. De même pour l’ARN le polymère est constitué d’unités de répétition à base d’un sucre, le ribose, sur lequel sont attachés un groupement phosphate et un acide nucléique (adénine, guanine, cytosine ou uracile). Nous pouvons voir sur la figure 3 la différence entre le ribose et le désoxyribose, où le groupement hydroxyle sur le deuxième carbone a disparu. Nous pouvons remarquer que les carbones des sucres sont numérotés de 1 à 5.
LA STRUCTURE DE L’ADN Outre les liaisons covalentes liant les sucres aux phosphates et à l’acide nucléique, de nombreuses liaisons non-covalentes entrent en jeu. Ces différentes interactions sont responsables de la structure particulière et de la stabilité de la molécule d’ADN. Les forces d’interaction sont les liaisons hydrogène, les forces ioniques, les forces de Van der Waals et les forces hydrophobes. Nous pouvons observer sur la figure 4 que les sucres voisins sont liés par des liaisons 3’-5’ avec les phosphodiesters, dans lesquels un groupe phosphate est attaché au 3 ème carbone d’un des sucres et au 5 ème carbone du sucre suivant. Ainsi au niveau de la terminaison 5’, la chaîne ADN se termine par un groupement phosphate alors qu’à la terminaison 3’ le carbone est uniquement attaché à un groupement hydroxyle. 5 Les acides nucléiques s’apparient via des liaisons hydrogène, l’adénosine avec la thymine et la cytosine avec la guanine, visibles sur la figure 5. L’asymétrie de la colonne sucre phosphate ainsi que l’appariement spécifique où des bases plus volumineuses s’apparient avec des plus petites sont responsables de la structure en double hélice de l’ADN, représentée sur la figure 6.
LE PHENOMENE D’HYBRIDATION Le phénomène d’hybridation de l’ADN correspond à l’appariement de deux monobrins d’ADN complémentaires, c’est-à-dire tels que la cytosine se retrouve face à la guanine et l’adénine face à la thymine, pour former, par des liaisons non covalentes, une structure stable à double brin d’ADN. L’appariement selon Watson et Crick est réalisé via deux liaisons hydrogène entre la thymine et l’adénine et via trois liaisons hydrogène entre la guanine et la cytosine, ainsi la liaison C-G est plus stable que la liaison A-T. De plus lorsque les paires de bases d’ADN sont arrangées dans un même plan perpendiculaire à l’axe de l’hélice d’ADN, des forces de Van Der Waals entre les bases voisines aident à maintenir la stabilité de la double hélice. Les brins d’ADN ont tous une orientation 5’-> 3’, il est important de noter que lors de l’hybridation, les brins d’ADN doivent être disposés en antiparallèle, c’est-àdire quela direction de l’un des brins d’ADN doit être opposée à celle de son brin complémentaire.
RAPPEL DE QUELQUES DECOUVERTES HISTORIQUES La première détection de l’acide désoxyribonucléique ADN date de 1869, il a été découvert par F. Miescher dans un globule blanc. Il a ensuite fallu encore presque un siècle pour que la structure de l’ADN soit découverte grâce aux travaux de Rosalind Franklin interprétés par J. D. Watson et F. H. Compton Crick. Les premières méthodes de détection des séquences d’ADN ont été mises au point encore plus tard avec l’utilisation de la méthode Southern Blot à partir de 1975 et de la PCR à partir de 1991. Ces deux méthodes sont encore utilisées en biologie de nos jours, cependant elles nécessitent un traitement long en laboratoire, comme toutes les personnes ayant dû attendre le résultat d’un test PCR pour la covid-19 peuvent en attester. D’autres techniques présentées ci-dessous permettent la détection de séquences d’ADN spécifiques.

DEFINITION ET PRINCIPAUX PARAMETRES D’UN CAPTEUR

                  Un transducteur est un dispositif permettant de transformer une grandeur physique, induite par l’interaction entre l’objet « cible » (ce qui doit être détecté) et un système « sonde », en une quantité physique plus facile à quantifier et à traiter. Très souvent, ce transducteur permet de convertir le signal initial en signal électrique. Les capteurs peuvent être classés selon la grandeur physique impliquée dans le processus de reconnaissance de l’objet cible par la sonde : changement de propriétés mécaniques, électriques (courant, tension, résistance), magnétique, thermique, optique (voir plus loin)… Le signal de sortie peut être analogique ou, le plus souvent de nos jours, numérique. Les capteurs sont de plus en plus présents dans la vie de tous les jours, notamment dans le domaine de la santé. Un bon capteur doit être précis avec une forte sensibilité, un temps de réponse court et des résultats reproductibles. De plus, sa fabrication doit-être facile et peu coûteuse pour permettre son utilisation au quotidien. Un biocapteur est à minima un transducteur associé à un bio récepteur, il utilise une réaction biochimique comme moyen de reconnaissance d’une espèce ou d’un phénomène biologique. Les différentes caractéristiques des capteurs sont les suivantes : La gamme de mesure (ou étendue de mesure ou dynamique de mesure) est la valeur absolue de la différence entre les valeurs extrêmes d’un intervalle de mesure pour des spécifications données. Elle correspond à la plage d’entrée de valeurs auxquelles le capteur est utilisable. La résolution ??correspond à la plus petite variation de la grandeur mesurée qui produit une variation perceptible de l’indication délivrée par le capteur, et présentant une forte probabilité de ne pas être du bruit. Nous considérons le bruit comme gaussien, dans ce cas on peut postuler que ?? = 3? où ? est l’écart type. La sensibilité S représente le rapport entre la variation du signal de sortie ∆? et la variation du signal d’entrée ∆?, c’est-à-dire ? =∆?∆?. Elle est souvent définie comme la tangente à la courbe d’étalonnage du capteur à un point donné. La courbe d’étalonnage correspond à la courbe liant la grandeur de sortie à la grandeur d’entrée. On voit qu’il faut utiliser le capteur dans un domaine où sa réponse est linéaire. En effet, en présence d’une grande qualité d’objets-cible, ceux-ci s’associent à tous les récepteurs disponibles, ce qui a pour conséquence d’empêcher une augmentation du signal en présence d’une plus grande quantité de ces objets. C’est le phénomène de saturation. La gamme de mesure est donc nécessairement limitée. La précision d’un capteur correspond à la capacité de celui-ci à fournir une mesure proche de la valeur réelle, c’est-à-dire une mesure minimisant les erreurs. Il existe deux types d’erreurs. Les erreurs systématiques biaisent les valeurs fournies par le capteur, mais sont facilement corrigeables par un étalonnage du capteur prenant en compte les effets des perturbations extérieures (par exemple le changement de température lors de la mesure). En revanche, les erreurs aléatoires, qui peuvent avoir différentes origines, (bruit thermique, bruit de grenaille, bruit du laser, etc.), diminuent les performances du capteur, et peuvent être quantifiées via l’écart-type . La reproductibilité et la répétabilité permettent de dire à quel point un capteur est fiable, la répétabilité mesure la variation des résultats d’une mesure à l’autre dans les mêmes conditions avec le même instrument de mesure, alors que la reproductibilité mesure la variation des résultats de mesure en modifiant une seule condition, par exemple en changeant de transducteur entre deux mesures. La rapidité du capteur ou son temps de réponse correspond à la durée qui s’écoule pour que le système mesure une brusque variation du mesurande. Le temps de réponse du capteur est discriminant dans le choix d’utilisation du capteur.

Capteurs à résonance plasmon de surface

                       Parmi les méthodes les plus couramment utilisées pour mesurer le phénomène d’hybridation de l’ADN figure la méthode dite SPR (« surface plasmon resonance », utilisant la résonance des plasmons de surface. Un plasmon de surface est une onde électromagnétique qui se propage le long de l’interface entre un diélectrique et un métal. Quand la surface étudiée est illuminée par un rayon polarisé TM dans des conditions de réflexion totale, pour un angle d’incidence particulier , la lumière illuminant l’interface peut être couplée vers des modes plasmon de surface, ce qui provoque une diminution notable de la réflectivité de l’interface. L’angle exact  à laquelle la résonance plasmon a lieu est sensible à l’indice de réfraction du milieu immédiatement adjacent à la surface métallique ; en effet la lumière réfléchie à l’interface crée une onde évanescente qui pénètre sur une faible distance dans le milieu diélectrique. Selon la nature du matériau à la surface et sa quantité, la réponse SPR sera différente vu que l’indice de réflexion sera différent [34]. Une configuration typique est la configuration de Kretschmann, représentée sur la figure 11. Pour mesurer la réponse SPR, quatre configurations sont possibles, la mesure d’amplitude à angle d’incidence et longueur d’onde constants, la mesure d’angle, la mesure avec variation de longueur d’onde et enfin la mesure de la variation de la phase. D’autres configurations utilisant les effets plasmoniques ont été proposées. Par exemple, une forte amélioration de la détection de l’hybridation de l’ADN par résonance plasmonique a été obtenue en associant un réseau métallique d’une période de 300 nm, sur lequel est attaché un nucléotide d’ADN, à des nanoparticules d’or fonctionnalisées avec les brins d’ADN complémentaires [36]. La présence de ces nanoparticules amplifie fortement (multiplication par 18) la réponse du dispositif. Dans le tableau 1, on constate que la méthode SPR permet d’obtenir des limites de détection de quelques nanomoles sans aucune méthode d’amplification ; cependant, cette limite de détection peut atteindre les picomoles en utilisant des nanoparticules d’or. Ce travail de thèse sera consacré à la mise au point d’un capteur à ADN fonctionnant avec une cavité optique résonante, le microrésonateur en anneau. Avant de présenter les différents types de résonateurs optiques, une comparaison des performances des méthodes de détection est résumée dans le tableau 2 ci-dessous.

Présentation de la résine photosensible utilisée pour la fabrication du composant optique intégré

              Pour la réalisation du capteur optofluidique, nous utilisons la résine SU8, une résine photosensible négative. Du fait de sa bonne sensibilité photochimique, de sa stabilité chimique et de sa compatibilité avec de nombreux matériaux, y compris les biomatériaux, la photorésine SU8 est largement utilisée en microélectronique. Etant transparente dans le visible et le proche IR, elle peut également entrer dans la composition de composants optiques. Enfin, nous verrons au chapitre 5 qu’elle se prête facilement à la fonctionnalisation en surface, après activation par une association rayonnement UV/Ozone. La SU8 a été mis au point par la société IBM[3]. Ce matériau est constitué d’une résine polymère contenant initialement un tétramère d’un dérivé du bis-phénol A fonctionnalisé à ses deux extrémités par un cycle époxy. Les principaux constituants d’une photorésine sont un polymère ou un oligomère (la base de la résine), un sensibilisateur et un solvant de coulée. La base de la résine change de structure lorsqu’elle est exposée à des radiations électromagnétiques. Le solvant permet d’étaler des couches homogènes sur un substrat uniforme et le sensibilisateur permet d’initier et de contrôler les réactions photochimiques conduisant à la modification de la structure de la résine. De manière générale, la solution de SU8 (figure 1) est fabriquée en dissolvant la résine de marque « EPON-SU8 » dans un solvant organique comme le PGMEA (propylène glycol méthylétheracétate), la cyclopentanone ou la GBL (gammabutyrolactone) et il y est ajouté, comme photo-initiateur, 10% en poids de sels de triarylsulfonium hexafluoantimonate. Dans notre cas, nous utilisons une solution commerciale dite« SU8-2002 »de la société Microchem[4] qui permet de déposer des couches minces d’épaisseur ne dépassant pas 2µm. Le solvant de cette solution est la cyclopentanone, elle contient 29% en masse de solide « EPON-SU8 », ce qui lui confère une viscosité de 7.5 µm²/s. En effet, la gamme d’épaisseur de la couche de SU8 après dépôt dépend de la viscosité du liquide, qui peut être contrôlée via le ratio entre le solvant et la résine. La SU8 est une résine photosensible négative, c’est-à-dire que les réactions photochimiques renforcent le polymère par réticulation des chaînes principales, rendant ainsi la résine moins soluble dans la solution de développement. La réaction mise en jeu dans l’étape de photolithographie est schématisée cidessous (Figure 2). L’étape photochimique permet de transformer le sel de triaryl sulfonium en acide de Bronstedt organique H+ , A- , suivant une séquence un peu complexe représentée ci-dessous : Les ions H+obtenus provoquent la polymérisation du SU8 par ouverture des cycles époxy, réaction rendue plus facile par le fait que les cycles triangulaires sont soumis à une forte contrainte géométrique (Figure 3). L’étape de polymérisation exige une température supérieure à l’ambiante (et en tout état de cause supérieure à la température de transition vitreuse Tg) pour des raisons cinétiques. La réticulation due à l’ouverture des cycles permet d’obtenir un réseau dense de chaînes polymères. Il faut noter que cette réticulation provoque l’augmentation progressive de Tg. Elle s’arrête lorsque Tg a atteint la température de recuit. On peut donc assez bien contrôler le degré de polymérisation du matériau en fixant la valeur de la température de chauffage.

Table des matières

Chapitre 1
1. La molécule d’ADN
1.1 Description générale
1.2 La structure de l’ADN
1.3 Le phénomène d’hybridation
1.4 Rappel de quelques découvertes historiques
2 Méthodes de détection
2.1 Définitions d’un capteur
2.2 Différentes méthodes de détection non optiques
2.3 Cas des capteurs électrochimiques
3 Capteurs optiques
3.1 Capteurs avec marqueurs fluorescents
3.2 Différents types de capteurs optiques sans marqueurs
3.2.1 Capteurs non résonants
3.2.2 Capteurs à résonance plasmon de surface
3.2.3 Capteurs à cavités optiques résonantes
Chapitre 2
1 Principe de la détection par onde évanescente
1.1 L’onde évanescente, un phénomène d’interface en optique guidée
1.1.1 Principes de l’optique guidée
1.1.2 Propagation monomode et multimode
1.2 Onde évanescente et détection de phénomènes surfaciques
2 Microrésonateurs pour la détection surfacique
2.1 Principe et intérêt des microrésonateurs en anneau
2.2 Calcul analytique de la réponse du microrésonateur
2.2.1 Couplage
2.2.2 Réponse globale du microrésonateur couplé
2.2.3 Couplage critique et non-critique
2.3 Principaux paramètres caractérisant le microrésonateur
2.3.1 Réponse spectrale, intervalle spectral libre, facteur de qualité, finesse
2.3.2 Dispersion modale
2.3.3 Biréfringence modale
3 Transduction et optimisation de la sensibilité du microrésonateur
3.1 Mécanisme de transduction
3.2 Méthodes d’interrogation optique
3.2.1 Méthode de balayage en longueur d’onde
3.2.2 Méthode de variation d’intensité
3.3 Méthodes de pointage des longueurs d’onde de résonance
Chapitre 3
1 Méthode de fabrication et matériels utilisés
1.1 Matériaux utilisés
1.1.1 Résine photosensible utilisée pour la fabrication du composant optique intégré
1.1.2 Le cytop
1.1.3 Le PDMS
1.2 Procédés utilisés
1.2.1 Gravure ionique réactive (RIE : Reactive Ion Etching)
1.2.2 Photolithographie
2 Fabrication du transducteur optique
2.1 Fabrication du premier niveau du transducteur : le guide d’onde rectiligne
2.1.1 Activation de la surface et déshydratation par RIE pour l’accrochage du SU8
2.1.2 Dépôt du SU8 et recuit pré-insolation
2.1.3 Insolation
2.1.4 Recuit post-insolation, développement et recuit final
2.2 Fabrication du deuxième niveau du transducteur : le microrésonateur
2.2.1 Dépôt du Cytop
2.2.2 Gravure du Cytop
2.2.3 Dépôt du SU8 pour la réalisation de microrésonateurs en anneaux
2.2.4 Photolithographie du SU8
2.2.5 Clivage du wafer
2.3 Influence de la fabrication sur les performances du capteur optofluidique
3 Fabrication du capot microfluidique
3.1 Conception du circuit pour optimiser la circulation du fluide
3.2 Méthode de préparation
Chapitre 4
1 Montage du capteur optofluidique
2 Choix du microrésonateur
2.1 Réponse spectrale du microrésonateur
2.2 Différence de réponse spectrale dans l’eau et en l’air
2.3 Caractéristiques des microrésonateurs fabriqués en salle blanche
2.4 Choix des raies transductrices pour le capteur
3 Montage expérimental
3.1 Partie optique
3.2 Partie microfluidique
3.3 Acquisition des données et de mesure en temps réel..
4 Traitement des données
Chapitre 5
1 Mesures par capteur optofluidique
1.1 Détection par capteur optofluidique à champ évanescent : principes généraux
1.2 Détection homogène
1.3 Détection surfacique spécifique
1.4 Effet non-spécifique de la détection surfacique et la prévention
2 Fonctionnalisation du capteur optofluidique
2.1 Procédure de fonctionnalisation : aspects chimiques
2.2 Caractérisation de la surface fonctionnalisée
2.2.1 Par spectroscopie infrarouge
2.2.2 Par mesure au microscope à force atomique (AFM)
3 Mesures optofluidiques
3.1 Mesure optofluidique de l’acide amino-benzoïque
3.2 Mesure de la fonctionnalisation de la surface du capteur par l’ADN sonde
3.3 Prévention de la détection surfacique non-spécifique
3.4 Mesure optofluidique d’hybridation de l’ADN
3.4.1 Réponse du capteur optofluidique à l’hybridation de l’ADN
3.4.2 Mesures à différentes concentrations
3.5 Résultats et discussion
3.5.1 Méthodologie d’étalonnage du capteur
3.5.2 Etalonnage du capteur
3.5.3 Performances du capteur
3.5.4 Discussion
Conclusion et perspectives
1.1 Conclusion
1.2 Perspectives

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