Soutenance mémoire
Détection des acides nucléiques viraux
Les deux techniques les plus couramment utilisées pour cette détection sont :
-L’hybridation qui utilise l’ARN du VIH radio-marqué ou marqué par une enzyme pour sonder les cellules mononuclées à la recherche de l’ADN viral,
-La technique d’amplification des séquences appelées PCR (polymérase Chain réaction) : elle se fait à partir de l’ADN. On recherche directement la présence de l’ADN pro viral intégré dans l’ADN cellulaire ou la présence des ARN génomique ou messagers, en faisant précéder l’amplification d’une étape de transcription inverse qui transforme l’ARN en ADN (RT-PCR).
Diagnostic indirect
Tests de dépistage
Technique ELISA
La technique actuelle la plus utilisée pour la recherche des anticorps anti-VIH est une technique immunoenzymatique : L’ELISA (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).C’est une méthode simple, destinée au dépistage de grandes séries de sérums .Dans cette réaction, l’antigène viral est fixé par absorption physique à un support solide (microplaque ou bille de polystyrène).On distingue trois grands groupes de technique : les technique de type sandwich,les techniques indirectes et les techniques par compétition.
Technique de l’ELISA indirecte
Principe : le sérum à étudier est mis d’abord à incuber en présence du support sensibilisé : microplaque ou bille ; des complexes anticorps se forment et leur présence est révélée dans un second temps, par l’adjonction d’un sérum antiglobuline humain marqué par une enzyme.
Après une phase de lavage minutieux, le substrat de cette enzyme donnera une réaction colorée d’autant plus intense que le sérum est riche en anticorps.
Des témoins positifs ou négatifs inclus dans chaque réaction permettent de déterminer, par un calcul légèrement différent selon les trousses, la valeur seuil ou limite.
Les sérums dont la densité optique lue au spectrophotomètre est supérieure à cette valeur sont considérés comme positifs.
Technique de l’ELISA par compétition
Principe : les anticorps anti-VIH de l’échantillon à tester entrent en compétition avec les anticorps du conjugué (sérum anti-VIH marqué par une enzyme), vis à vis des antigènes viraux fixés sur le support solide. Plus la concentration d’anticorps dans l’échantillon est élevée moins l’antigène conjugué se fixera. Le substrat chromogène donnera une réaction colorée qui sera donc inversement proportionnelle à la concentration d’anticorps. Les témoins permettent de calculer une valeur seuil ; les sérums dont la densité optique est inférieure à cette valeur sont considérés comme positifs.
Technique de l’ELISA par sandwich
Principe : les anticorps recherchés dans le sérum à analyser sont pris en « sandwich » d’un côté par les antigènes de la phase solide et de l’autre par le conjugué (antigène couplé à une enzyme).Ce test permet la détection simultanée des anticorps pour le VIH1 et le VIH2.
Technique de l’ELISA par immunocapture
Principe : la phase solide est revêtue d’anticorps anti IgG humaines .Si les IgG sont présentes dans l’échantillon à tester, elles se lient aux anticorps. Après lavage, on rajoute un conjugué enzyme antigène VIH qui se lie spécifiquement aux IgG anti-VIH. Après un second lavage, on ajoute du substrat qui va se fixer sur le conjugué. Une coloration apparaît proportionnellement aux taux d’anticorps présents.
Test rapides
Les progrès de la technologie ont permis de mettre au point des séries de tests rapides dont le temps d’exécution varie selon les formes (5 à 30 mns).
Technique d’agglutination
Principe : Cette technique utilise des billes de polystyrène ou des hématies humaines qui servent de support aux protéines virales du VIH ; ces dernières mises en présence d’anticorps anti-VIH, forment un réseau d’agglutination visible à l’oeil nu. Elle peut s’effectuer sur lame (test au latex) ou sur plaque de micro agglutination (hémagglutination passive avec lecture du culot de sédimentation des hématies).
Technique d’ immunofiltration ou Dot Blot
Principe : elle utilise une membrane en papier ou de la nitrocellulose comme support solide .l’antigène est fixé sur le support et prend la forme d’un petit cercle ; il s’agit le plus souvent d’un peptide synthétique ou recombinant. Une pièce en plastique soutient en général le support solide et contient des tampons hydrophiles sous le papier pour recueillir le sérum et les réactifs après addition. Il existe deux types d’«immunodot» en phase solide.
L’immunodot sur carte
Les cartes plastifiées ont la forme d’un peigne dont les dents sont sensibilisées par des antigènes peptidiques de synthèse du VIH1 et VIH2 au niveau de deux tâches séparées.
Le principe du test consiste à introduire la carte successivement dans les échantillons de sérum (disposés dans les puits d’une plaque contenant tous les réactifs nécessaires déposés dans différents compartiment de la plaque) dans une solution de lavage, dans le conjugué marqué par une enzyme, une nouvelle fois dans une solution de lavage et enfin dans le substrat chromogène, il se forme une réaction colorée caractéristique d’une réaction positive.
l’immunodot sur membrane
Les antigènes du VIH1 et du VIH2 immobilisés sur une membrane sont soit sous forme d’une tâche unique, soit sous forme de deux tâches distinctes.
Le sérum dilué ou non dilué est ajouté directement sur la membrane. Les anticorps anti-VBIH du sérum dilué ou non dilué est ajouté directement sur la membrane .Le complexe immune formé est traité au moyen d’un conjugué marqué à une enzyme. Un substrat ajouté donne une tache colorée caractéristique d’une réaction positive.
Tests de confirmation
Etant donné l’existence de résultats parfois faussement positifs, il est en principe obligatoire de pratiquer un test de confirmation avant de délivrer un résultat positif.
Le Western blot (ou Immunotransfert)
Dans un premier temps ,les protéines virales sont séparées selon leur masse moléculaire par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et en milieu dissociant, puis transférées sur membrane de nitrocellulose ,cette dernière est ensuite découpée en bande longues et étroites.
Dans un second temps, les sérums à traiter sont mis à incuber en présence des bandelettes de nitrocellulose ; les anticorps présents se fixent en fonction de leur spécificité sur les protéines virales préalablement séparées : on révèle leur présence par addition d’une antiglobuline humaine marquée par une enzyme, puis d’un substrat chromogène.
Technique radio-Immunoprécipitation : RIPA
Principe : elle utilise un virus marqué par un isotope radioactif (en général la cystéine 35) ; le lysat viral contenant les antigènes est incubé avec les sérums à tester. Les complexes immunes formés sont alors captés sur un support d’affinité telles que des billes de protéines A-sepharose.
Les antigènes viraux retenus par les anticorps spécifiques sont ensuite dilués et séparés en fonction de leur poids moléculaires sur gel polyacrylamide. La révélation est effectuée par autoradiographie. Cette technique met en évidence préférentiellement des anticorps dirigés contre les protéines d’enveloppe.
Test d’Immunofluorescence (IFA)
C’est une technique d’exécution facile, qui demande moins de temps que le Western blot. Principe des cellules lymphocytaires infectées par le virus sont déposées sur des lames de microscope, de cellules identiques non infectées servent de témoins et permettent d’éliminer les fixations non spécifiques.
L’Immunoanalyse en ligne
Principe
Le test en ligne:Inno-Lia :cette technique utilise des bandes de nylon fixées sur un support plastique ainsi que des protéines recombinantes et des peptides de synthèse déposés selon cinq lignes discontinues. Pour le VIH1, on utilise quatre antigènes : P17 et P24 du gène gag, gp41 du gène ENV et P32 du gène POL.
Pour le VIH2, on se sert de gp36 du gène ENV. Le conjugué utilisé est une IgG de chèvre anti IgG humaine purifiée par affinité et marquée à la phosphatase alcaline.
Pepti-Lav : ce test utilise une membrane fixée sur un support plastique et comporte une ligne avec un sérum témoin et deux bandes sensibilisées avec des peptides de synthèses spécifiques qui représentent des épitopes immunogènes gp41 du VIH1 etgp36 du VIH2.Le conjugué utilisé est une immunoglobuline de chèvre anti-IgG humaine purifiée, marquée à la peroxydase de raifort.
Virus de l’hépatite B
Historique
La première épidémie reconnue d’infection à VHB remonte à 1883 à Bremen, en Allemagne. Elle était liée à des vaccins antivarioliques contaminés par le VHB. Par la suite, d’autres épidémies, souvent associées à des injections contaminées, ont été signalées de façon sporadique.
L’épidémie la plus grave de ce type est survenue en 1942. Elle a frappé environ 330 000 soldats américains à qui l’on avait administré un vaccin contre la fièvre jaune qui était contaminé [14].
Plusieurs faits importants se sont produits par la suite :
• La découverte, survenue par hasard, mais d’une très grande utilité, de l’ « antigène Australia » (antigène de surface du VHB), faite par Blum Berg, Alter et Visnich (1965) ;
• Le fait que l’on soit parvenu à distinguer la maladie causée par le virus de l’hépatite A de celle causée par le VHB [14] ;
• En 1975, l’équipe de P. Maupas, de Tours, publie les premiers résultats de vaccination contre le VHB utilisant comme source vaccinale l’Ag Australia (désigné sous le sigle Ag HBs) purifié à partir de plasma de porteurs chroniques.
• En 1986, le premier vaccin mondial obtenu par génie génétique et commercialisé est un vaccin contre l’hépatite B .
Les percées subséquentes dans les domaines de la virologie et de la sérologie ont permis une compréhension de plus en plus approfondie du VHB, de l’infection à VHB et de ses manifestions cliniques.
Structure
Le virus est constitué d’un noyau central (core, Ag HBc) contenant l’acide désoxyribonucléique du virus (ADN-VHB). Ce noyau est entouré d’une enveloppe externe (antigène de surface, Ag HBs). L’antigène « e » (Ag HBe) est une protéine soluble dérivée de l’Ag HBc qui lui est insoluble (c’est-à-dire ne se retrouve pas en circulation, mais seulement dans le foie).
Epidémiologie
Mode de transmission
Le virus de l’hépatite B se transmet directement ou indirectement par les liquides biologiques provenant d’individus infectés. Ces liquides sont : le sang, les secrétions sexuelles (spermes, secrétions vaginales).
Selon le mode d’exposition, la salive est suspectée d’être une voie de transmission de ce virus.
Les larmes, les urines, le lait maternel, les selles bien que contenant de faibles quantités de virus ne transmettent pas le virus. La contagiosité de ces liquides n’est pas démontrée car la charge virale y est 100 à 1000 fois plus faible que dans le sang.
La voie sanguine
Cette voie se retrouve dans tous les pays quels que soient leurs taux d’endémicité [16]. La transmission se fait par le sang ou les dérivés sanguins surtout en pratique médicale.
Elle est favorisée par :
– le partage d’aiguilles, de seringues,
– la transfusion sanguine,
– le partage de matériels tels que : brosses à dents, rasoirs, coupe-ongles (transmission intra familiale) .
De même des contaminations lors d’actes dentaires, de tatouages, et de percée d’oreilles sont possibles en cas de non respect des normes de stérilisation.
La voie sexuelle
Le virus de l’hépatite B est mis en évidence dans le sperme et les sécrétions vaginales des sujets atteints d’une hépatite aiguë B et les porteurs chroniques symptomatiques ou asymptomatiques, d’où la transmission du VHB lors :
– des rapports de pénétration anale ou vaginale,
– des rapports bucco-génitaux.
C’est donc une IST (infection sexuellement transmissible). Le nombre de partenaires, le nombre d’années d’activité sexuelle et l’existence d’antécédent d’autres IST sont des facteurs qui augmentent le risque chez les homosexuels et les prostituées qui constituent des sources de propagation de la maladie.
Transmission verticale
Les enfants nés de mères antigènes HBs positifs sont exposés à un risque particulier de contamination par voie sanguine, car le virus de l’hépatite B franchit la barrière placentaire du fait de sa petite taille. Ces nouveaux-nés sont particulièrement exposés à un risque de portage chronique, une fois infectés. Ils constituent un réservoir de virus. Mais 95% des enfants sont contaminés au moment de la délivrance, par contact direct avec le sang et les sécrétions de la filière génitale maternelle ; 5% semblent déjà avoir été contaminés in Utero.
La transmission se fait par voie placentaire (communication entre les circulations foetale et maternelle), soit au décours d’une excoriation cutanée, par pénétration du virus à travers des muqueuses, par injection de sang maternel au cours d’une césarienne.
Transmission horizontale
Cette voie est fréquente chez les jeunes enfants et les adolescents, mais peu exister à tout âge. Elle est fréquente dans la vie quotidienne d’une famille. La moindre excoriation cutanée ou muqueuse libérant du sang peut assurer la contamination du virus B soit directement par contact, soit par une brosse à dent, un rasoir, des linges de toilette (0,0001 ml de plasma peut assurer la transmission).
Cas exceptionnels
– Par le baiser, à condition qu’il y ait une effraction cutanée susceptible de favoriser la pénétration du virus (maladie de la muqueuse, brûlure etc.…)
– Par partage de vaisselle, de verre ( le fait de manger avec les couverts d’une personne atteinte d’hépatite B aiguë, de boire dans le verre ou au goulot de la même bouteille, etc.…)
– Par une morsure de personne à personne.
Transmission non prouvée
La transmission par des insectes hématophages tels que les moustiques et les punaises est incertaine, malgré l’existence de l’antigène HBS chez ces derniers [23]. Certains helminthes (Anguillules, Ankylostomes, Schistosomes) ont été soupçonnés de favoriser l’infestation par le VHB par les micro lésions qu’ils provoquent lors de leur pénétration transcutanée dans l’organisme. Cependant, là aussi aucune preuve n’a été apportée.
Répartition géographique
Le VHB a un caractère ubiquitaire, présent dans le monde entier. IL est la deuxième cause identifiée de décès par cancer après le tabac [37].
L’hépatite B est considérée par l’OMS comme une des dix plus meurtrières de toutes les maladies infectieuses. La mortalité attribuable aux infections par le VHB est de 1 à 2 millions d’individus, chaque année. Cette mortalité est liée principalement aux complications de l’hépatite chronique, à savoir la cirrhose et le cancer primitif du foie.
Il existe schématiquement trois zones : Une zone de très forte prévalence : Chine, Asie du Sud-est, Afrique Subsaharienne. 70 à 95% des résidents ont fait une hépatite B. L’infection chez l’enfant y est fréquente.
Une zone de moyenne prévalence : Bassin méditerranéen, moyen orient, Amérique du sud, Europe de l’Est, Ex-URSS. 20 à 50 % des résidents ont fait une hépatite B.
Une zone de basse prévalence : Europe de l’Ouest, Amérique du nord, Australie. 3 à 5 % des résidents ont fait une hépatite B. Elle est rare chez les enfants. En France, pays de faible prévalence, 910 000 personnes ont été contaminées. On compte un taux de portage chronique de 0,2 à 0,3 % de la population générale (100 à 150 000 cas). L’incidence de l’infection est de 30 000 à 60 000 cas par an. Les nouvelles contaminations surviennent dans 90 % des cas après 20 ans de contage. On estime enfin que 1000 décès sont imputable chaque année à une forme chronique d’hépatite B.
Au Mali ; Xavier [44] en 1997 et Tembely [39] en 2002 avaient trouvé des fréquences de 16,5 et 15,25 % au CNTS de Bamako chez les donneurs de sang. Le taux de l’Ag HBs est estimé à 14,9 % selon Guindo .
Pouvoir pathogène
Le VHB est un virus à ADN. Il pénètre la cellule et intègre le noyau sous forme circulaire très stable. IL produit des transcrits d’ARNm. Les uns servent à la fabrication des protéines virales au niveau du réticulum endoplasmique.
Un transcrit complet subit l’action de la transcriptase reverse, et donne naissance à un brin négatif d’ADN. L’ADN polymérase virale synthétise la chaîne complémentaire, formant un ADN en partie bi caténaire qui est ensuite assemblé avec les protéines virales pour former une particule virale complète.
Le diagnostic est facilité par la présence des protéines virales dans le sérum ou dans le foie. Ce sont les Ag HBs, les Ag HBc et les Ag Hbe. Ces trois antigènes donnent naissance à des anticorps correspondants.
L’Ag HBs est le marqueur viral le plus fréquemment recherché dans le sérum des patients. IL porte un déterminant spécifique de groupe (déterminant a).
IL porte également divers déterminants spécifiques de sous-types. Ce sont adw ; ayw ; ayr.
Des mutations ponctuelles au niveau de la protéine S permettent le passage d’un sous-type à un autre, voire la perte de la réactivité avec l’Ac anti HBs. L’Ag HBc appelé encore Ag de core est constitué de la polymérisation de sous unités protéiques de poids moléculaires de 22 kd. Cet Ag est uniquement retrouvé dans le foie.
Transaminases sériques
Ce sont des enzymes ayant pour coenzyme le phosphate de pyridoxal. Elles assurent le transfert du radical NH2 d’un acide aminé sur un acide alpha cétonique. Les transaminases permettent ainsi au cours de la dégradation oxydative des acides aminés, le transfert du radical aminé vers l’uréogenèse.
Leur élévation, même mineure, traduit une cytolyse plus ou moins importante.
Leur élévation est un signe présomptif d’une hépatite virale.
La TGP (ALAT) qui est essentiellement cytoplasmique apparaît plus vite, en plus grande quantité et plus spécifique du foie.
La TGO (ASAT), son taux augmente moins que celui de la TGP, en cas de lésions légères, cependant devient plus, élevé en cas de lésions sévères atteignant les mitochondries.
La TGP est spécifiquement présente dans le foie, son augmentation est le signe d’une cytolyse tandis que la TGO se trouve dans d’autres organes (coeur, rein, muscles…) et est moins spécifique du foie.
La cinétique du taux des transaminases permet d’apprécier l’évolution de la maladie. Hépatite aiguë : une nette élévation des transaminases avant l’apparition de l’ictère. Ce qui constitue le seul signe des hépatites anictériques. Cette élévation est très importante (TGO =400 M UI /ml, N = 5 à 25 et TGP = 600 M UI / ml, N = 5 à 25) et permet de distinguer l’évolution vers la guérison ou la chronicité.
Hépatite chronique : une élévation des transaminases est un signe constant, mais avec des valeurs inférieures significatives (40 à 60 M UI / ml.
Autres tests sanguins
D’autres tests de cytolyse hépatique (OCT, LDH) et des tests d’insuffisance de synthèse hépatique (estérases, protides totaux, sérum albumine, cholestérol estérifié, fibrinogène et prothrombinique) peuvent compléter l’exploration biochimique des hépatites virales. On note également une inversion de la numération formule sanguine (NFS) et une accélération de la vitesse de sédimentation (VS).
Ponction biopsique du foie
Histologiquement, l’existence d’une réaction inflammatoire généralisée associée à un degré variable de nécrose hépatocytaire traduit l’atteinte hépatique.
On définit deux formes d’hépatites à savoir : l’hépatite aigue et l’hépatite chronique. Hépatite B aiguë : apparition de l’antigène HBs 2 à 6 semaines avant le début clinique de la maladie et persistance 1 à 4 semaines après le début de l’ictère. Sa disparition signifie la guérison tandis que sa persistance traduit une évolution chronique de l’hépatite. Chez 75 % des sujets, l’hépatite aiguë ne s’accompagne pas d’ictère, est souvent asymptomatique et n’est pas diagnostiquée, alors que 25 % des sujets atteints ont un ictère et des symptômes cliniques. Une minorité de cas (moins de 1 %) ont une maladie fulminante conduisant rapidement vers le décès et sont candidats à une transplantation hépatique d’urgence. Parmi les adultes infectés, environ 5 % demeurent des porteurs chroniques du VHB.
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Table des matières
Liste des abréviations
Chapitre I : INTRODUCTION – OBJECTIFS
I.1. Introduction
I.2. Objectifs
Chapitre II : GÉNÉRALITÉ
II.1. Virus de l’immunodéficience humaine (VIH)
II.1.1. Historique
II.1.2. Données virologique
II.1.3. Pouvoir pathogène
II.1.4. Diagnostic au laboratoire
II.2. Virus de l’hépatite B
II.2.1. Historique
II.2.2. Données virologiques
II.2.3. Pouvoir pathogène
II.2.4. Diagnostic au laboratoire
II.3. Virus de l’hépatite C
II.3.1. Historique
II.3.2. Données virologiques
II.3.3. Pouvoir pathogène
II.3.4. Diagnostic au laboratoire
II.4. Co infection VIH et hépatites B et C
II.4.1. Impact des infections virales hepatotropes
II.4.2. Interactions VIH/VHB
II.4.3. Interactions VIH/VHC
Chapitre III : MÉTHODOLOGIE
III.1. Cadre de l’étude
III.2. Type et période de l’étude
III.3. Echantillonnage
III.4. Collecte des échantillons
III.5. Aspect éthique
III.6. Les tests utilisés dans l’étude
III.7. Méthode de laboratoire
III.8. Traitement informatique et analyse des données
III.9. Analyse statistique
Chapitre IV. RÉSULTATS
IV.1. Résultat du test de dépistage rapide VIH unique
IV.1.1. Résultats des données socio – démographiques
IV.1.2. Prévalence du VIH
IV.2. Résultat du test de dépistage rapide VIH/VHB/VHC combiné sur le sang total
IV.2.1. Résultats des données socio – démographiques
IV.2.2. Prévalence du VIH, du VHB et de la co – infection VIH/VHB
IV.3. Evaluation de la performance des tests rapides Mirawell VIH unique et Mirawell VIH/VHB/VHC combiné par rapport à l’algorithme standard utilisé à l’INRSP
IV.3.1. Résultats du test de dépistage rapide VIH unique sur le sang total
IV.3.2. Résultat du test de dépistage rapide VIH/VHB/VHC combiné sur le sang total
IV.3.3 Résultats de test de dépistage rapide VIH/VHB/VHC combiné sur les 50 sérums de collection positifs pour le VIH par l’algorithme de l’INRSP
Chapitre V : COMMENTAIRES – DISCUSSIONS
V.1. Aspects socio – démographiques
V.2. La prévalence
V.3. Paramètres d’appréciations des tests
Chapitre VI. CONCLUSION – RECOMMANDATIONS
VI.1 Conclusion
VI.2. Recommandations
Chapitre VII : RÉFÉRENCES
ANNEXE : Formulaire de consentement
RÉSUMÉ
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