Désinfection du capuchon des flacons d’hémoculture

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Modalités

Moments du prélèvement

Le praticien doit pouvoir prélever à n’importe quel moment du jour ou de la nuit en cas de suspicion de bactériémie ou de température en plateau. Et ici, c’est le bon sens clinique qui l’emporte.
C’est-à-dire qu’il n’y a pas une valeur seuil de fièvre à partir de laquelle le prélèvement est acceptable. Une personne âgée peut, par exemple, ne présenter aucune fièvre même en présence d’une bactériémie. Dans le cas présent, c’est plutôt l’altération de l’état général et l’absence de foyer infectieux à l’examen clinique qui peuvent inciter le praticien à tenter une hémoculture. De même, une hémoculture peut être utile dans la mise au point de fièvres isolées et récurrentes. Les situations idéales sont la fièvre élevée, les frissons, l’hypothermie, le choc…et ce, dans un contexte clinique compatible avec une bactériémie. Il est aussi préférable de faire le prélèvement tout au début de la maladie et à distance des repas [2, 7].

Sites de prélèvement

La ponction veineuse est la seule méthode fiable pour prélever du sang en vue de la culture. Les autres sites de prélèvement, notamment les recueils de sang par cathéter, augmentent de façon significative la fréquence des contaminants [8].

Antisepsie de la peau

Elle doit se faire successivement avec de l’alcool à 70% puis un produit iodé (teinture d’iode ou polyvidone iodé) 1 à 2 minutes de contact sont nécessaires pour obtenir l’effet antiseptique maximal de la polyvidone iodée. Après la ponction veineuse, le produit iodé potentiellement irritant est enlevé avec de l’alcool à 70% [8].

Désinfection du capuchon des flacons d’hémoculture

Elle est réalisée avec de l’alcool à 70% ou un produit iodé que l’on laisse sécher avant usage [1].

La quantité de sang à prélever

La densité des bactéries présentes dans le sang est généralement très faible chez l’adulte. Une quantification faite par centrifugation-lyse (Isolator) au cours de bactériémies significatives a montré que la densité bactérienne était inferieure à 1 UFC/ml dans des pourcentages importants d’épisodes [9].
Il existe une relation directe entre le volume de sang inoculé dans les flacons d’hémoculture et le rendement de la technique. Un volume de 20ml de sang prélevé augmente le pourcentage de positivité de 30%, comparativement à un volume de 10ml qui est le minimum souhaitable chez l’adulte. De la même façon l’augmentation du volume de sang inoculé dans les flacons augmente la sensibilité de la détection de la positivité par un automate.
Chez l’enfant, la densité des bactéries dans le sang est plus importante que chez l’adulte. Ainsi, un prélèvement de 1 à 2 ml est considéré comme satisfaisant. Ce volume peut être accru en fonction de l’âge [9].

Nombre de prélèvements nécessaires

Si l’on excepte les infections du système vasculaire, particulièrement les endocardites bactériennes, au cours desquelles la bactériémie est permanente, au cours des autres situations cliniques, la bactériémie peut être soit transitoire, soit intermittente.
Plusieurs auteurs ont analysé le nombre d’hémocultures nécessaires pour détecter la totalité des épisodes bacteriémiques. En inoculant 20ml de sang par prélèvement et en utilisant un système conventionnel, Washington a détecté 80% des épisodes avec la première hémoculture, 88% avec une deuxième et 99% avec une troisième.
Weinstein inoculant aussi 20ml par prélèvement et réalisant trois hémocultures par 24 heures analysées par l’automate Bactec/Alert, a observé un taux de 91% de la positivité avec la première hémoculture et 99% avec la seconde [9, 17].
Il faut conclure que trois ou même deux hémocultures par 24 heures sont suffisantes pour isoler la totalité des bactéries ou des levures responsables d’épisode bacteriémique.
Un espace de temps de 30 à 60 minutes entre deux prélèvements a été recommandé.
Dès que le prélèvement ait terminé, il faut homogénéiser le liquide des flacons, les marquer et les envoyer rapidement au laboratoire où ils seront placés dans une étuve de 37 °C. Un bain marie à plus ou moins 30 °C permet aussi une considération idéale au cabinet. Par contre il ne faut jamais mettre le prélèvement au frigo.

La culture

Aérobiose-anaérobiose

Il est classique pour une même hémoculture d’ensemencer un jeu de deux flacons, l’un incubé en aérobiose, l’autre en anaérobiose. Considérant la diminution importante de la fréquence des bactéries anaérobies, la question de savoir s’il est opportun de continuer à utiliser systématiquement des flacons anaérobies est aujourd’hui posée. Il n’y a pas de réponse univoque. Il est probable que cela puisse être possible dans certains services, mais pas dans d’autres comme la chirurgie gynécologique ou colo-rectale. De plus, certaines bactéries aéro-anaérobies comme les Streptocoques et Entérocoques se développent rapidement en aérobiose. Enfin, l’utilisation de deux flacons permet d’accroitre la sensibilité de l’hémoculture [9].

Dilution du sang prélevé

Le sang contient de nombreuses substances à activité antibactérienne : complément lysozyme, cellules phagocytaires et des antibiotiques dans environ un tiers des cas.
La dilution du sang dans le bouillon atténue l’effet de ces substances. La dilution au 1/10 est celle qui donne le meilleur résultat. Cependant une dilution inferieure, jusqu’à 1/5, est encore possible. Quant à une dilution supérieure à 1/10, elle est sans inconvénients sinon de réduire la quantité de sang inoculé. Au total, plus grand est le volume de bouillon dans le flacon, meilleur est l’effet de dilution. Utiliser des flacons contenant un plus petit volume de bouillon pour les hémocultures de pédiatrie n’apporte pas d’avantage significatif [7, 9].

Utilisation d’anticoagulant

L’anticoagulant très généralement utilisé dans les bouillons pour hémoculture est le polyanéthole-sulfate de sodium(SPS) à une concentration de 0,025-0,050%. Le SPS favorise la croissance de la plupart des bactéries : il inhibe l’activité bactéricide du sérum, inhibe la phagocytose, inactive le complément, neutralise le lysozyme et les antibiotiques de la famille des aminosides.
Néanmoins, le SPS peut avoir un effet inhibiteur sur certaines souches de Neisseria, de Peptostreptococcus anaerobius ou de Streptobacillus moniliformis. Il est donc préférable d’utiliser une concentration de 0,025% de SPS. L’addition de gélatine à la concentration de 1,2% peut neutraliser l’effet inhibiteur du SPS [9].

Neutralisation des antibiotiques

La neutralisation des antibiotiques présents dans l’échantillon de sang prélevé serait souhaitable chez les patients ayant reçu un traitement préalable, particulièrement en cas de suspicion d’endocardite. Des résines absorbeuses de cations ont un certain effet neutralisant des antibiotiques de même que le charbon activé.
Donc réaliser les prélèvements pour hémoculture, à distance de l’administration des antibiotiques est une mesure utile et doit être prise en considération [7].

Détection précoce de la croissance bactérienne

Durée d’incubation des flacons d’hémocultures

Une incubation à l’étuve à 37°C pendant sept jours est suffisante en routine. Avec les automates une durée de cinq jours a été validée. Au-delà de ce délai les bactéries détectées sont généralement des contaminants qui étaient présents en faible quantité dans le prélèvement.
Un temps d’incubation plus long peut être nécessaire pour des micro-organismes particuliers : champignons, bactéries du groupe HACEK, Brucella ou Legionella ou encore pour des patients suspects d’endocardite et dont les prélèvements ont été réalisés alors que le malade recevait des antibiotiques [6].

Méthodes conventionnelles

Examen macroscopique des flacons d’hémocultures

Chaque jour ou mieux deux fois par jour, les flacons sont inspectés en vue de rechercher des signes témoignant d’une croissance visible. Avec une certaine habitude il est possible en fonction de l’aspect d’un flacon de pressentir l’identité de la bactérie en cause (tableau I). Il est à signaler que certaines bactéries comme Neisseria, Haemophilus et Campylobacter troublent peu ou pas le bouillon de culture et que l’usage d’un flacon diphasique s’avère utile pour ces espèces [6].

La centrifugation-lyse : le système Isolator

Ce système permet de recueillir 8 à 10 ml de sang et de concentrer les micro-organismes avant d’ensemencer les milieux gélosés adaptés à la croissance de ces micro-organismes. La solution présente dans le tube contient de la saponine pour lyser les leucocytes et les érythrocytes, du polypropylèneglycol pour éviter la formation de mousse due à la saponine et du SPS comme anticoagulant.
Après centrifugation du tube dans un rotor à angle fixe de 35° pendant 30 minutes à 3 000 g, le surnageant est éliminé et le concentré est homogénéisé au vortex puis ensemencé sur différents milieux gélosés appropriés. Isolator 1,5 est le même système sans étape de centrifugation. Pratiqué avec des tubes de 1,5ml, il est utilisable en pédiatrie [3].
Le système Isolator est très performant pour l’isolement des micro-organismes suivants : mycobactéries, levures à croissance difficile et champignons filamenteux, bactéries exigeantes (HACEK, Bartonella, Legionella).
Le système Isolator permet en outre de quantifier la bactérie, ce qui serait utile pour mettre en évidence une infection sur cathéter. Ce système a cependant quelques inconvénients. Le risque de contamination lors des manipulations oblige à travailler sous hotte, mais surtout c’est une méthode manuelle très consommatrice du temps du manipulateur, ce qui est un facteur limitant.

Actualités sur l’hémoculture

La pratique de l’hémoculture, qui demeure l’un des examens biologiques les plus importants en termes d’impact Clinique et thérapeutique, a considérablement évolué au cours des deux dernières décennies. On a pu en effet assister, en peu d’années, à des changements majeurs de la pratique de cet examen, en dépit de réticence liées parfois à un conservatisme d’ordre économique ou purement sentimental.
Avec l’automatisation des hémocultures, on obtient une rapidité accrue des techniques et de leurs résultats, une amélioration de la sensibilité, une accélération des délais de lecture : celle–ci longtemps manuelle peut être automatisée aujourd’hui. Les implications cliniques de cette évolution sont considérables car les septicémies demeurent des infections sévères, associées à des taux de mortalité élevés.
De plus, des situations infectieuses nouvelles, liées à la multiplication des états d’immunodépressions, à divers facteurs épidémiologiques et d’environnement, ont contribué à modifier le profil microbiologique des micros organismes potentiellement impliqués : les nouvelles méthodes d’hémoculture s’accordent avec ces facteurs d’évolutions des septicémies. Enfin, l’expérience de certains grands laboratoires des hôpitaux universitaires à montré qu’en marge des septicémies les systèmes automatiques s’adaptent parfaitement à la recherche d’agents pathogènes dans les liquides biologiques autres que le sang avec une grande fiabilité [3].

Le passé

L’histoire de l’hémoculture se confond avec celle de la microbiologie et les précurseurs du 18ième siècle, tels que Delafond en 1838, Rayer et Davaine en 1850, avaient observé des bâtonnets réfringents dans le sang d’animaux morts de charbon.
Avec l’inoculation de sang charbonneux riche en bâtonnets, Davaine réalise l’une des premières hémocultures de l’histoire de la microbiologie.
La révolution Pastorienne marquée, entre autres découvertes majeurs, par la capacité à cultiver des bactéries hors du corps de l’animal conduit rapidement Pasteur et ses disciples au développement de méthodes de diagnostic de laboratoire [3].

Au 20ième siècle

Le diagnostic des septicémies repose désormais sur l’isolement et la culture des bactéries circulant dans le sang. Depuis l’usage, dans les années 1950, du ballon de bouillon de 150 à 250 ml de milieu de préparation artisanal, associé à un milieu anaérobie ( gélose demi-molle) en tube de Reilly ( anaérobiose obtenue par régénération au bain-marie), on passe à partir des années 1960 à l’emploi de milieu de culture de préparation industrielle, de composition définie supplémentée pour permettre la culture de bactéries à croissance difficile ; au tournant des années 1980, on entre de plain-pied dans l’ère de l automatisation en microbiologie, bien que cette discipline se soit avérée longtemps difficile à automatiser de par sa nature même puisqu’ il s’agit de manipuler des organismes vivants. Jusqu’ au développement des méthodes automatiques, la conduite de l’hémoculture impliquait des délais minimaux de 48 heures à 3 jours, pouvant atteindre jusqu’à 3 semaines (nettement en cas de suspicion de Brucellose). L’essor des techniques microbiologiques de la première moitié du 20ème siècle avait permis d’élaborer des approches pathogéniques des septicémies et les indications de l’hémoculture avaient été précisées. Il était classique de distinguer les septicémies à point de départ trombophlebique, dominées par les staphylocoques, celles à point de départ lymphatique ou lymphoganglionnaire (Brucellose), et les septicémies d’origine endocardique.
Dans ces trois modèles de septicémies, l’hémoculture était la méthode majeure de diagnostic grâce à l’isolement et l’identification de l’agent infectieux. Quelques critères d’interprétation étaient respectés :
– Plusieurs hémocultures positives avec la même bactérie associées à des signes généraux graves signaient la septicémie.
– Une seule hémoculture positive associée à un ’’ clocher thermique’’ était en faveur d’une bactériémie.
– Une seule hémoculture positive et l’isolement d’une bactérie commensale (ou identifiée comme telle) sans signes cliniques indiquaient une contamination des milieux de culture [3].

L’époque moderne

Elle se caractérise en médecine par la multiplication des méthodes invasives d’exploration et d’administration de médicaments (perfusions continues, cathéters centraux), des techniques chirurgicales sophistiquées, des traitements agressifs (chimiothérapie).
Mais simultanément, les techniques microbiologiques ont progressé à tout égard : perfectionnement des méthodes de prélèvement des échantillons chez le patient. Standardisation des milieux de cultures et des techniques d’identification des bactéries, enfin développement récent d’automates de bactériologie. Aussi des définitions nouvelles, des concepts pathogéniques plus précis, des analyses et des interprétations des résultats d’examen bactériologique plus rigoureux sont établis aujourd’hui. Les progrès des techniques d’hémoculture s’inscrivent dans cette évolution [3].

Les automates d’hémoculture

Principes généraux et évaluation

Tous les automates d’hémoculture détectent le CO2 produit au cours de la croissance des microorganismes à partir des hydrates de carbone présents dans les milieux de culture. En 1974, le Bactec 460 (Becton-Dickinson), premier système mis sur le marché, mettait en évidence la croissance bactérienne par une mesure isotopique périodique du CO2 marqué. Ce système avait comme inconvénient majeur l’utilisation de produit radioactif et n’a pas été admis en France. En 1985, la société Becton-Dickinson commercialise le Bactec NR-660, appareil semi automatique qui mesure le CO2 par spectrométrie infrarouge. Le nombre de test de lecture par 24 heures est limité et la lecture, invasive, nécessite un système d’aiguilles qui aspire un volume de CO2 produit lors du métabolisme microbien. Quelques années plus tard, en 1991, le Bactec NR-860 (Becton-Dickinson) se distingue du précédent par une plus grande automatisation : passage automatisé des plateaux contenant les flacons d’hémocultures vers le système de lecture et, surtout, fonctionnement en continu. Cette caractéristique est essentielle car elle évite la lecture du CO2 par méthode invasive ce qui supprime tout risque de contamination. L’identification des flacons est réalisée par code-barres et la maintenance du système est simplifiée.
Deux autres appareils automatiques ont été développés et mis sur le marché en 1989 : le système Bio-Argos (Bio-Rad), le Bact/Alert (Organon-Teknika). Enfin, en 1993 le Bactec 9240 (Becton-Dickinson) et le Vital (Bio Mérieux) ont été les systèmes les plus récemment mis sur le marché [3].

Caractéristiques communes des automates

Les performances de ces automates sont équivalentes pour les bactéries les plus fréquentes : avec Bact/Alert, 90,6 % des hémocultures positives sont détectées en 24 heures et 96 % des hémocultures sont positives en 2-3 jours.
Le temps moyen de détection des microorganismes cliniquement significatifs, qui était de 30 heures pour Bactec NR-660, inferieur à 24 heures pour les appareils plus récents, se situent autour de 10 heures pour le système Bactec des séries 9000 et 18 heures pour le système Vital. Le taux de faux positif apparaît insignifiant et varie respectivement de 0,25% à 0,71% pour ces deux systèmes. Avec les automates d’hémocultures, l’incubation des flacons pendant cinq jours apparaît suffisante pour les bactéries les plus fréquentes ; au-delà de ce délai, les bactéries détectées sont en général des contaminants. De plus, la substance des flacons négatifs n’est plus utile [3, 4].

Description des principaux systèmes

Le principe de détection de ces systèmes est fondé sur la mesure directe ou indirecte du CO2 produit dans les flacons.
¾ Le système Bio Argos :
Le principe de lecture est fondé sur la détection non invasive du CO2 par spectrométrie infrarouge à travers le verre. A intervalles de temps réguliers définis par l’utilisation, un bras mobile déplace le flacon vers la cellule de lecture, l’agite et le replace dans son alvéole. Les flacons positifs sont dirigés dans une loge thermostatée. A l’issue de la période d’incubation, les flacons négatifs sont éjectés à l’extérieur de l’appareil dans une poubelle conçue pour l’incinération [3].
¾ Le système BacT/Alert :
La mesure du CO2 fait intervenir un détecteur colorimétrique ‘’CO2 sensor’’ incorporé dans chaque flacon et séparé du milieu de culture par une membrane semi-perméable au CO2. Pendant le métabolisme bactérien, la concentration en CO2 augmente et diffuse vers le ‘’CO2 sensor’’ qui vire du vert au jaune.
Ce changement de couleur est interprété par réflectométrie et la variation de couleur est comparée à la précédente toutes les 10 minutes [3].
¾ Bactec séries 9000 : 9240 et 9050 :
La capacité de ces automates est respectivement de 240, 120 et 50 flacons d’hémoculture. Le principe de détection du CO2 est identique à celui du Bact/Alert. L’augmentation de CO2 entraîne une augmentation de fluorescence du ‘’sensor’’, mesurée par un photoide. L’appareil détecte les flacons positifs par l’analyse d’un algorithme de croissance et des valeurs seuils.
¾ Vital :
Les flacons d’hémocultures contiennent une substance fluorescente à l’état natif, dont la fluorescence s’éteint s’il existe des variations de pH ou de potentiel d’oxydo-reduction dans le milieu par production de CO2 au cours du métabolisme microbien. La molécule fluorescente permet, par simple mesure de la fluorescence émise, de mesurer toute variation de pH et/ou du potentiel d’oxydo-reduction, c’est la technique HFT (Homogeneous Fluorescence Technology).
L’automate mesure une décroissance de la fluorescence toutes les 15 minutes et cette diminution de la fluorescence est analysée par un ordinateur qui détecte les flacons positifs selon trois algorithmes différents : modification de la fluorescence, variation du pH et modification du potentiel d’oxydoréduction [3].

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. DEFINITIONS
1. Hémoculture
2. Bactériémie
3. Sepsis
4. Sepsis sévère
5. Choc septique
II. INTERETS DE L’HEMOCULTURES
III. INDICATIONS
IV. TECHNIQUES
1. Matériel
2. Les conditions de prélèvement de qualité
3. Modalités
3.1. Moments du prélèvement
3.2. Sites de prélèvement
3.3. Antisepsie de la peau
3.4. Désinfection du capuchon des flacons d’hémoculture
3.5. La quantité de sang à prélever
3.6. Nombre de prélèvements nécessaires
4. La culture
4.1. Aérobiose‐anaérobiose
4.2. Dilution du sang prélevé
4.3. Utilisation d’anticoagulant
4.4. Neutralisation des antibiotiques
5. Détection précoce de la croissance bactérienne
5.1. Durée d’incubation des flacons d’hémocultures
5.2. Méthodes conventionnelles
5.3. Actualités sur l’hémoculture
5.3.1. Le passé
5.3.2. Au 20eme siècle
5.3.3. L’époque moderne
5.3.4. Les automates d’hémoculture
6. Les investigations spécifiques
6.1. La recherche de mycobactéries
6.2. Autres micro‐organismes
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
CHAPITRE 1 : CADRE DE L’ETUDE
1.1. Centre Hospitalier Universitaire (C.H.U) de Fann
1.2. Laboratoire de Bactériologie-Virologie
CHAPITRE 2 : Méthodologie et matériel de l’étude
2.1. Méthodologie de l’étude
2.2. Matériel de l’étude
2.3. Exploitation des résultats
CHAPITRE 3 : RESULTATS
3.1. Technique d’hémoculture pratiquée sur la paillasse du laboratoire
3.2. Résultats
3.2.1. Provenance des prélèvements d’hémoculture
3.2.2. Population cible
3.2.3. Patients infectés
3.2.4. Isolats bactériens
CHAPITRE 4 : DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
4.1. Aspects épidémiologiques
4.2. Aspects bactériologiques
4.2.1. Cocci à Gram positif
4.2.2. Bacilles à Gram négatif
4.2.3. Bacilles à Gram positif
RECOMMANDATIONS
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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