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Des membranes biologiques à la caractérisation électrique de l’activité des canaux ioniques membranaires
Les membranes biologiques
Les membranes biologiques jouent un rôle essentiel chez les organismes vivants : elles permettent de définir des compartiments, tels que les cellules et les organites, dont la composition chimique peut être maintenue différente de leur environnement extérieur. La membrane extérieure des cellules, appelée membrane plasmique, est ainsi une véritable frontière entre la cellule et son environnement extérieur, frontière nécessaire pour que la cellule puisse exister en tant que « système biochimique coordonné » [1]. On trouve aussi à l’intérieur des cellules eucaryotes différents organites séparés du reste de la cellule par une membrane [2], qui montre la structure d’une cellule animale. Ils remplissent différentes fonctions au sein de la cellule, telles que la production d’énergie, la synthèse de molécules biologiques et la dégradation d’éléments toxiques. Ces fonctions nécessitent chacune un environnement chimique particulier et elles ne pourraient pas coexister sans la présence de membranes pour séparer les milieux de composition chimique différentes. Outre ce rôle de cloisonnement, les membranes biologiques régulent aussi les échanges de matière entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule ou des organites, ce qui permet in fine d’en réguler la composition chimique. Enfin, un troisième rôle important des membranes est de permettre des échanges d’information, échanges à la base de la communication entre les cellules ou entre les organites.
Pour remplir ces différentes fonctions, les membranes biologiques ont une composition chimique spécifique selon le type de cellule et l’emplacement de la membrane dans la cellule. Elles ont cependant une structure commune, décrite par le modèle de la mosaïque fluide [3]. ) montre une vue en coupe de membrane plasmique de cellule animale. Des molécules amphiphiles, les phospholipides, sont organisées en une bicouche lipidique fluide de 4 – 5 nm d’épaisseur. Ces phospholipides s’orientent de sorte que seule leur tête polaire hydrophile se trouve en contact avec les molécules d’eau, agencement favorable énergétiquement. Diverses protéines, dites protéines membranaires intégrales, sont insérées dans la bicouche lipidique et peuvent y diffuser latéralement. Ces protéines peuvent traverser totalement la bicouche (on parle dans ce cas de protéine transmembranaire), ou bien être insérées dans un seul des deux feuillets lipidiques. Les protéines intégrales sont fortement liées à la membrane, et ne peuvent en être extraites uniquement après dissolution de celle-ci avec des détergents. D’autres protéines, dites protéines membranaires périphériques, sont plus faiblement liées à la membrane : elles sont en interaction non covalente avec des phospholipides ou des protéines membranaires intégrales, et peuvent être détachées de la membrane par des procédés tels que l’exposition à des solutions de faible ou de forte force ionique, ou de pH extrêmes [4].
De nombreuses protéines membranaires sont organisées en hélice(s) α , structure qui permet à une chaîne peptidique d’être stable au sein d’une bicouche lipidique : le squelette peptidique est enroulé en hélice sous l’effet de liaisons hydrogène entre les groupements amide de la chaine polypeptidique. Les chaines latérales des acides aminés étant ici majoritairement hydrophobes, elles s’orientent vers l’extérieur de l’hélice, et stabilisent celle-ci dans l’environnement apolaire que constitue le cœur de la bicouche lipidique. Certaines protéines membranaires contiennent une seule hélice α, qui peut traverser totalement la bicouche ou être insérée dans un seul des deux feuillets lipidiques. D’autres protéines, dites protéines à plusieurs passages, sont constituées d’une longue chaîne polypeptidique présentant plusieurs hélices α. Les différentes hélices interagissent entre elles dans la bicouche pour former une seule entité . Nous ne présenterons pas ici les protéines transmembranaires organisées en feuillets β car la casse particulière de protéines transmembranaires sur laquelle nous allons nous focaliser, les canaux ioniques, ne sont que rarement constitués de feuillets β.
Les phospholipides et les protéines sont les constituants principaux des membranes biologiques, cependant celles-ci peuvent aussi contenir des sphingolipides ainsi que du cholestérol. Le cholestérol peut se trouver en quantités importantes (jusqu’à une molécule de cholestérol pour une molécule de phospholipide) dans les membranes plasmiques des cellules eucaryotes [4]. Par ailleurs, les membranes plasmiques contiennent aussi une part importante d’oligo ou de polysaccharides sur la face extracellulaire. Ces sucres sont associés à des protéines ou à des phospholipides, formant les glycoprotéines et les glycolipides, et jouent notamment le rôle de marqueur dans la reconnaissance cellulaire. Une autre spécificité des membranes plasmiques est qu’elles reposent sur le cytosquelette de la cellule, dont la zone périphérique, appelée zone corticale, est riche en filaments d’actine. Des protéines membranaires ancrent la membrane à ces filaments. Lors du processus d’endocytose, par exemple, cet ancrage permet que la membrane suive le cytosquelette et forme une vésicule qui entre vers l’intérieur de la cellule.
Transport membranaire
C’est la partie phospholipidique qui confère aux membranes biologiques leur caractère de barrière : le cœur de la bicouche lipidique étant hydrophobe, il laisse passer les molécules liposolubles telles que les stéroïdes ou le dioxygène . A l’inverse, les espèces chimiques fortement solubles dans l’eau telles que les ions ne diffusent que très lentement au travers d’une bicouche lipidique à cause de la barrière d’énergie à franchir lors du processus de désolvatation, processus nécessaire pour que l’ion quitte la solution aqueuse et passe au travers de la bicouche lipidique. Ainsi, beaucoup d’éléments nécessaires au métabolisme d’une cellule sont arrêtés par la bicouche lipidique. Pour les transporter à l’intérieur de la cellule ou des organites, il existe des protéines membranaires particulières appelées protéines de transport membranaire. Ces protéines peuvent être de deux types : canal ou transporteur. Les transporteurs possèdent un ou plusieurs sites présentant une affinité spécifique au soluté à transporter. Une modification de la conformation du transporteur entraîne le passage du soluté de l’autre côté de la membrane. Les canaux interagissent de manière plus faible avec le soluté. Ils forment un pore pouvant être ouvert ou fermé. Dans son état ouvert, ce pore laisse passer un ou plusieurs solutés de manière spécifique. Toutes les cellules contiennent par exemple des canaux ioniques, qui laissent passer un ou plusieurs ions de manière spécifique, et des aquaporines, qui augmentent la perméabilité des membranes vis-à-vis de l’eau. Nous reviendrons, dans le cas des canaux ioniques, sur l’origine de la spécificité des canaux vis-à-vis du soluté transporté.
En l’absence de protéine de transport, les molécules qui diffusent au travers de la bicouche lipidique le font dans le sens de leur gradient de concentration , c’est-à-dire qu’elles vont globalement depuis le côté de la membrane où elles sont présentes en plus forte concentration vers le côté de la membrane où elles sont présentes en plus faible concentration. On parle alors de transport passif. Un autre cas de transport passif est celui où un transporteur ou un canal facilite la diffusion du soluté au travers de la bicouche, diffusion se faisant là encore dans le sens du gradient de concentration du soluté. On parle alors de diffusion facilitée. A l’inverse, lorsque des protéines transportent le soluté dans le sens inverse de son gradient de concentration, on parle de transport actif. Ce transport actif ne peut être effectué que par les transporteurs et non par les canaux car il nécessite un changement de conformation de la protéine de transport : une des conformations présente une affinité relativement faible avec le soluté et l’autre une affinité plus forte. Cette différence d’affinité permet que le soluté soit « capturé » du côté de la membrane où il est présent en faible concentration et soit « expulsé » du côté où il est présent en forte concentration, entrainant ainsi son transport dans le sens inverse de son gradient de concentration. On appelle pompes les transporteurs effectuant un transport actif.
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre 1 : Etat de l’art
1. Introduction : des membranes biologiques à la caractérisation électrique de l’activité des canaux ioniques membranaires
1.1. Les membranes biologiques
1.2. Transport membranaire
1.3. Les canaux ioniques, description et enjeu biomédical
1.4. Caractérisation électrique des potentiels d’action et du courant ionique transmembranaire au sein de neurones d’animaux disséqués
1.4.1. Potentiel de membrane au repos
1.4.2. Potentiel d’action
1.4.3. Caractérisation électrique des potentiels d’action et ordres de grandeur
1.4.4. Caractérisation électrique du courant ionique transmembranaire à potentiel fixé, mise en évidence du mode d’activation des canaux voltage-dépendant
1.4.5. Conclusion
1.5. Méthode de « patch-clamp »
1.5.1. Enregistrements à l’échelle du canal unique
1.5.2. Enregistrements en configuration cellule entière
1.6. Etude pharmacologique à grande échelle des canaux ioniques au sein de cellules vivantes
1.7. Bilan, limites de l’étude des canaux ioniques au sein de cellules vivantes
2. Mesure électrique in vitro de l’activité de canaux ioniques au sein de bicouches biomimétiques
2.1. Présentation des bicouches biomimétiques
2.2. Reconstitution des canaux ioniques au sein de bicouches biomimétiques, rôle central des liposomes
2.3. Mesure de l’activité de canaux ioniques au sein de bicouches suspendues formées en utilisant un solvant organique
2.3.1. Utilisation d’une cloison de polymère : la bicouche suspendue « classique »
2.3.2. Description des sources de bruit dans un banc de mesure de l’activité de canaux ioniques au sein d’une bicouche suspendue
2.3.3. Diminution du niveau de bruit par une optimisation de la géométrie du dispositif, des matériaux utilisés et de la connectique
2.3.4. Amélioration de la longévité de la bicouche grâce à une réduction du diamètre et/ou une modification de la géométrie des pores
2.3.5. Dispositifs permettant la caractérisation simultanée par microscopie optique à haute résolution
2.3.6. Utilisation de dispositifs comprenant une interface fluidique
2.3.7. Bilan, conclusion sur les dispositifs permettant d’obtenir une bicouche suspendue en utilisant un solvant organique
2.4. Formation de bicouches suspendues intégrant directement des canaux ioniques, obtenues par rupture de liposomes
2.4.1. Formation d’une bicouche suspendue par rupture d’une GUV
2.4.2. Formation d’une bicouche suspendue par fusion et rupture de SUV et de LUV
3. Bilan et positionnement du projet
3.1. Bilan
3.2. Positionnement du projet
4. Références
Chapitre 2 : Fabrication et caractérisation morphologique des dispositifs
1. Introduction
2. Fabrication et caractérisation des nanopores et du nanocanal enfoui
2.1 Lithographie électronique des nanopores
2.2 Gravure ionique réactive des nanopores
2.3 Gravure humide de l’oxyde enfoui
2.4 Oxydation thermique
2.5 Conclusion
3. Fabrication des cellules microfluidiques
4. Assemblage du dispositif
5. Conclusion
6. Références
Chapitre 3 : Caractérisation électrique des dispositifs en milieu liquide
1. Modèle électrique
1.1. Résistance des microcanaux
1.2. Couplage capacitif entre le compartiment 1 et le compartiment 2
1.2.1. Couplage capacitif via le PDMS
1.2.2. Couplage capacitif via le substrat SOI pour une géométrie simplifiée
1.2.3. Couplage capacitif via le substrat SOI pour la géométrie réelle des microcanaux
1.2.4. Perspectives d’amélioration
1.3. Résistance de fuite
1.4. Résistance des nanopores et du nanocanal enfoui
1.4.1. Résistance associée au nanocanal Rnanocanal et Rinterpore
1.4.2. Résistance associée aux nanopores
1.4.3. Calcul de la résistance totale Rréseau
1.5. Calcul du saut de courant attendu lors du scellement des nanopores par des nanoparticules ou une bicouche suspendue
2. Validation du modèle
2.1. Matériel utilisé et montages
2.2. Mesure de la résistance des microcanaux fluidiques
2.3. Mesure du couplage capacitif entre les compartiments 1 et 2
2.3.1. Caractérisation de substrats SOI oxydés sans nanopores avec une cellule de PDMS à deux réservoirs et sans microcanaux
2.3.2. Caractérisation de dispositifs complets
2.4. Mesure de la résistance de fuite entre les compartiments 1 et 2
2.5. Mesure de la résistance Rréseau des nanopores et du nanocanal enfoui via une caractérisation I(V)
3. Conclusion
4. Références
Chapitre 4 : Etude du scellement des nanopores par des nanoparticules ou par une bicouche suspendue
1. Introduction
2. Expériences de scellement des nanopores par des nanoparticules
2.1. Description de l’expérience
2.1. Présentation des travaux
2.2. Discussion
2.3. Conclusion
3. Formation de bicouches lipidiques supportées et suspendues à partir de vésicules lipidiques
3.1. Introduction
3.2. Résumé du protocole de formation des liposomes
3.3. Caractérisation par FRAP de la formation d’une bicouche supportée sur des substrats SOI
3.3.1. Présentation de la méthode de FRAP
3.3.2. Dispositif expérimental dédié au FRAP
3.3.3. Observations préliminaires en microscopie par fluorescence, choix des conditions expérimentales
3.3.4. Résultats, discussion
3.3.5. Conclusion
3.4. Mesure électrique in situ du scellement des nanopores par une bicouche lipidique suspendue
3.4.1. Caractérisation de la résistance d’un dispositif avant et après incubation de liposomes
3.4.2. Mesure de la résistance de dispositifs simultanément à l’incubation d’une suspension de liposomes
Influence de la taille des nanopores
3.4.3. Mise en évidence d’une bicouche supportée suivant les parois de nanopores de diamètre nominal 107 nm
Conclusion
4. Bilan, difficultés expérimentales, perspectives
5. Références
Conclusion générale
