Dépistage des anticorps anti virus de l’hépatite C

Le virus de l’hépatite B

Le virus de l’hépatite B,qui fut identifié dans les années 1970, est un virus à ADN enveloppé, appartenant à la famille des Hepadnaviridae.
Les principaux modes de transmission du virus sont la voie sexuelle, la voie parentérale et la transmission de la mère à l’enfant
L’infection par le VHB peut évoluer sur un mode aigu ou chronique, le passage à la chronicité étant défini par lapersistance de l’antigène HBs pendant plus de six mois, ce qui survient dans 5 à 10% des cas [23]. L’infection peut s’exprimer de manière symptomatique ou asymptomatique : parmi les porteurs chroniques, un tiers sont des porteurs sains (avec des transaminases normales et une absence d’ADN viral circulant détectable) et deux tiers présentent une hépatite chronique, persistante ou active, caractérisée par une réplication virale importante.
Dans ce dernier groupe, l’incidence de la cirrhose est évaluée à 2% environ ; on estime à 6% le taux de malades atteints de cirrhose pouvant évoluer vers un carcinome hépatocellulaire [23].
L’antigène HBs est le marqueur sérologique le plus précocement détectable au cours de l’infection : 56 jours en moyenne après le contact infectant du virus avec l’organisme, avec un écart de 25 à 109 jours [23]. Il est suivi deux à trois semaines plus tard par l’apparition des anticorps anti-HBc qui persistent à long terme. Si l’infection est aigue, l’antigène HBs disparaît en un à trois mois, l’apparition d’un anticorps anti-HBs signant la guérison, et les transaminasesse normalisent. Si l’infection est chronique, l’antigène HBs persiste.
Le dépistage des donneurs de sang par la recherche de l’antigène HBs est systématique . Il s’effectue par un test Elisa de troisième génération, avec confirmation par un test de neutralisation.

Le virus de l’hépatite C

La découverte du virus de l’hépatite C (VHC), qui a été rapportée en 1989, a permis d’expliquer 80% à 90% des hépatites post-transfusionnelles non A-non B observées jusqu’alors . Le VHC est le premier virus transfusionnel majeur à avoir été identifié par technique de biologie moléculaire. Il s’agit d’un virus à ARN enveloppé, appartenant à la famille des flaviviridae. L’analyse des séquences nucléotidiques a permis une classification en 10 génotypes incluant 52 sous-types . Comme le VHB, le VHC est responsabled’hépatites aiguës, en général asymptomatiques, mais le passage à la chronicité survient dans 60% à 80% des cas [23]. L’incidence de la cirrhose serait, chez les porteurs chroniques, de 20% après dix années d’évolution ; celle du carcinome hépatocellulaire serait de 1% à 4% par année d’évolution d’une cirrhose [23]. Le mode principal de transmission du VHC est la voie parentérale : la transfusion sanguine est à ce jour reconnue responsable de près de40% des cas, etla toxicomanie intraveineuse de près de 20% des cas [23]. D’autres modes de transmission du VHC sont discutés dont le vecteur commun semble être lesang : transmission nosocomiale, contamination intrafamiliale, transmission sexuelle, transmission de la mère à l’enfant, ces deux dernières paraissant très faibles .
Le dépistage des donneurs de sang porteurs d’anticorps anti-VHC, obligatoire depuis 1990 en France, repose actuellement sur des tests Elisa de troisième génération. En cas de positivité, le test est confirmé par un test de type RIBA . Ce dépistage n’est pas encore réalisé dans tous les pays en Afrique, du fait de son coût élevé.

Les virus T-lymphotropes humains (HTLV-I et HTLV-II)

Ce sont des virus à ARN enveloppés, appartenant à lafamille des rétroviridaecomme le VIH . Ils sont responsables de deux pathologies distinctes : la leucémie ou lymphome T de l’adulte (ATL) de mauvais pronostic, et une neuromyélopathiedégénérative, la paraparésie spastique tropicale. Les modes de transmission sont l’allaitement, la voie sexuelle et la voie sanguine ( transfusion et toxicomanie). La transmission transfusionnelle n’a été observée qu’avec les produits cellulaires.

Autres virus transfusionnels

Plusieurs autres virus émergents ou réémergents peuvent avoir une réplication dans les cellules sanguines circulantes. C’est le cas du Parvovirus,de l’Epstein Barr Virus, du Cytomégalovirusetc. Ces virus sont pathogènes surtouts chez les sujets immunodéprimés. En dehors du CMV dont le dépistage permet de qualifier des unités de sang CMV négatifs destinés aux receveurs immunodéprimés, l’intérêt transfusionnel des autres virus reste discuté.

Les bactéries de l’environnement aérien ou de surface

Elles peuvent contaminer les produits sanguins à tous les stades de la chaîne transfusionnelle lors d’un dysfonctionnement se produisant lors d’une ouverture du circuit . Trois genres bactériens se trouvent impliqués en transfusion sanguine : Serratia, Enterobacter etPseudomonas .

Les bactéries présentes dans le flux sanguin circulatoire du donneur

Elles sont présentes soit à titre transitoire et en l’absence de tout symptôme (bactériémie post-prandiale ou après un brossage dentaire), soit à titre moins banal (bactériémie prolongée après soins dentaires ou bien une véritable septicémie) . Ce sont le plus souvent :
¾ Yersinia enterocolytica, Yersiniapseudotuberculosis, Listeria monocytogenes etBrucella ;
¾ Treponema pallidum, peut survivre 72 heures à 4°C dans un milieu citraté .

Les parasites transfusionnels

¾les plasmodiums, dont 4 espèces (P. falciparum, P. malaria, P. vivax, P. ovale); sont responsables d’une protozoose fébrileappelée paludisme. Ces parasites résistent à 4°C pendant aumoins trois semaines ;
¾ les leishmanies : responsables des leishmanioses ;
¾Trypanosoma cruzi, Babesia microti, Toxoplasma gondii. peuvent également être transmis par le sang.

LA SECURITE DES PRODUITS SANGUINS

La sécurité transfusionnelle est un concept débouchant sur des règles et des attitudes pratiques. Elle repose sur desbases concrètes etvariées, telles que : l’organisation des structures et des établissements de transfusion sanguine, l’hémovigilance, les bonnes pratiques transfusionnelles, la formation des acteurs de la transfusion sanguine et enfin le développement des activités de référence et de recherche. Ainsi la sécurité transfusionnelle a pour finalité, en évitant à priori et au maximum de nuire de quelle que façon que ce soit au receveur ; d’injecter un composant efficace selon un débit adapté aux nécessités immédiates de cedernier et de surveiller la perfusion afin de l’interrompre au moindre signe suspect.
C’est pourquoi un ensemble de mesures doivent être prises en compte allant de : la limitation des indicationstransfusionnelles, la sélection des donneurs de sang, le dépistage des marqueurs infectieux, à l’inactivation virale des produits issus du plasma.

Les limitations des indications transfusionnelles

Elle consiste à limiter la transfusion sanguine à un groupe de malades qui en ont réellement besoin, c’est-à-dire à un groupe de patients avec un risque patent de décompensation viscérale.
La limitation des indications transfusionnels permet de réduire les risques d’accidents transfusionnels : risques infectieux et risques immunologiques.

La sélection des donneurs

Les objectifs sont, d’une part, de protéger le donneur vis à vis des risques liés au prélèvement et , d’autre part, de protéger les receveurs vis à vis de risques liés à divers types d’agents transmissibles (virus, bactéries, parasites, agents transmissibles non conventionnels). Elle passe par plusieurs étapes :

Information pré don

Elle permet de donner au donneur de sang toutes les explications nécessaires sur le don desang, notamment les différentes étapes concernant l’inscription, le questionnaire médical, les prélèvements et les différents tests de dépistage qui seront réalisés. Le but de l’information pré don est de favoriser l’auto exclusion. Les associations de donneursde sang peuvent jouer un rôle importantdans ce volet.
Une auto exclusion bien comprise est un facteur de qualité du point de vue de la médecine transfusionnelle amenant le donneur à s’abstenir de venirà la prochaine collecte ou à une convocation pour un don. Ces informations doivent aborder les besoins en produits sanguins, leurs grandes indications et la nécessité impérative d’un entretien médical.

L’entretien médical

Au Sénégal cet entretien médical se fait par l’introduction d’un questionnaire spécifique pouvant permettre de réduire de manière considérable le risque transfusionnelpour le donneur (recherche de maladies chroniques, prise des constantes et examen clinique) et pour le receveur par la recherche de facteurs de risque de transmission de maladies. Cela doit amener le donneur à éviter de donner son sang s’il se trouve dans l’une des situations suivantes :
1. infection aiguë récente avec ou sans fièvre : prise d’antibiotique depuis moins de 8 jours, étatgrippal, gastro-entérite…,
2. intervention chirurgicale ou endoscopie depuis moins de 6 mois,
3. soins dentaires depuis moins de 8 jours,
4. situation à risque viral pour le receveur : prise de drogue par injection, nouveau partenaire sexuel sans protection depuis moins de 3 mois, plusieurs partenaires sexuels (2 et plus),relation sexuelle avec une prostituée, relations homosexuelles,
5. pour les femmes : grossesse jusqu’à 6 mois après l’accouchement, menstruations jusqu’à 8 jours après la date des dernières règles,
6. traitement pour une maladie sexuellement transmissible dans les 6 derniers mois,
7. lorsque la motivation du don est d’obtenir un test de dépistage. Le médecin peut vous indiquer où vous adresser (centres de dépistage volontaire et anonyme du VIH).
Cet entretien médical suivi d’examenclinique doit amener le médecin à déterminer la quantité à prélever.

Informations post don

Elles tendent à fidéliser les donneurs dans le but d’augmenter lafréquence annuelle de leur don dans les limites réglementaires (quatre pourles hommes et trois pour les femmes). Elles permettent aussi de faire comprendre aux donneurs qu’il n y a pas de risques liés aux prélèvements et que la quantité prélevée se reconstitue au bout de trois heures. Des informations post don bien comprises peuvent amener le donneur à devenir un relais envers la communauté. Ces informations post don peuvent aussi s’adresser aux candidats au don refusé après l’entretien médical et contribuer à éviter la diffusion d’informations incorrectes et négativesdans l’entourage du donneur.

Dépistage des marqueurs infectieux

Le dépistage des marqueurs biologiques permet la qualification biologique des dons de sang. Il exige des réactifs et un matériel adéquat qui doit faire l’objet d’un contrôle de qualité dont les modalités doivent êtredéfinies dans une procédure. Il comporte :
¾ le dépistage des anticorps anti VIH 1, 2 et 0 par technique Elisa et la confirmation des sera positifs par Western Blot ;
¾le dépistage de l’Ag HBs par technique Elisa. Dans certains pays, le dépistage de l’Ac anti HBc et le dosage des transaminases est également effectué ;
¾le dépistage des anticorps du virus de l’hépatite C par technique Elisa ;
¾ le dépistage dans certains pays des anticorps des virus HTLV 1 et 2 ;
¾ le dépistage de la syphilis par Technique RPR et TPHA.

Prévention des risques immunologiques

Le groupage sanguin dans le système ABO et la recherche de l’antigène D du système rhésus sont les tests les plus communément réalisés. Dans les pays développés, le phénotypage rhésus, consistant à rechercher les antigènes C, c, E et e est également réalisé.
D’autres mesures permettent d’assurer une meilleure prévention des risques immunologiques, il s’agit :
– du dépistage des anticorps irréguliers chez les receveurs,
– de l’épreuve de compatibilité au laboratoire entre la poche de sang et le receveur,
– du contrôle ultime au lit du malade.

Quels produits sanguins incriminer?

Ce sont l’ensemble des produits sanguins qui contiennent des hématies, même en faible quantité . Ainsi sontconcernés lesang total dans lequel les plasmodiums résistent à 4°C pendant plusieurs semaines, les concentrés de globules rouges, leplasma frais où peuvent persistent quelques hématies parasitées, les concentrés plaquettaires. En principe, le PFC et les fractions plasmatiques ne sont pas contagieux.

Diagnostic et traitement du paludisme post transfusionnel

Diagnostic

Le tableau clinique réalisé est celui del’accès de primoinvasion :
¾ L’incubation dure 10-15 jours selon le nombre de parasites inoculés et l’espèce en cause.
¾Le début est marqué par : une fièvre continue, des céphalées, un malaise général, des troubles digestifs à type de nausées, vomissements, dyspepsies à type d’épigastralgies.
¾L’évolution peut se faire vers des formes graves à type d’accès pernicieux liés à P. falciparumou bien favorable en quelques jours avec les autres espèces ; il n’y a pas de rechute car le parasitisme est purement sanguin sans formes tissulaires.
Le diagnostic repose sur la recherche du parasites par la goutte épaisse, le frottis sanguin ou par les autres techniques.

Traitement

Le traitement curatif

Repose sur l’utilisation de quinine base à raison de 25 mg/kg /jour pendant 6 à 7 jours, ou sur l’échange transfusionnel. Cette technique peut se faire soit par cytaphérèse, soit par méthode manuelle, et peut être utile en plus du traitementmédicamenteux, particulièrementlorsque la parasitémie est supérieure à 10% [4].

Le traitement préventif

¾ En zone d’endémie plusieurs procédés sont utilisés, ils reposent sur :
ƒ une sélection clinique des donneurs par un questionnaire (données de l’interrogatoire),
ƒ le dépistage du parasite par la GE (peu sensible et dépend de l’examinateur),
ƒ le traitement systématique du receveur (beaucoup de traitements inutiles) et.
ƒ l’expectative armée qui consiste à traiter dès l’apparition des premiers signes . ¾ En zone non endémique les procédés varient selon les pays. En France, il s’agit de l’exclusion définitive de tout donneur ayant eu le paludisme une fois dans sa vie, l’exclusion temporaire si le donneur est de retour d’un pays endémique dans les 4 mois, le dépistage des anticorps antipaludéens par technique d’immunofluorescence s’il est de retour d’un pays d’endémie entre 4 mois et 3 ans et si la sérologie est positive, le donneur est éliminé un an et réexaminé chaque année. Depuis 2004, l’observation d’un cas de PPT provenant d’un donneur de sang de retour d’un pays d’endémie après 4 ans [11] a conduit à réviser cette stratégie et à réaliser un dépistage systématique chez tout donneur ayant séjourné plus de trois mois en zone d’endémie, quelque soit sa date de retour.
L’inconvénient est que les données de l’interrogatoire ne sont pas toujours fiables et il y’a une faible valeur prédictive positive des tests sérologiques qui éliminent des donneurs qui ne sont pas parasités.

Polymérase Chain Réaction

Sa sensibilité et sa spécificité sontsupérieures à 90%. Il présente un intérêt en zone non endémique, présente une meilleure spécificité et permet donc une réduction de 42% des exclusions [41]. Un donneur de sang testé négatif par la microscopie, a présenté l’ADN parasitaire avec le PCR [50].

Dépistage de l’antigène du plasmodium par technique Elisa

Nous avons utilisé l’ELISA-Malaria antigen test des laboratoires Diamed (Suisse) qui utilise comme marqueur l’antigène pLDH du plasmodium.

Principe

¾c’est un test très sensible qui détecte par immunocapture un antigène du plasmodium,la Lactate Déshydrogénase (pLDH) qui est une enzyme secrétée par les plasmodiums qui infectent les hématies ;
¾ la phase solide est constituée par des Ac monoclonaux spécifiques de la pLDH incubée avec les contrôles et avec du sang total. La pLDH est capturée par les Ac fixés. Le surplus est éliminé après lavage ;
¾lors d’une seconde étape d’incubation la pLDH est fixée par un Ac anti-pLDH conjugué avec de la biotine ;
¾ après élimination de l’excès de conjugué par lavage, la biotine est détectée lors d’une troisième incubation par la streptavidine conjuguée à l’horseradish peroxydase (HRP). L’excès de HRP est éliminé par un dernier lavage ;
¾une incubation finale est faite avec le substrat constitué de Tetramethylbenzydyl(TMB) et du peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui colore les puits en bleue suivantla proportion d’antigènes pLDH fixée à la phase solide ;
¾la réaction enzymatique est arrêtée par addition d’une solution diluée d’acide sulfurique ;
¾ et la lecture de la densité optique est faite à 450 nm.

La procédure

¾placer le nombre désiré de puits sur la plaque et le reste non utilisé est remis entre 2 et 8°C ;
¾distribuer 100 µl de solution de lyse (chlorure d’ammonium) dans chaque puit ;
¾ajouter 50 µl de solutions de contrôle (positif et négatif) sur la première colonne et 50 µlde sang total dans le reste des puits ;
¾ incuber pendant 60 min à 37°C ;
¾ laver 5 fois avec la solution de lavage (le tampon de Phosphate) ;

Table des matières
INTRODUCTION 
PREMIERE PARTIE : REVUEDE LA LITTERATURE
I- Les agents infectieux transmis par le sang
I-1- Les virus transfusionnel
I-1-1- Les virus majeurs
I-1-1-1- Les virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et 2)
I-1-1-2- Le virus de l’hépatite B
I-1-1-3- Le virus de l’hépatite C
I-1-1-4- Les virus T-lymphotropes humains (HTLV-1 et 2)
I-1-2- Les autres virus transfusionnels
I-2- Les bactéries transfusionnelles
I-3- Les parasites transfusionnels
II- Sécurité des produits sanguins
II-1- Limitations des indications transfusionnelles
II-2- Sélection des donneurs de sang
II-2-1- Informations pré don
II-2-2- Entretien médical
II-2-3- Informations post don
II-3- Dépistage des marqueurs infectieux
II-4- Prévention des risques immunologiques
II-5- Inactivation virale des produits issus du plasma
III- Le paludisme post-transfusionnel
III-1- Données épidémiologiques
III-2- Quel donneur de sang est à haut risque ?
III-3- Quels produits sanguins incriminés ?
III-4- Diagnostic et traitement du paludisme post-transfusionnel
III-4-1- Diagnostic
III-4-2- Traitement
III-5- Les outils de dépistage
III-5-1- La goutte épaisseet le frottis sanguin
III-5-2- Dépistage des anticorps antipaludéens
III-5-3- Dépistage des antigènes paludéens
III-5-4- Polymerase Chain reaction (PCR)
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I- Matériel et méthodes
Objectifs de l’étude
I-1- Type et cadre de l’étude
I-2- Période de l’étude
I-3- Sélection médicale des donneurs de sang
I-4- Questionnaire du paludisme
I-5- Techniques
I-5-1- Prélèvements
I-5-2- La goutte épaisse et le frottis sanguin
I-5-3- Dépistage de l’antigène du Plasmodium par technique ELISA
I-5-4- Dépistage des anticorps du Plasmodium par technique ELISA
I-5-5- Dépistage des autres agents infectieux
I-6 Analyse statistique
II- Résultats
II-1- Lieu du don
II-2- Profil des donneurs
II-2-1- L’âge
II-2-2- Le sexe
II-2-3- Provenance du don
II-2-4- Type de donneur et motivation
II-3- Antécédents de paludisme
II-3-1- Avez-vous déjà fait un paludisme ?
II-3-2- Le nombre d’épisodes d’accès palustre dans les antécédents
II-3-3- Date du dernier épisode de paludisme
II-3-4- Expression clinique du dernier accès palustre
II-3-5- Traitement du dernier accès palustre
II-4- Prévalence des anticorps du Plasmodium
II-5- Prévalence des antigènes du Plasmodium
II-6- Résultats de la goutte épaisse et du frottis sanguin
II-7- Résultats des autres marqueurs infectieux
II-7-1- Dépistage des anticorps anti-VIH-1 et VIH-2
II-7-2- Dépistage de l’AgHBs
II-7-3- Dépistage des anticorps anti virus de l’hépatite C
II-7-4- Dépistage de la syphilis
II-8- Prévalence respective des différents marqueurs infectieux
II-9- Coinfection du paludisme et autres marqueurs infectieux
II-10- Facteurs de risque de transmission du paludisme
III- Discussion
III-1- Profil du donneur
III-2- Risques de transmission du paludismepar la transfusion sanguine au Sénégal
III-3- Faut-il dépister le paludisme sur le don de sang ?
III-4- Avec quel outil ?
III-5- Quelles stratégies pourla prévention du paludisme post transfusionnel
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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