Démarche de Conception de Ligands Inhibiteurs deMMP-24

Les Métalloprotéases Matricielles

Les Métalloprotéases Matricielles (MMP) sont des enzymes présentes au niveau de la matrice extracellulaire (MEC), et sont capables d’hydrolyser ou de réguler la totalité de ses composants protéiques.
Les rôles de la MEC sont multiples (maintien tissulaire, adhérence, migration et transport cellulaire, prolifération…), et par conséquent les implications physiologiques des MMP le sont tout autant. En effet, les MMP ont des rôles variés dans la modification de la MEC, et ce aussi bien au niveau physiologique (développement, morphogénèse, remodulation…) qu’au niveau pathologique (cancérogénèse, processus métastatiques, neurodégénération…). Elles sont également impliquées dans la maturation des facteurs solubles dela MEC tels que les cytokines, facteurs de croissance et chimiokines.
La preuve de l’existence d’une activité protéolytique de la MEC fut apportée par Gross et Lapiere en 1962 lors de la découverte du processus de régression de la queue des têtards, étape de leur métamorphose.
Il faut attendre 1977 pour que la première MMP humaine ne soit isolée à partir de cellules issues d’une tumeur de la peau par Bauer et. Al.

Nomenclature et classification des MMP

Selon la nomenclature de l’Enzyme Commission (EC) classiquement adoptée pour les enzymes e , les MMP sont numérotées 3.4.24, ceci classant les MMP dans la famille des hydrolases (3.), puis dans la sous-famille des peptidases (3.4), et enfin dans le sous-type des métallo-endopeptidases (3.4.24).
Il existe plus de 25 MMP différentes décrites chez l’homme, codées par des gènes différents et produites par de nombreux types cellulaires différents.
Elles se différencient alors, outre leur séquence peptidique, par le type cellulaire responsable de leur synthèse, leur spécificité d’action sur des substrats moléculaires matriciels différents et les modalités de leur régulation.
Un classement détaillé est disponible sur l’outil ExPASy – Expert Protein Analysis System (Artimo et al., 2012), site tenu par le Swiss Institute of Bioinformatics http://enzyme.expasy.org/enzymebyclass.html (consulté le 18/01/2018). Voir en Annexe n°1 : Nomenclature des Enzymes).

Structure des MMP

Les différentes MMP possèdent de nombreuses caractéristiques communes :
– Une structure homologue allant de 40 à 80% d’homologie en acides aminés ;
– Un atome de zinc dans le domaine catalytique de l’enzyme ;
– Une activité dépendante de la disponibilité du milieu en ions calcium Ca 2+;
– Une synthèse et une sécrétion sous forme de zymogènes (nommés « proMMP ») ;
– Une capacité à dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Les différentes enzymes peuvent cliver chacune au moins un composant de la MEC.
D’un point de vue structural strict, toutes les MMP possèdent au moins trois domaines : le prédomaine ou « peptide signal », le prodomaine et le domaine catalytique.
Le prédomaine est constitué d’une vingtaine de résidus hydrophobes. Il est nécessaire au transport intracellulaire des MMP jusqu’à la membrane cellulaire. Le prédomaine est rapidement éliminé après la sécrétion et est absent de la forme enzymatique active.
Le prodomaine est une séquence peptidique d’environ 80 acides aminés et comprenant notamment un résidu cystéine. Le groupement thiol de la cystéine, par son atome de soufre S, interagit avec le zinc Zn 2+ du site catalytique, maintenant ainsi l’activité enzymatique sous forme zymogène (ou latente).
Le clivage protéolytique du prodomaine, libérant ainsi l’atome de zinc du résidu cystéine, entraîne l’activation du site catalytique qui peut alors se lier à son substrat. On parle de « cystein switch ».
Le domaine catalytique, d’environ 170 acides aminés, est caractérisé par la présence d’un atome de zinc et celui-ci est maintenu par 3 résidus histidine. Cette liaison entre ces quatre partenaires est à la base d’une structure tridimensionnelle en forme de poche. Le site catalytique, commun à toutes les MMP, se présente alors comme une fissure peu profonde, séparant la MMP entre un sous-domaine « inférieur » et un sous-domaine « supérieur ».
La plupart des MMP ont un quatrième domaine en positioncarboxyterminale, liée au site catalytique par une charnière, chaîne polypeptidique hydrophobe dont la taille et la présence sont variables selon les MMP considérées. Le domaine C-terminal est homologue de la fibronectine et de l’hémopexine (on parle de l’« Hemopexine like domain »). C’est une chaîne polypeptidique de 210 résidus, stabilisé par un ion Calcium Ca 2+ . Il est impliqué dans la fonction de reconnaissance des substrats. Dans le cas des métalloprotéases matricielles transmembranaires (MT-MMP, membranetype matrix metalloproteinase), le domaine hémopexine est suivi soit d’un domaine transmembranaire hydrophobe (MT-1, 2, 3 et 5), soit d’un pont inositol phosphate (MT4 et 6), permettant l’ancrage de l’enzyme à la surface de la cellule (voir Figure 1)

Inhibition endogène des Métalloprotéases Matricielles

L’activité protéolytique des MMP est contrôlée précisément par leurs précurseurs et leurs inhibiteurs endogènes (α2-macroglobulines [au niveau sanguin] et inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases (TIMP)).
L’α2-macroglobuline (α2M) est une glycoprotéine plasmatique capable d’inhiber la plupart des métalloprotéases en les emprisonnant par complexation. Le complexe formé est ensuite éliminé par endocytose.
Les TIMP sont des protéines d’environ 190 AA. Les TIMP actuellement connus sont au nombre de 4 et ont une homologie de séquence de 40 à 50%.
Chacun des quatre TIMP est capable d’inhiber la totalité des MMP, et ce plus ou moins efficacement.
Leur inhibition des MMP procède de la formation de liaisons covalentes avec les résidus du site catalytique, bloquant ainsi l’accès des substrats à la poche contenant le zinc catalytique.
Le système MMP/TIMP est régulé finement afin d’avoir un contrôle performant de la synthèse/dégradation de la MEC. Lors d’états pathologiques, l’équilibre est rompu, aboutissant à un désordre potentiel de la MEC au niveau du tissu concerné. En effet, différents membres du système MMP/TIMP sont exprimés dans les cellules du système immunitaire et du cerveau, et leur dérégulation provoque ainsi de sévères désordres, notamment d’ordre neuroinflammatoire.

Inhibiteurs synthétiques des Métalloprotéases Matricielles

Les MMP étant présentes à différents niveaux et associées à des états pathologiques tels que les arthrites rhumatismales et ostéoarthrites, les ulcérations chroniques, les phénomènes d’invasion tumorale, les lésions athéromateuses et les mécanismes neurodégénératifs, il a déjà été développé des inhibiteurs pharmacologiques des MMP.
Les inhibiteurs synthétiques qui ont été développés ont vu leur approche de conception évoluer. En effet, les premiers inhibiteurs deMMP (MMPi) ont été conçus selon une approche de substrate-based drug design, alors que les derniers développés ont profité de l’amélioration des connaissances structurales sur les MMP pour être conçus selon une approche de structure-based drug design.*
Les premiers MMPi développés, de structure pseudo-peptidique, ont permis l’avènement de l’acide hydroxamique comme groupement chélateur du zinc (ou ZincBinding Group, ZBG) : Batimastat, Ilomastat, Marimastat (voir Figure 3). Ils se sont avérés fortement inhibiteurs de MMP mais dépourvus de sélectivité et soufrant d’une fragilité métabolique in vivo.
Pour pallier à cette fragilité in vivo, des programmes de recherche ont été lancés pour développer des MMPi non peptidiques conservant l’acide hydroxamique comme ZBG. Cette démarche a notamment mis en lumière des composés porteurs d’un groupement sulfamide servant à orienter le ZBG d’une part, et des substituants interagissant avec d’autres résidus du site catalytiqued’autre part, tel que l’exemple phare du composé CGS-27023A (voir Figure 3). Ce dernier s’est avéré être un MMPi à large spectre développé contre les pathologies cancéreuses mais qui s’est également  avéré avoir des effets secondaires marqués de troubles musculo-squelettiques.
Ainsi, de nombreux dérivés remplaçant l’acide hydroxamique par d’autres ZBG ont été conçus et développés, mais faisant toujours preuve de manque de sélectivité.
C’est pourquoi des programmes de développement de MMPi se sont intéressés à des molécules ne chélatant pas le zinc catalytique. Ceci a mené au succès du développement d’inhibiteurs de MMP-13, une MMP non transmembranaire impliquée dans des désordres articulaires type arthrite.
Cependant, il n’a, à ce jour, pas été mis en lumière des composés synthétiques capables d’inhibersélectivement d’autres MMP que la MMP-13.

Vieillissement et mémoire

Le vieillissement, d’un point de vue général, peut être défini comme des changements progressifs et irréversibles intervenant dans la structure et la fonction d’un organe ou d’un organisme entier et se produisant suite au passage du temps.
Face au vieillissement des populations et aux déficits, notamment cognitifs, que celui-ci entraîne, la recherche pour l’amélioration de la vie des personnes vieillissantes devient cruciale. Les démences sénilesreprésentent une préoccupation majeure de santé publique. La prévalence actuelle des démences séniles en Europe et aux Etats-Unis est estimée à 6-8% après 65 ans et l’incidence augmente considérablement avec l’âge, allant de 2,4 pour 1000 personnes-années (PA) entre 65 et 69 ans à plus de 50 pour 1000 PA après 85 ans.
Au niveau mondial, le nombre de personnes démentes est estimé à 46 millions et pourrait atteindre 131 millions.

Egalement Métallo-Protéase Matricielle TransMembranaire 5, MT5-MMP

Gene : MMP-24
Taille : 645 aa
Masse : 73 231 Da
Identifiant UniProt : Q9Y5R2
Identifiant ChEMBL (target) : CHEMBL5050
Implication dans la Maladie d’Alzheimer :
o Protéine douée d’une activité « η-sécrétase »
o Inhibition in vivo : amélioration de la cognition 2050. g
Le vieillissement, aussi bien normal que pathologique (démences séniles), est associé à une diminution des performances cognitives, avec notamment une réduction des capacités d’apprentissage et de mémoire. De nombreuses équipes de recherche tentent de trouver des solutions pharmacologiques pour diminuer les effets du vieillissement et notamment les effets des démences séniles sur la cognition. C’est un des objectifs du CERMN, Centre d’Etudes et de Recherche sur le Médicament de
Normandie, qui depuis plusieurs années conçoit, synthétise et évalue des ligands à visée thérapeutique et diagnostic dans la maladie d’Alzheimer.
La mémoire, anatomie et classification
La mémoire, outil de stockage d’informations apprises, est, selon les travaux de Tulving au début des années 80 catégorisée selon son aspect temporel :
● Mémoire sensorielle
○ Perceptive, immédiate (quelques secondes) ;
○ Concerne les informations liées aux 5 sens.
○ Anatomiquement, cette mémoire fonctionne de manière automatique : les événements d’intérêt sont encodés pour être traités par d’autres régions du cerveau alors que les informations non retenues disparaissent.
● Mémoire à court terme
○ Mémoire de travail (quelques minutes) ;
○ Des images et des sons reçoivent l’intention de l’individu et sont interprétés par celui-ci. Elle sert à la manipulation de l’information.
○ Anatomiquement, c’est le cortex préfrontal dorsolatéral qui permet de maintenir disponible les données nécessaires au raisonnement en cours, tout en coopérant avec d’autres aires corticales.

Traitements disponibles actuellement dans la Maladie d’Alzheimer Aujourd’hui, les thérapies proposées aux patients souffrant de la MA visent surtout à rétablir un taux basal d’acétylcholine (ACh) suite à la mort cellulaire des neurones cholinergiques, et ce en inhibant sa dégradation (inhibiteurs de l’acétylcholinestérase (AChE) : Donépézil ARICEPT ® , Galantamine REMINYL ® , Rivastigmine EXELON ® ) ou en favorisant indirectement le relargage d’ACh (antagoniste des récepteurs NMDA : Mémantine EBIXA ® ) (voir Tableau 1).
Ce sont des thérapies symptomatiques dont le service médical rendu (SMR) a été jugé insuffisant par la Commission de Transparence de la Haute Autorité de Santé (HAS) i et qui ne sont désormais plus prises en charge par la Solidarité Nationale en France.

Place de la Modélisation Moléculaire dans la Conception de Nouveaux Principes Actifs

Généralités sur la Conception de Nouveaux Médicaments

La conception de médicaments, ou drug design, est la démarche permettant d’entamer le processus de recherche, développement et commercialisation d’un médicament. Le drug design revient donc à la recherche et à la mise au point d’un nouveau principe actif d’intérêt thérapeutique. La démarche de drug design permet de disposer d’un candidat médicament présentant une première formulation galénique pour conduire sur celui-ci des essais précliniques et cliniques, étapes cruciales pour pouvoir, en cas de succès, procéder à une demande d’Autorisation de
Mise sur le Marché (AMM) auprès des autorités compétentes concernées et donc, pouvoir commercialiser un médicament. Au total, le délaiallant de la conception du médicament à sa commercialisation est en général d’une quinzaine d’années et le coût total de développement est de l’ordre du milliard de dollars.
Le drug design, conduit d’une façon propre à chaque laboratoire de recherche, passe par différentes étapes exposées ci-après.

Démarche générale de Drug Design

Le choix de la maladie à traiter, et a fortiori de la cible biologique à viser tient des capacités et des intérêts intellectuels et financiers du laboratoire entamant une démarche de drug design. La/les cible(s) retenue(s) doivent avoir fait preuve de leur drugabilité.
Une fois les limites du projet de Drug Design posées, les laboratoires de recherche procèdent alors à des tests des molécules enleur possession (pouvant être rassemblées en une chimiothèque), afin de disposer d’une première prédiction del’activité et de pouvoir orienter leurs moyens de recherche sur des familles moléculaires particulières. Les tests à leur disposition sont de natures et de coûts variés. Ainsi les tests peuvent être menés dans un premier temps in silico, in vitro voire in vivo. Les tests in silico, tributaires de la chémoinformatique, passent par l’utilisation de modèles moléculaires pour une évaluation virtuelle d’une liaison d’un ligand à une cible biologique. Cette discipline relèvede la modélisation moléculaire, et dont un détail se trouve ci après. Pour ce qui est des tests in vitro, leur utilisation passe par des tissus, cellules ou protéines isolées et ils permettent d’évaluer des paramètres d’inhibition, d’affinité, de cytotoxicité ou de toute autre activitémodélisable in vitro. Les tests in silico et in vitro peuvent être utilisés conjointement.
Ainsi des hypothèses émises sur des modèles informatiques pourront alors être confirmées ou infirmées par des résultats d’expérimentation in vitro. Si une hypothèse de liaison est confirmée par les tests in vitro, alors les tests in silico pourront être utilisés de façon isolée par la suite. L’avantage certain de cette utilisation conjointe in silico/in vitro est un gain de temps et d’argent considérable pour les laboratoires de recherche. En effet, les tests biologiques in vitro, bien que miniaturisables et automatisables, requièrent du personnel parfois en nombre avec des expertises propres à chaque test ainsi que du matériel dont le nombre et le coût dépendent des tests. Les tests in silico eux, permettent un grand nombre d’expérimentations sur un temps réduit, et dont les outils – ordinateurs, calculateurs et logiciels – sont réutilisables d’une expérimentation à une autre. Les tests préliminaires in vivo sont utilisés en derniers recours, tant les réglementations légales et éthiques et leur mise en œuvre est complexe et coûteuse. Ces tests préliminaires permettront de disposer d’un hit moléculaire, qui servira alors de point de départ pour une démarche d’optimisation.
Pour passer du hit moléculaire au lead moléculaire, il faut faire du hit une molécule capable de présenter une bonne activité in vitro, c’est-à-dire améliorer les paramètres pharmacodynamiques du hit. Pour cela, il faut disposer d’études de Relation Structure-Activité (RSA), qui permettent de justifier de la présence ou de l’absence d’éléments structuraux en regard d’une activité ou d’une toxicité. Les RSA permettent de guider les pharmacomodulations à mener sur le hit afin de conduire à un lead moléculaire.
Enfin, optimiser un lead moléculaire revient à améliorer ses paramètres pharmacocinétiques pour conserver son activité après passage de l’in vitro à l’in vivo.
Cela consiste alors à moduler la molécule non plus enregard de son activité mais en regard du comportement que l’on souhaite lui attribuer en milieu biologique. Cela revient ainsi à moduler sa polarité, sa perméabilité, sa résistance métabolique…
Une fois le candidat-médicament obtenu, alors celui-ci devra succéder aux essais précliniques et aux essais cliniques afin de prétendre à une demande d’AMM

Table des matières
Liste des abréviations utilisées 
Index des Figures 
Index des tableaux 
Introduction 
Partie I Métalloprotéases Matricielles et Maladie d’Alzheimer
Glossaire des termes techniques employés dans la Partie I
Les Métalloprotéases Matricielles
Nomenclature et classification des MMP
Structure des MMP
Mécanisme catalytique des MMP
Inhibition de l’activité des Métalloprotéases matricielles
Implication des MMP dans les maladies neurodégénératives
Vieillissement et mémoire
La mémoire, anatomie et classification
La Maladie d’Alzheimer
Conclusion et Perspectives de la Partie I
Partie II Place de la Modélisation Moléculaire dans la Conception de Nouveaux Principes Actifs
Glossaire des termes techniques employés dans la Partie II
Généralités sur la Conception de Nouveaux Médicaments
Démarche générale de Drug Design
Implication de la Chémoinformatique dans la Conceptionde Nouveaux Médicaments
La Chémoinformatique, une discipline récente en évolution
Principes appliqués en Modélisation Moléculaire
Méthodologie en Modélisation Moléculaire
Contexte de la Conception de Ligands Inhibiteurs de MMP-24 au Centre d’Etudes et de Recherche sur le Médicament de Normandie
Conclusion et Perspectives de la Partie II
Partie III Démarche de Conception de Ligands Inhibiteurs deMMP-24
Glossaire des termes techniques employés dans la Partie III
Projet “Inhibition de MMP-24” entrepris au CERMN
Etude structurale du site catalytique de MMP-24
Etude des hypothèses de liaison au site catalytique
Méthodologie
Résultats
Limites des expérimentations menées
Hypothèses de liaison Ligand-Cible
Sélectivités des ligands pour MT5-MMP en regard de MT1-MMP
Etudes de Relations Structure-Activité
Conclusion et Perspectives de la Partie III
Conclusion 
Annexes 
Annexe n° 1 : Nomenclature des Enzymes
Annexe n° 2 : Liste des MMP identifiées à ce jour
Annexe n° 3 : Rôles des MMP dans les maladies neurodégénératives
Annexe n°4 : Mini Mental State Examination
Annexe n° 5 : Voies de signalisation liées à la Maladie d’Alzheimer
Annexe n° 6 : Recommandations Vidal pour la prise en charge de la Maladie d’Alzheimer
Annexe n° 7 : Test de l’évaluation in vitro de l’activité inhibitrice de MT5-MMP et MT1-MMP des composés synthétisés au CERMN
Annexe n°8 : Les Zinc Binding Groups (ZBG) les plus fréquemment retrouvés
Annexe n°9 : Choix d’une conformation de MT5-MMP et MT1-MMP
Annexe n°10 : Poster
Bibliographie

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